Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Трансгенные животные 10
1.2. Методы получения трансгенных животных 10
1.2.1. Микроинъекция 11
1.2.2. Ретровирусные векторы 12
1.2.3. Эмбриональные стволовые клетки 13
1.2.4. Спермин и липосомы 14
1.2.5. Перенос ядер 15
1.2.6. Перенос генов с помощью искусственных хромосом (YAC,BAC) 16
1.3. Применение трансгенных животных 17
1.3.1. Трансгенные животные с новыми хозяйственно-полезными свойствами 17
1.3.2. Создание трансгенных животных устойчивых к
различным заболеваниям 19
1.3.3. Создание животных биореакторов для синтеза рекомби-нантных белков фармакологического и технологического назначения 20
1.3.4. Ксенотрансплантация 22
1.3.4.1. Проблемы при ксенотрансплантации 24
1.3.4.2. Экспериментальные наработки в ксенотрансплантации 29
1.3.4.3. Создание генетически модифицированных доноров 30
1.3.4.4. Исследования в области ксенотрансплантации 41
1.3.4.4.1. Экспрессия в культуре клеток 41
1.3.4.4.2. Создание трансгенных мышей 41
1.3.4.4.3. Создание трансгенных свиней 43
1.4. Негативное действие трансгенов 45
2. Материалы и методика исследований 49
2.1. Реактивы и оборудование 49
2.2. Схема исследований 50
2.3. Молекулярно-генетический анализ 52
2.4. Цитогенетические исследования 53
2.5. Гистологические исследования 55
2.6. Культивирование клеток трансгенных кроликов 57
3. Результаты и обсуждение 58
3.1. Ведение трансгенной линии и изучение наследования трансгена 58
3.2. Влияние наличия трансгена на некоторые физиологические показатели животного 62
3.3. Цитогенетические исследования 65
3.3.1. Описание нормального кариотипа кролика 65
3.3.2. Изучение влияния экзогена на стабильность кариотипа трансгенных кроликов 68
3.4. Гистологические исследования печени, почек, селезенки
и сердца 75
3.5. Исследование влияния экспрессии трансгена на реакцию
отторжения на модели in vitro 82
4. Выводы 90
5. Практические предложения 92
6. Список литературы 93
7. Список сокращений 124
- Трансгенные животные
- Реактивы и оборудование
- Ведение трансгенной линии и изучение наследования трансгена
Введение к работе
Одним из путей решения ряда прикладных задач в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве является создание генетически модифицированных (трансгенных) животных. После получения первых трансгенных сельскохозяйственных животных в 1985 году [Brem et al, 1985, Hammer et al, 1985] был достигнут значительный прогресс в области трансгенеза, проявившийся как в разработке новых более эффективных способов получения трансгенных организмов, так и в создании качественно новых генных конструкций, обеспечивающих высокие уровни экспрессии трансгенов в организме животных, независимо от участка их встраивания в геном.
Основным лимитирующим фактором практического использования трансгенных сельскохозяйственных животных является наблюдаемая в большинстве случаев относительно низкая экспрессия трансгенов, а также повышенный отход среди трансгенных особей.
Значительное влияние на экспрессию генных конструкций размером до 15 т.п.о., полученных с использованием стандартных векторов, оказывает участок интеграции трансгена в геном (позиционный эффект) [Wilson et al, 1990, Sippel et al, 1997]. В этом случае экспрессия трансгенов в организме животных зависит от последовательностей, прилегающих к участку интеграции, что является причиной большой вариабельности уровня экспрессии. Кроме того, ограниченные знания регуляторных последовательностей большинства генов приводят к использованию зачастую полностью не охарактеризованных геномных фрагментов, что и является причиной низкой эффективности экспрессии в экспериментах по переносу генов [Palmiter, Brinster, 1986].
Для того чтобы преодолеть позиционный эффект и таким образом увеличить вероятность оптимальной экспрессии трансгенов, интегрированных в случайной локализации, был применен целый ряд различных стратегий, од-
ной из которых является включение в генные конструкции, по возможности, всех регуляторных элементов, ответственных за его экспрессию.
Стандартные плазмидные, космидные или фаговые векторы в большинстве случаев не могут быть использованы для этой цели вследствие их ограниченной емкости. Для реализации данной стратегии нашли применение так называемые искусственные хромосомы, обладающие повышенной клонирующей способностью.
Наиболее широкое применение для получения трансгенных животных нашли векторные системы на основе искусственных хромосом дрожжей -YAC [Montoliu et al, 1993, Forget et al, 1993, Jakobovits, 1994, Peterson, 1997, Peterson et al, 1997, Camper, Saunders, 2000]. YAC способны к стабильному сохранению геномных фрагментов ДНК длиной более 1 миллиона п.о. [Burke etal, 1987].
