Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ О КУЛЬТИВИРОВАНИИ МИКРООРГАНИЗМОВ И ПОДБОР ДЛЯ ЭТИХ ЦЕЛЕЙ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД 8
1.1.1. Методы культивирования различных микроорганизмов 8
1.1.2. Рецепты и изготовление сред для культивирования микроорганизмов 17
1.1.3. Оптимизация питательных сред 29
1.2. Значение защитных сред для сохранения жизнеспособности бактерий, стабилизации и сроков хранения 38
1.2.1. Значение воды для жизнедеятельности бактерий и её роль при сублимационной сушке 39
1.2.2. Анабиоз бактерий и его роль при
сублимационной сушке живых бактерий 4 0
1.2.3. Роль защитных сред при сублимационной сушке живых бактерий 42
1.2.3.1. Характеристика и значение защитных сред... 4 5
1.2.3.2. Основные условия хранения живых сухих биопрепаратов 53
1.3. Регидратация микробных клеток и её значение 57
1.3.1. Разбавители сухих живых вакцин и их состав. . 5 9
1.3.2. Условия и механизм реактивации микроорганизмов собственные исследования 62
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 65
2.1. Материалы исследований 65
2.2. Методы исследований
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 76
3.1 .Изыскание стимуляторов роста в процессе лабораторного и промышленного культивирования микроорганизмов 16
3.1.1. Общая характеристика «рисового» гриба и продуктов его метаболизма 77
3.1.2. Общая характеристика «чайного» гриба и современные технологии использования продуктов его метаболизма как стимуляторов роста микроорганизмов .... 85
3.2. Модификация защитных сред для микроорганизмов при сублимации и внедрении в технологический процесс 93
3.2.1. Модификация защитной среды для приготовления сухих вакцин против сальмонеллезов сельскохозяйственных животных 95
3.2.2 Модификация защитной среды для изготовления сухой вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных 98
3 . 2 . 3.Совершенствование защитной среды для изготовления пробиотика «Биобактон»104
3.3. Совершенствование разбавителей для сухих биопрепаратов из живых микроорганизмов 109
3.3.1. Совершенствование разбавителей для
грамотрицательных бактерий в сухих живых вакіщнах.... 112
3.3.2. Совершенствование разбавителей для грамположительных бактерий в сухих живых вакцинах ... 119
3.3.3. Совершенствование разбавителей для пробиотика «Биобактон» 123
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 125
ВЫВОДЫ 135
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 136
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 137
- Методы культивирования различных микроорганизмов
- Материалы исследований
- .Изыскание стимуляторов роста в процессе лабораторного и промышленного культивирования микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность темы. В системе специфических мероприятий в борьбе с инфекционными болезнями важным является применение профилактических и лечебных препаратов (вакцин, пробиотиков и других). Из бактериальных препаратов для профилактики и лечения инфекционных заболеваний обычно используют вакцины и пробиотики.
По мнению ряда ученых наиболее предпочтительными является использование живых вакцин из аттенуированных штаммов микроорганизмов, так как они обеспечивают более прочный, напряженный и продолжительный гуморальный и клеточный иммунитет (И.К. Тутов, В. И. Ситьков, 1997; В.И. Заерко, В.И. Ситьков, И.К. Тутов, 1999; И.К. Тутов, В.И. Заерко, 2002). Как правило, живые вакцины применяют однократно.
Пробиотики также представляют собой биопрепараты из живых, полезных для человека и животных, бактерий. Они обладают лечебными свойствами, вытесняют из желудочно-кишечного тракта нежелательную микрофлору и обеспечивают коррекцию иммунного ответа организма (В.В. Субботин, 1999; Д.А. Дервишов, 2000; Е.С. Воронин, A.M. Петров, М.М. Серых, Д.А. Дервишов, 2002).
Живые вакцины и пробиотики чаще всего выпускают в сухом виде. Они имеют больший срок хранения по сравнению с жидкими препаратами. В виду малых объемов таро-мест, транспортировка их более экономична .
