Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Проблема межвидовой контаминации клеточных культур 13
1.2. Традиционные методы определения видовой принадлежности клеток в культуре 19
1.2.1. Изоферментный анализ клеточных культур 21
1.2.2. Кариологический анализ 25
1.2.2.1. Закономерности изменения кариотипа клеток длительно- культивируемых in vitro 27
1.3. Молекулярно-генетические методы видовой идентификации 32
1.3.1. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ)... 32
1.3.2. ПЦР с использованием произвольных праймеров 34
1.3.3. Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов 36
1.3.4. ПЦР-ПДРФ анализ 37
1.3.5. Видоспецифичная ПЦР 39
1.3.6. Секвенирование маркерных последовательностей 43
Глава 2. Собственные исследования 46
2.1. Материалы и методы исследования 46
2.1.1 Материалы 46
2.1.1.1. Реактивы, препараты и оборудование 46
2.1.1.2. Клеточные культуры 47
2.1.1.3. Образцы тканей 49
2.2.1. Методы 49
2.2.1.1. Культивирование и криоконсервация клеточных культур 49
2.2.1.2. Кариологический анализ клеточных культур 51
2.2.1.2.1. Приготовление кариологических препаратов 51
2.2.1.2.2. Рутинная окраска препаратов 52
2.2.1.2.3. Окраска на G-полосы 52
2.2.1.2.4. Анализ хромосомных препаратов 53
2.2.1.3. Молекулярно-генетический анализ видовой принадлежности клеточных культур 54
2.2.1.3.1. Выделение ДНК 54
2.2.1.3.2. Определение нуклеотидной последовательности участков мтДНК 57
2.2.1.3.3. Видоспецифичная ПНР 59
2.2.1.3.4. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле 61
Глава 3. Результаты исследований 62
3.1. Кариологический анализ клеточных культур 62
3.1.1. Клетки линии К562 промиелоцентарного лейкоза человека 63
3.1.2. Клетки почки кролика, линия RK-13 65
3.1.3. Соматический гибрид свиных клеток, линия А4ХС2 67
3.1.4. Соматический гибрид клеток свиньи и лошади, линия A4XL 70
3.1.5. Клетки кожи лошади, линия ЭКЛ 72
3.1.6. Клетки почки коровы, линия MDBK 75
3.1.7. Клетки легкого коровы, линия ЛЭК 77
3.1.8. Клетки почки собаки, линия MDCK 80
3.2. Оценка изменчивости и информативности участков генов cytb и COI в клеточных культурах 81
3.3. Разработка методики определения видовой принадлежности культур клеток на основе в ПЦР-РВ 85
3.3.1. Выбор диагностической мишени, конструирование видоспецифичных праймеров и зондов 85
3.3.2. Первичная оценка сконструированных олигонуклеотидов и оптимизация условий проведения вП ЦР-РВ 91
3.3.3. Разработка и оптимизация мультиплексной вПЦР-РВ 93
3.3.3. Изучение чувствительности разработанной вПЦР-РВ 97
3.3.4. Изучение специфичности разработанной вПЦР-РВ 102
3.4. Видовая идентификация культур клеток с использованием вПЦР-РВ и анализа нуклеотидных последовательностей участков генов cytb и COL 105
Обсуждение результатов исследований 111
Выводы 125
Практические предложения 127
Список литературы 128
Приложение 150
- Проблема межвидовой контаминации клеточных культур
- Клеточные культуры
- Клетки линии К562 промиелоцентарного лейкоза человека
Введение к работе
Культуры клеток получили широкое распространение и применение в самых разнообразных областях экспериментальной биологии и медицины для изучения и решения кардинальных проблем общей и частной вирусологии, онкологии, биохимии, биотехнологии и т.д. Чистота и точная характеристика используемой модели, которой во многих случаях служат постоянные клеточные культуры, являются абсолютно необходимым условием работы и требуют их надежной идентификации. Разработка методов идентификации клеточных культур предполагает определение и изучение стабильных клеточных признаков.
Проблема идентификации клеток в культуре стала очевидной еще в 50-60-е годы XX века, когда при анализе хромосомных наборов и видоспецифических антигенов ряда клеточных линий человека и животных были выявлены случаи межвидовой клеточной контаминации. В большинстве случаев контаминация происходила клетками HeLa и L (Gartler, 1968).