В настоящее время опубликовано лишь несколько работ об успешном создании YAC-трансгенных сельскохозяйственных животных. Были получены трансгенные свиньи [Yanoutsos et al, 1995], кролики [Brem et al, 1996, Rouy et al, 1998] и крысы [Fujiwara et al, 1997, 1999], при этом эффективность трансгенеза была сопоставимой с результатами, достигнутыми на мышах.
У сельскохозяйственных животных использование векторов на основе YAC рассматривается, главным образом, в двух направлениях: направленная экспрессия рекомбинантных белков в молоко трансгенных животных и ксе-нотрансплантация.
С помощью ксенотрансплантации можно получить неограниченное количество донорского материала. Для этого необходимо лишь, чтобы пересаженные органы животных не отторгались, т.е. максимально приблизить на молекулярном уровне к человеку. Это может быть достигнуто с помощью трансгенеза посредством внесения дополнительной генетической информа-
ции в геном животного или, наоборот, выключения некоторых генов животных.
Вместе с тем, следует отметить, что после многочисленных экспериментов, проводимых во многих лабораториях во всем мире, исходное представление о трансгенезе, как о процессе, сводящемся только к появлению у генетически трансформированных особей нового признака, контролируемого внесенным геном, значительно усложнились. Оказалось, что интеграция чужеродного генетического материала не является процессом индифферентным по отношению к состоянию генома реципиента [Кленовицкий и др., 1999]. При обследовании трансгенных животных обнаружено, что микроинъекции чужеродной ДНК обуславливают дестабилизацию генома потомства [Кленовицкий и др., 1998, Медведев, 1992, Вгет, 1993, Constantini et al, 1989, Gasaryan et al., 1987].
В ряде исследований было показано, что интеграция чужеродной ДНК может сопровождаться мутагенным эффектом. Негативной стороной транс-генеза является повышенная эмбриональная и постнатальная смертность, а также пониженная жизнеспособность животных. Часть особей бывают стерильными. Введение чужеродной ДНК может приводить к хромосомным аберрациям [Завада, 1994, Кленовицкий и др., 1994, Мапоп et al, 1988, Marx, 1985].
Успешное использование трансгенных животных в практике, в том числе и в области ксенотрансплантации, предусматривает наряду с наличием экспрессии биологически функциональных трансгенных белков, необходимость стабильного наследования трансгена в ряде поколений, а также возможность длительного ведения трансгенной линии без снижения жизнеспособности трансгенных индивидуумов. Риск отрицательного влияния интеграции трансгена на организм животных возрастает при интеграции в геном животных фрагментов ДНК большой длины (несколько сот тысяч пар осно-
ваний), что стало возможным благодаря использованию технологии искусственных хромосом.
Таким образом, актуальной задачей сельскохозяйственной биотехнологии как в фундаментальном, так и в прикладном аспекте, является исследование влияния интеграции трансгена на различных уровнях организации индивидуумов (генетическом, цитологическом, тканевом, организменном). В рамках решения проблемы ксенотрансплантации актуальным является проведение исследований влияния экспрессии трансгена на реакцию отторжения на модели in vitro.
Цели и задачи исследования.
Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось исследование биологических особенностей кроликов, трансгенных по генам кластера регуляторов активации комплемента RCA, на различных уровнях организации индивидуумов
Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
Получить три поколения трансгенных кроликов, несущих генную конструкцию RCA YAC, при разных типах спаривания и изучить наследование трансгена.
Изучить некоторые физиологические показатели трансгенных кроликов (размер гнезда, падеж).
Получить препараты хромосом трансгенных кроликов и их аналогов и выявить частоту встречаемости хромосомных аномалий.
Исследовать влияние трансгена на структуру органов и тканей трансгенных кроликов.
5. Изучить влияние экспрессии трансгена на поддержание клеток
трансгенного происхождения в культуре in vitro.
Научная новизна.
Впервые изучено влияние интеграции фрагмента ДНК размером несколько сот тысяч пар оснований, полученного на основе искусственных хромосом дрожжей (YAC), на трансгенные индивидуумы на различных уровнях их организации (генетическом, цитологическом, тканевом, организ-менном). Впервые выполнено исследование культур клеток трансгенных кроликов, несущих гены-ингибиторы комплемента генного кластера RCA, на устойчивость к лизису сывороткой крови человека.
Практическая значимость работы.
Показано, что наличие интеграции генной конструкции RCA на основе YAC не оказывало существенного влияния на жизнедеятельность трансгенных кроликов, что позволяет рассматривать этих животных в качестве функциональной модели для изучения проблемы ксенотрансплантации. Установлена повышенная устойчивость клеток трансгенных кроликов к лизису сывороткой крови человека, что позволяет рассматривать гены-ингибиторы комплемента генного кластера RCA как гены-кандидаты для генетической модификации животных с целью использования их в клеточной терапии.