При всех указанных достоинствах живых сухих бактериальных биопрепаратов остается ряд не решенных проблемных вопросов. Это, прежде всего, увеличение биомассы жизнеспособных микробных клеток в процессе культивирования производственных штаммов микроорганизмов, сохранение наибольшего количества живых бактерий в процессе подготовки и проведения сублимационной сушки препаратов. Не меньшей проблемой является сохранение наибольшего количества жизнеспособных микробных клеток при регидратации и реактивации вакцин и пробиотиков перед их применением.
Решение указанных вопросов связано с подбором наиболее оптимальных питательных сред при культивировании производственных штаммов микроорганизмов, с использованием различных стимуляторов роста, изысканием наиболее подходящих защитных сред для сублимационной сушки препаратов и применением физиологически оптимальных разбавителей сухих биопрепаратов.
Цель и задачи исследований. Целью исследований было изыскание способов наилучшего сохранения жизнеспособности вакцинных и про-биотических штаммов микроорганизмов на всех технологических этапах приготовления биопрепаратов.
Для реализации указанной цели перед нами были поставлены следующие задачи:
Изыскать наиболее оптимальные варианты приготовления стимуляторов роста микроорганизмов, обеспечивающих в процессе их культивирования наибольшее накопление их биомассы и количества живых микробных клеток.
Модифицировать производственную рецептуру защитных сред, обеспечивающих наименьшие потери микроорганизмов при сублимационной сушке биопрепаратов на примере вакцин против сальмо-неллеза, листериоза сельскохозяйственных животных и пробиоти-ка «Биобактон».
Разработать физиологически оптимальный состав разбавителей, обеспечивающих сохранение живых микробных клеток при регидра-тации сухих вакцин и пробиотиков: для грамотрицательных бактерий (сальмонелл и пастерелл); для грамположительных бактерий (листерий, эризипелотрик-сов, лактобактерий);
4. Дать научную и практическую оценку результатов исследований способов сохранения жизнеспособности производственных штаммов микроорганизмов на всех этапах производства и применения су хих живых вакцин и пробиотика «Биобактон».
Научная новизна рабооы. Нами установлено, что продукты метаболизма естественной ассоциации микроорганизмов (на примере «чайного» гриба) является мощным стимулятором роста микроорганизмов (СРМ ТС-1). Впервые доказано, что добавление 1% СРМ ТС-1, изготовленного методом стерилизующей фильтрации, обеспечивает увеличение накопления биомассы микроорганизмов и количество живых микробных клеток в питательных средах при глубинном культивировании на 28,5%, чем добавление стимулятора роста микроорганизмов, подвергнутого жесткой стерилизации.
Защитная среда, изготовленная на основе 0,9%-ов хлорида натрия, обеспечивает сохранение большего количества живых листерий уже на стадии гомогенизации на 15%, а затем, при их сублимационной сушке - на 39,9%. Введение в состав защитной среды для листерий 1% СРМ ТС-1 повышает их резистентность к процессам лиофилизации на 20,4%.
Нами предложены разбавители сухих живых вакцин против сальмо- неллеза, пастереллеза, рожи, листериоза животных и пробиотика «Биобактон» на основе фосфатно-буферной смеси физиологически оптимальных для микроорганизмов растворов хлорида натрия с включением в них 8-10% мясопептонного бульона. В сравнении с традиционными разбавителями при применении опытных их вариантов наблюдается повышение в сравнении с контролем сохраняемости живых сальмонелл на - 17,7%, пастерелл на - 1,9%, листерий на - 17,3%, лактобактерий на - 77%.
Теоретическая и практическая значимость результатов исследований заключается в том, что при конструировании питательных сред для культивирования производственных штаммов микроорганизмов, а также при приготовлении защитных сред для сублимационной сушки биопрепаратов и приготовлении разбавителей сухих живых вакцин и пробиотиков мы принимали во внимание физиологические свойства микроорганизмов . Предложенные нами способы сохранения вакцинных и пробиотических штаммов микроорганизмов обеспечивают наибольший выход живых микробных клеток и общий объем биомассы по сравнению с контролями.
Применение при культивировании микроорганизмов стимулятора роста ТС-1, приготовленного методом стерилизующей фильтрации, позволило увеличить выход общей биомассы микроорганизмов (на примере листерий на - 32,7%).