Для решения данной проблемы разработан ряд методов, основанных на кариологическом анализе, изучении полиморфизма изоферментов и иммунологическом исследовании клеточных культур (Nelson-Rees et al., 1974; O'Brien et al., 1980; Stulberg et al., 1976). С использованием предложенных подходов было показано широкое распространение явления межвидовой и внутривидовой клеточной контаминации во многих лабораториях (Drexler et al., 1999; Freshney, 2008; Mowles and Doyle, 1990; Novokhatskii et al, 1980; Rojas et al., 2008; Stacey, 2000; Stacey et al., 1991).
Однако длительность проведения анализа и необходимость глубоких профессиональных навыков при исследовании кариотипа и спектра изоферментов клеточной линии делают эти методы анализа трудоемкими и сложными для интерпретации. Невозможность стандартизации этапов
анализа и последующего сравнения результатов между лабораториями затрудняет их применение в повседневной практике.
В последнее десятилетие широкое распространение получили молекулярно-генетические методы идентификации биологических объектов. Наиболее известным и эффективным стал метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принцип ПЦР основан на многократном умножении исследуемой части генома с последующей детекцией продукта с использованием различных методик. Время анализа снижается до одного дня, а эффективность превосходит традиционные методы идентификации клеток в культуре.
Существует ряд аналитических систем для видовой идентификации биологического материала на основе ПЦР. Но их высокая стоимость и узкий спектр идентифицируемых видов животных являются существенным препятствием для широкого применения в области сертификации клеточных культур. В связи с этим становится актуальным и необходимым разрабатывать новые и адаптировать уже имеющиеся методики определения видовой принадлежности длительно-перевиваемых клеточных культур.
Цель и задачи исследования.
Целью работы являлось совершенствование методов определения видовой принадлежности клеточных культур.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Оценить стабильность и информативность участков генов цитохрома b (cytb) и субъединицы I цитохром-с-оксидазы (COI) митохондриальной ДНК (мтДНК) клеточных культур с целью последующего использования их в качестве основной мишени в видоспецифичной ПЦР.
Сконструировать видоспецифичные олигонуклеотидные праймеры и зонды к нуклеотидным последовательностям генов cytb и COI для
идентификации видов животных, клеточные культуры от которых наиболее распространены в специализированных коллекциях.
На основе сконструированных праймеров и зондов разработать методику видоспецифичной ПЦР в реальном времени (вПЦР-РВ) с использованием мультиплексного формата реакции. Оценить специфичность и чувствительность разработанной вПЦР-РВ.
Провести цитогенетический анализ клеточных культур разного видового происхождения и сравнить с данными молекулярно-генетического анализа.
С помощью вПЦР-РВ и секвенирования участков генов cytb и COI провести видовую идентификацию клеточных культур в специализированных коллекциях клеточных культур.
Научная новизна
Впервые разработана методика на основе ПЦР в режиме реального времени для идентификации 13-ти видов млекопитающих, клеточные культуры от которых наиболее распространены в различных специализированных коллекциях и научно-исследовательских институтах.
Адаптирована методика на основе секвенирования участков генов цитохрома b (cytb) и субъединицы I цитохром-с-оксидазы (COI) митохондриальной ДНК (мтДНК) для паспортизации и сертификации культур клеток, полученных от экзотических видов животных.
Впервые методами вПЦР-РВ проведен анализ видовой принадлежности 52-х клеточных культур полученных от 20-ти различных видов животных, депонированных в двух специализированных коллекциях: «Коллекция перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных» Всероссийского НИИ экспериментальной
ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН и «Коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных» НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.
Практическая значимость работы
Методика вПЦР-РВ предложена в качестве наиболее эффективного подхода для периодического контроля клеточных культур на предмет соответствия исходной видовой принадлежности и возможной контаминации клетками другого вида.
Высокая аналитическая чувствительность, специфичность и универсальность по отношению к анализируемому материалу позволяет расширить область применения и использовать данную методику для видовой идентификации широкого спектра биологических объектов.
Дополнительное использование подхода на основе секвенирования участков мтДНК при помощи универсальных праймеров, позволяет значительно расширить спектр идентифицируемых видов животных.
Основные положения, выносимые на защиту
Стабильность и сохранение информативности участков генов cytb и COI мтДНК в условиях длительного культивирования in vitro и использования их в целях видовой идентификации клеточных культур.