Основные положения, выносимые на защиту.
На уровень хромосомных аномалий у трансгенных животных оказывают влияние как наличие трансгена, так и происхождение животного.
При исследовании гистологической структуры печени, почек, селезенки и сердца кроликов, трансгенных по генам-ингибиторам комплемента кластера RCA, существенных различий по сравнению с контрольными животными выявлено не было.
При спаривании по типу трансген х трансген наблюдается снижение жизнеспособности потомков по сравнению со спариванием по типу трансген х нетрансген.
4. Интеграция генов генного кластера RCA повышает устойчивость клеток трансгенного происхождения к лизису сывороткой крови человека по сравнению с контрольными культурами.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены
на международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», ВИЖ, п. Дубровицы, 2001;
на конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, п. Дубровицы, 2001;
на международной научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», РАМЖ, Московская обл., Подольский р-н, п. Быково, 2002;
на международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, п. Дубровицы, 2002;
на международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, п. Дубровицы, 2003.
Публикация результатов исследований.
По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 124 страницах, содержит 10 таблиц, 19 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 281 источник, в том числе 242 на иностранных языках.
Трансгенные животные
При получении трансгенных организмов стремятся к тому, чтобы трансген содержался во всех соматических и, прежде всего, в половых клетках животного. В связи с этим наиболее целесообразно производить операции по переносу генов на ранних стадиях развития животного, в большинстве случаев, на стадии зиготы или двухклеточных эмбрионов.
Для транспорта генов используется целый ряд методов, основными из которых являются:
- микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы;
- транспорт ДНК с использованием ретровирусных векторов;
- пересадка ядер, трансфецированных геном;
- использование сперматозоидов в качестве вектора экзогенного ДНК.
Наиболее распространенным на сегодня методом получения трансгенных животных является микроинъекция ДНК. Впервые трансгенные животные получены данным методом в 1980 г. (мыши) [Gordon et ah, 1980], хотя первые попытки были уже в 60-х годах прошлого столетия [Lin, 1966]. Суть метода микроинъекции заключается во введении раствора генных конструкций в мужской пронуклеус зигот. Получение трансгенных животных этим методом можно разделить на шесть этапов:
1. Клонирование генных конструкций и приготовление раствора ДНК для микроинъекции.
2. Подготовка доноров и извлечение эмбрионов.
3. Визуализация пронуклеусов и микроинъекция ДНК.
4.Пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы синхронизиро ванных реципиентов.
5. Доказательство интеграции трансгена у родившихся потомков.
6. Получение трансгенных потомков с использованием методов традиционного животноводства.
Для микроинъекции необходим устойчивый стол, на котором устанавливают инвертированный микроскоп, два микроманипулятора для управления удерживающей и инъекционной пипетками и прибор для регулирования инъекционного давления. На столике микроскопа устанавливают инъекционную камеру со средой, покрытой парафиновым маслом. Эмбрионы помещают в среду и фиксируют их посредством пониженного давления на удерживающей пипетке так, чтобы инъецируемый пронуклеус был хорошо виден. Кончик инъекционной пипетки наполняют раствором ДНК и пипетку вводят в пронуклеус через прозрачную оболочку и клеточную мембрану и затем инъецируют 1-2 пкл раствора ДНК. Об успешном выполнении микроинъекции судят по увеличению объема пронуклеуса в 1,5-2 раза. После инъекции эмбрионы освобождают от удерживающей пипетки и культивируют до момента пересадки реципиентам [Брем и др., 1993, Шевелуха и др., 1998, Kinoshita et ah, 1985].
Реактивы и оборудование
Реактивы
1. Этилендиамидтетрауксусная кислота (ЭДТА)
2. Трисгидроксиметиламинометан (Трис)
3. Соляная кислота (НС1)
4. Хлорид натрия (NaCl)
5. Додецилсульфат натрия (SDS)
6. Протеиназа К
7. Перхлорат натрия
8. Хлороформ
9. Изоамиловый спирт
10. Смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ)
11. Tag-полимераза
12. Праймеры DAF3/5
13. Бромид димидия
14. Агароза
15. Краситель для ПЦР
16. Среда Игла
17. Коллагеназа
18. Трипсин
19. Ледяная уксусная кислота
20. Дистиллированная вода
21. Гепарин
22. Среда RPMI1640
23. Конкавалин А
24. Антибиотик (пенициллин, стрептомицин, гентамицин)
25. Бромистый этидий
26. Колхицин
27. Хлорид калия (КС1)
28. Метиловый спирт
29. Краситель Романовского-Гимза на фосфатном буфере (рН 6,8)
30. Этиловый спирт
31. Парафин
32. Эфир
33. Толуол (ксилол)
34. Краситель гематоксилин-эозин
Оборудование
1. Амплификатор Cyclotemp
2. Водяная баня
3. Бидистиллятор
4. Прибор для горизонтального электрофореза
5. Термостат
6. Центрифуга для пробирок типа Eppendorf
7. Центрифуга
8. Микротом
9. Микроскоп
2.2. Схема исследования
Исследования проводили по схеме представленной на рисунке
Выделение ДНК проводилось из кусочков ткани (выщипы из ушей) перхлоратным методом [Гладырь и др., 2001].