Использование физиологически оптимальных разбавителей сухих живых вакцин повышает количество живых микробных клеток после разведения вакцин на 14-20%. Это обеспечивает значительное повышение иммуногенной активности препарата.
Включение в состав защитной среды для листерий 0,9% хлорида натрия обеспечивает сохранение при сублимационной сушке на 39,9% микробов больше, чем при применении производственных защитных сред. Это позволяет получить годовой экономический эффект на сумму 954228 рублей (на примере ФГУП «Ставропольская биофабрика»).
Результаты наших исследований используются при промышленном производстве биопрепаратов на ФГУП «Ставропольская биофабрика».
Кроме того, результаты наших исследований используются в учебном процессе при изучении курсов «Ветеринарная микробиология и иммунология», «Биотехнология ветеринарных препаратов» в Ставропольском государственном аграрном университете.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с болезнями сельскохозяйственных животных» (Ставрополь, 1999); Международной научной конферен- ции «Достижения ветеринарной медицины - XXI веку» АГАУ (Барнаул, 2002) ; региональной конференции «Перспективы внедрения современных биотехнологических разработок для повышения эффективности сельскохозяйственного производства» (Краснодар,2000); Всероссийских конференциях, посвященных достижениям биотехнологии (Ставрополь, 1999, 2001); на ежегодных научно-практических конференциях Ставропольской ГСХА (1997-2002 гг.).
Публикации Основные материалы исследований по теме диссертационной работы освещены в девяти научных статьях.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, методов и результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, включающий 191 источник, в том числе иностранных 30. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 7 рисунками.
На защиту выносятся следукітіие основные положения:
Совершенствование технологии изготовления и применения стимуляторов роста микроорганизмов, обеспечивающих повышение выхода общей биомассы и количества живых бактерий на стадии культивирования производственных штаммов микроорганизмов;
Включение в состав защитных сред для микроорганизмов хлорида натрия в физиологически оптимальных концентрациях, способствующих сохранению большого количества живых микроорганизмов в биомассе, как на стадии ее гомогенизации, так и на стадии сублимационной сушки;
Предложенные нами разбавители сухих живых вакцин и пробиотиков обеспечивают лучшую регидратацию и реактивацию микробных клеток, повышение сохраняемости живых микробных клеток на стадии разбавления биопрепаратов.
Методы культивирования различных микроорганизмов
Началом исследований по культивированию микроорганизмов является 1830 год, когда Кань яр де Латур, Кютцинг и Шван установили, что возбудителями многих бродильных процессов являются дрожжи и других микроорганизмы. Либих и многие другие химики были противниками такого мнения, и это затормозило соответствующие исследования на 20 лет. Признанный во всем мире основоположник микробиологии Луи Пастер, изучая физиологию дрожжей и бактерий впервые установил и научно обосновал в 1850 году, что спиртовое, молочно -, уксусно -, масляно-кислые брожения вызываются различными микроорганизмами. Он ввел асептические методы исследований и предположил, что микроорганизмы обладают различными потребностями, как в питательных веществах, так и в кислороде (цитируется по S. На первых порах микробиологических исследований для производства вакцин культивирование микроорганизмов осуществлялось в пробирках или колбах путем выращивания их на поверхности плотных или в жидких средах. В настоящее время в этих целях используют ферментеры. В промышленном или крупномасштабном производстве биологических препаратов они являются наиболее важным звеном технологического процесса, позволяющим осуществить промышленное использование большого объёма питательных сред для культивирования различных микроорганизмов в современном крупномасштабном производстве биопрепаратов.
При производстве бактериальных препаратов в настоящее время широкое распространение получил метод периодического процесса культивирования микроорганизмов. При внедрении этого метода важное значение имеет выбор фазы роста микробной культуры и дозы посевного материала. Экспоненциальный посевной материал обеспечивает почти полное отсутствие лаг-фазы, а уменьшение его дозы увеличивает длительность экспоненциальной фазы, что для промышленного способа культивирования является не эффективным.