Разработка методики видовой идентификации клеточных культур с использованием ПНР с детекцией продукта амплификации в режиме реального времени.
Сравнительная оценка результатов кариологического анализа и вПЦР-РВ.
4. Использование вПЦР-РВ и секвенирования участков мтДНК для мониторинга и скрининга на видовую принадлежность клеточных культур, полученных от разных видов животных.
Апробация
Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии» (Дубровицы, 2008 г.); Школе-конференции молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, октябрь 2008 г.); Секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, 2008; 12-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2008 г.); межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2009 г.).
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы
Диссертационная работа изложена на 150 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 14 таблицами, 32 рисунками. Список литературы включает 190 публикаций, в том числе 162 иностранных.
Личный вклад соискателя
Представленная диссертационная работа является результатом собственных научных исследований автора.
Культивирование клеточных культур и их цитогенетический анализ выполнялись на базе Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН, отдел клеточной биотехнологии, зав. отделом д.б.н., профессор Л.П. Дьяконов. Разработка и апробация методики вПЦР-РВ и секвенирования выполнялась на базе лаборатории механизма гибели
опухолевых клеток ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, зав. лабораторией д.м.н., А.А. Штиль.
Автор выражает благодарность за участие в выполнении отдельных фрагментов диссертации сотрудникам ВИЭВ РАСХН: к.б.н. Т.В. Гальнбек, к.б.н. Е.А. Завьяловой, к.б.н. Н.Ф. Ломакиной; сотрудникам ВИЖ РАСХН: д.б.н. П.М. Кленовицкому; к.б.н. Гладырь Е.А.; сотрудникам НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН: д.м.н. А.А. Штилю, д.б.н. Г.М. Волгаревой, к.б.н. О.Ю. Сусовой; сотрудникам НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН: д.б.н. Подчерняевой Р.Я., Гринкевич О.М..
Проблема межвидовой контаминации клеточных культур
В конце 50-х годов в литературе появилось множество сообщений о новых штаммах клеток, полученных из органов и тканей лабораторных грызунов, КРС, свиньи, приматов. Были получены и линии клеток человека, в том числе и существующие поныне: KB (Eagle, 1955), Chang-liver (Chang, 1954; Moore et al., 1956), HEp-2 (Moore et al., 1955), серия линий Detroit (Berman and Stulberg, 1956).
Получение некоторых постоянных клеточных линий, описываемых в 50-е годы, связано со своеобразными превращениями, суть которых заключается во внезапном появлении в культивируемой популяции фокусов клеток, резко отличающихся от исходных по морфологии и характеру роста. Эти клетки в силу большей жизнеспособности и высокой скорости роста быстро размножались, через несколько пассажей полностью замещали родительскую популяцию и давали начало так называемой «бессмертной» постоянной линии. В 50-х годах этот процесс рассматривали как «трансформацию» клеток in vitro и считали необходимым условием стабилизации клеточной культуры (Deinhardt and Henle, 1957).
Привлекал, однако, внимание однотипный характер превращений во всех случаях: независимо от видового происхождения клеточной культуры внезапно появляющиеся в ней клетки по морфологии, характеру и скорости роста были неотличимы от клеток L и HeLa. Сходство проявлялось также в биохимических свойствах (Laslie и др., 1956; Moore, 1957), в характере роста в губке (Leighton et al., 1957). Такие изменения наблюдали Parker (1955,1958) и Parker и др. (1957), культивируя серии клеток мышей, кроликов, обезьян и человека; Westwood и др. (1957) и Westwood и Titmus (1957) в клеточных культурах кролика и обезьяны; Drew (1957) в клетках кролика.