Периодической называют такую систему культивирования микробов, когда хотя бы один из компонентов питательной среды, или она вся, не может ни поступать в систему, ни покидать её. В такой системе скорость роста микроорганизмов должна после ускорения стремиться к нулю из-за недостатка субстрата, или из-за гибели микробных клеток вследствие накопления ими продуктов метаболизма. Следовательно, периодические культуры микроорганизмов находятся в неустойчивом состоянии (С. Дрю, 1983; И. К. Тутов, В.И. Сить-ков, 1997; P. Hemert, 1974; И.А.. Басканьян, 1981, 1992; Vrana D. et all, 1982; И.И.Байтман, 1984; М.Я. Ярцев, 1991, 2000; В.И. Заерко, 1998).
Г. П. Сомов, И.А. Веленева, Л.С. Бузолева и другие (1997) установили, что листерии при периодическом культивировании способны расти при сравнительно низких температурах на обогащенных питательных средах, тогда как при температуре 37 С они быстро погибают.
Л.М. Стрельникова, В.М. Поляченко, М.Н. Грубер, В.М. Боровкина (1995) доказали, что бактерии Haemophilus influenzae выращенные при периодическом глубинном культивировании в питательной среде на основе аминопептида, гидролизата казеина средней степени расщепления и экстракта кормовых дрожжей, могут быть успешно использованы в качестве антигена при получении агглютинирующих сывороток.
М.Я. Ярцев, И.А. Басканьян, А.А. Раевский, Е.П. Са-пегина и другие (1993) разработали, испытали и предложили для внедрения технологию изготовления сухой живой вакцины против рожи свиней штамма ВР - 2. Она основана на оптимальных условиях периодического культивирования эризепе-лотриксов в мясной среде на основе гидролизата Хоттингера и в среде из не пищевого сырья - гидролизата панкреотиче-ского гидролизата биомассы бактерий.
Материалы исследований
Микробные штаммы. В работе использовались производственные штаммы микроорганизмов Salmonella typhimurium, штамм 3; S. dublin, штамм 6; S. choleraesuis, штамм 9; Pasterella multocida, штаммы 656 и 796; Erysopelotrix insidiosa, штамм ВР-2; Listeria monocytogenes, штамм "АУФ", Lactobacterium acidophilus, ассоциации микроорганизмов культуральной жидкости « чайного» и «рисового» грибов.
Питательные среды: мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МП7А), бульон и агар Хоттингера, обезжиренное молоко, мясопептонно-печеночныи бульон, мясопептонная желатина, сахарозо-желатиновые среды высушивания, мясопептонный кровяной агар, мясопептонный агар с добавлением 1% глюкозы, мясопептонно-печеночныи агар, кипяченая водопроводная и дистиллированная вода, среды со стимуляторами роста микроорганизмов ТС-1 и с культуральной жидкостью «рисового гриба», агар Сабуро, сусло-агар и другие компоненты.
Лабораторная посуда. Пробирки стеклянные, флаконы вместимостью 0,1, 0,2, 0,5 л, колбы емкостью 0,5, 1,0 л, цилиндры мерные, пипетки мерные стеклянные 0,1-50,0 мл, пипетки пастеровские, чашки Петри стеклянные, стеклянные флаконы, стекла предметные и покровные, стеклянные бутыли вместимостью 20 литров.
Расччюры и реактивы. Оптимальные физиологические растворы (рН 7,2) для теполокровных животных и микробов, ксилол, 3%-ная перекись водорода, фуксин основной, генцианвиолет, фуксин Пфеиффера, раствор Люголя, спирт этиловый, масло иммерсионное, раствор глюкозы, пептон, желатина, тиомочевина, едкий натр, концентрированная соляная кислота, хлорид натрия, сахаро-желатиновая смесь.
Лабораторное и производственное оборудование: микроскоп «Виолам», центрифуги Т-24, Т-25, Т-51, MPW-340; аминолизатор AAA Т 339 «Микротехна» Прага ЧССР; весы торсионные, термостат ТС-80 М 2; лупа, оптические стандарты мутности с концентрацией 0,25, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 млрд. микробных клеток в 1 мл, изготовленные ГИСК им. Та-расевича, аппараты лиофильной сушки ЛЗ-45, В-5000, холодильники производственные и бытовые, автоклавы, шкафы сухожаровые КВС G-100/250, фильтрующие элементы, реакторы (ферментеры) марки Х-18Н-9Т, шуттель-аппарат, ФЭК и др.
Биопрепараты: вакцины: против сальмонеллеза свиней, против сальмонеллеза водоплавающей птицы, против сальмонеллеза телят, бивалентная против сальмонеллеза молодняка животных, против рожи свиней, против пастереллеза водоплавающей птицы, пробиотик «Биобак-тон».
.Изыскание стимуляторов роста в процессе лабораторного и промышленного культивирования микроорганизмов
Научное латинское название «чайного гриба» - Medusomyces Gisevi. Это название гриб получил за свое сходство с медузой. В дальнейшем было установлено, что тело гриба представляет собой не только его мицелий, но и скопление [зооглея) уксуснокислых бактерий, которые представляют симбиоз этих двух сожительствующих микроорганизмов определяющих характерную плотность и консистенцию. «Чайный гриб» продуцирует особое вещество, по составу напоминающее крахмал или клетчатку. В результате такого полезного сожительства гриба и бактерий образуется гигантская колония «чайного гриба», толстая, хрящевато-слизистая, расслаивающаяся, сверху гладкая, снизу - лохмато-бахромчатая, грязно-белого цвета. Она сравнительно легко может быть разделена в поперечном или горизонтальном направлении на несколько кусочков, каждый из которых в сладком чае снова довольно быстро разрастается по всему периметру сосуда. Компонентом этого сложного сожительства являются дрожжеподобные грибы, чаще из рода Torulopsis и Mycoderma, а реже из рода настоящих дрожжей Sacharomyces.
Известно, что дрожжи «чайного» гриба своими сахаролитическими ферментами сбраживают растворенный в воде сахар с образованием спирта и углекислого газа, а содержащие в нем уксуснокислые бактерии превращают определённую часть спирта в уксусную кислоту. В результате культуральная жидкость гриба, состоящая из 10%-ного раствора сахара и 1%-ного экстракта чая) приобретает приятный кисло-сладкий вкус, напоминающий газированный напиток. В нем сохраняются основные компоненты чая (кофеин, танин, витамины Bi, С, Р и др.), содержатся небольшое количество спирта, углекислого газа, сахара, уксусной кислоты, а также вещества, подавляющие развитие ряда микроорганизмов .
Опытным путём (М.Н. Веревкина, 2000) установлено, что культу ральная жидкость природной ассоциации микроорганизмов «чайного» гриба обладает ростостимулируюшим эффектом по отношению к сальмонеллам, пастереллам, листериям, эризипелотриксам, актинобациллам (лигниереллам) . Определены его оптимальные дозы для наилучшего культивировании этих микроорганизмов. Доказана взаимосвязь между ростом и развитием микроорганизмов "чайного" гриба и увеличением содержания в его культуральной жидкости углеродсодержащих органических соединений (этанола, органических кислот, сахара, целлюлозы, аминокислот). Доказано, что культуральная жидкость «чайного» гриба является дешевым и высоко эффективным стимулятором роста многих микроорганизмов, и получила название СРМ ТС-1 (И.К. Тутов, В.И. Ситьков, 1996).
Добавление определенного количества СРМ ТС-1 к основным питательным средам приводит к увеличению накопления общей биологической массы культивируемых микробов на 22-48%, увеличению количества живых микробных клеток на 11-35%, а также обеспечивает наибольшую выживаемость микробных клеток после лиофильнои сушки. При этом, не только сохраняются, но и повышаются антигенные и иммуно-генные свойства перечисленных микроорганизмов (Э.В. Олиферова, 2000) .
И.К. Тутов и В. И. Ситьков (1997) считают, что СРМ ТС-1 обеспечивает повышение резистентности листерий к накопившимся продуктам метаболизма, о чем свидетельствует более позднее начало фазы отмирания данного микроорганизма. Кроме того, листерий, выращенные в средах со СРМ ТС-1, становятся более резистентными к процессам сублимационной сушки, так как выживаемость их при такой сушке значительно повышается. При промышленном производстве живых вакцин это очень важно, так как это представляет значительный резерв увеличения выпуска продукции и повышения её качества.