Исследование чувствительности клеточных линий к вирусам выявило еще одну особенность: линии, полученные из клеток человека и обезьяны, но оказавшиеся весьма сходными с линией L, утрачивали чувствительность к вирусу полиомиелита, специфичную для клеток человека и приматов. Напротив, морфологическое сходство с HeLa совпадало с приобретением этого свойства клетками иного видового происхождения (Parker, Л957; Deinhardt, Henle, 1957; Drew, 1957; Sheffild, Churcher, 1957; Swim, Parker, 1957). Возникновение наследуемых признаков, столь резко отличающих «трансформированные» клетки от исходных и определяющих удивительное сходство клеток различного видового и тканевого происхождения, побудило исследовать хромосомный аппарат этих клеток. Rothfels и др. (1958) провели подробный цитогенетический анализ 16 клеточных линий, полученных Parker и др. (1957) в результате «трансформации» из нормальных клеток почки обезьяны, почки мыши, костного мозга человека. Все линии внешне были идентичны линии L. Было показано, что кариотип их резко отличается от соответствующих нормальных клеток, но очень сходен с кариотипом линии L, судя по преобладающему числу акроцентрических хромосом. Указание на происхождение этих линий было получено с помощью трансплантационного теста. Как известно, клетки L вызывают опухоли у мышей СЗН, из фибробластов которых эта линия была получена. Оказалось, что и остальные, «новые», линии, сходные с L, будучи трансплантированы мышам этим штаммом, давали опухоли с той же частотой.
Эти же авторы изучили хромосомную конституцию четырех «трансформированных» линий клеток человека, кролика, обезьяны, полученных Salk и др. (1957) и Westwood и др. (1957). Внешнему сходству этих линий с линией HeLa соответствовало и сходство их кариотипов.
Одновременно и независимо (Coriell et al., 1958) в поисках различий между злокачественными и нормальными клетками исследовали антигенную структуру 8 клеточных линий, 6 из которых получены из нормальных и злокачественных тканей человека (в их числе HeLa), одна — из клеток обезьяны и одна - из клеток кролика. Оказалось, что все клеточные линии имеют общие антигены в отличие от соответствующих нормальных клеток. Наиболее вероятным объяснением авторы считали контаминацию всех линий клетками какого-либо одного происхождения, скорее всего HeLa.
Клеточные культуры
Объектом исследования являлись 52 клеточные культуры и их отвивки, которые были представлены 48-ю наименованиями от 20-ти различных видов животных. Из них 29 клеточных культур из «Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных» (СХЖРАСН) Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН, руководитель коллекции проф. Дьяконов Л.П., 23 клеточные культуры любезно предоставлены руководителем «Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных» д.б.н., проф. Подчерняевой Р.Я. Клеточные культуры К562, НСТ-116 и CV любезно предоставлены д.м.н. А.А. Штилем (НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН). Видовая принадлежность по паспортным данным культуры клеток была представлена следующими наименованиями: Homo sapiens (человек), Cercopithecus aethiops (африканская зеленая мартышка), Macacus mulatta (макак резус), Sus scrofa (свинья), Bos taurus (корова), Ovis aries (овца), Saiga tatarica (сайга) Canis familiaris (собака), Felis catus (кошка), Equus caballus (лошадь), Oryctolagus cuniculus (кролик), Cricetus gricetus (китайский хомяк), Mesocricetus auratus (золотистый хомяк), Mus musculus (мышь), Rattus norvegicus (серая крыса), Acipenser transmontanus (белый осётр), Cyprinus carpio (карп), Oncorhynchus tshawytscha (чавыча), Oncorhynchus keta (кета), Oncorhynchus mykiss (радужная форель). Всего 20 видов животных.
Клетки линии К562 промиелоцентарного лейкоза человека
В исследованной околотриплоидной клеточной культуре число хромосом варьирует в широких пределах от 30 до 140 на клетку. Стволовая линия представленная клетками с 64-69 хромосомами составила порядка 50% (рис.2).
Анализ рутинно окрашенных хромосом культуры клеток К562 позволил выделить группы хромосом характерных для вида Homo sapiens (рис. 4). Группа А включает хромосомы 1-3. Первая пара хромосом является самой большой в кариотипе человека. По морфологии — это метацентрические хромосомы. Вторая пара хромосом - самые большие субметацентрики в кариотипе человека. Хромосома 3 является крупным метацентриком, который на 20% меньше первой хромосомы.
Группа В включает хромосомы 4 и 5 - это большие субметацентрические хромосомы. Группа С - самая большая по числу хромосом. К ней относятся средние по размеру субметацентрические хромосомы (с 6 по 12 пары хромосом). Группа хромосом D - 3 пары больших акроцентрических хромосом, имеющих вторичную перетяжку (13 - 15 пары хромосом). К группе Е относятся три пары небольших субметацентрических хромосом (16 - 18 хромосомы). Две пары маленьких метацентрических хромосом (19 и 20) отнесены в группу F. Последняя группа аутосомных хромосом - группа G - самые маленькие в кариотипе хромосомы -акроцентрики 21 и 22.