Для доказательства трансгенности использовали метод ПЦР. Состав
реакции представлен в таблице 1.
Таблица 1. Состав реакции использовавшийся в эксперименте.
Раствор исследуемой ДНК
Праймер DAF3
Праймер DAF5
ПЦР-буфер дНТФ
Taq-полимераза
Н26 бидист.
15 мМ Mg в 10-х буфере
1 мкл
0,5 мкл
0,5 мкл
2,0 мкл
2,0 мкл
0,2
13,8 мкл (до 20 мкл)
Для выполнения ПЦР использовали два синтетических олигонуклео-тидных праймера DAF3 и DAF5, которые были комплементарны двум различным цепям специфического фрагмента ДНК и имели следующую последовательность:
DAF3 - TGA AGG САА GTT AGT ТТТ GGT G
DAF5 - САА АСА GCC ТТА TAT САС ТСА G Для проведения реакции использовался амплификатор Циклотемп. Режимы реакции представлены в таблице 2.
После завершения реакции продукты ПЦР разделяли путем электрофореза в 2% агарозном геле в ТАЕ-буфере в качестве электрофорезного буфера. При приготовлении геля в раствор агарозы добавляли димидиум бромид (20 мг/мл) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл в качестве красителя.
Продукты амплификации визуализировали с помощью камеры и компьютерной программы Biotest.
Цитогентические исследования
Для получения препаратов хромосом использовались лимфоциты периферической крови. Для этого брали кровь в количестве 2 мл из ушной вены в стерильный одноразовый шприц, смоченный гепарином.
При приготовлении культуральной среды брали среду RPMI 1640, исходя из расчета 8 мл на образец. Среду для всех образцов готовили в общем объеме, при этом добавляли конкавалин А из расчета 20 мкг на 1 мл культуры (митогены разводят в дистиллированной воде) и антибиотики из расчета: пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл. Готовую среду разливали в 50 мл пластиковые флаконы по 8 мл и добавляли в каждый флакон по 2 мл крови.
Флаконы с культуральной смесью помещали в термостат на 71 час при температуре 37,5 С. На 64 часу вводили 5 -бромдезоксиуридин в дозе 20 мкг/мл. На 68 часу вводили стоп-раствор, содержащий 15 мкг бромистого этидия и 0,3 мкг колхицина на 1 мл культуры.
По окончанию культивирования содержимое флаконов переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали 10 мин при 2500-3000 тыс. оборотов. Надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспендировали в малом объеме гипотонического раствора (0,56% КС1), доводили объем гипотонического раствора до 10 мл и инкубировали 40 мин при 37,5 С.
Гипотонический раствор удаляли центрифугированием в принятом режиме. Осадок ресуспендировали и добавляли к нему 3 мл свежеприготовленного, охлажденного фиксатора Лилли (метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1). Фиксация проводилась при 4 С не менее 45 мин. За это время фиксатор меняли трижды. Старый фиксатор удаляли центрифугированием.
Для приготовления препаратов на чистые, охлажденные стекла с высоты вытянутой руки наносили несколько капель клеточной взвеси. Качество препарата оценивали под микроскопом при увеличении 20х. Изменяя объем фиксатора, концентрацию клеток доводили до оптимума, и готовили основные препараты, нанося по 12-14 капель взвеси на стекло. Препараты высушивались на воздухе, после чего их окрашивали 2-4% раствором красителя Романовского-Гимза на фосфатном буфере (рН 6,8).
Анализ препаратов хромосом проводился с использованием стандартных программ обработки видеоизображений. За основу нами были взяты система Image Scope 1, разработанная фирмой Системы для микроскопии и анализа (Москва, институт кристаллографии РАН) и Photoshop 5,5. Схема ка-риотипирования представлена на рис. 5.
Поиск метафаз для анализа проходил при увеличении 20х. Для исследования отбирались округлые (овальные) метафазы без или с минимальным числом накладок хромосом. Анализ отобранных метафаз проводился при увеличении 100х.
Ведение трансгенной линии и изучение наследования трансгена
В ходе выполнения диссертационной работы было исследовано три поколения животных от трансгенных кроликов, полученных методом микроинъекции. Для уменьшения эффекта инбридинга для размножения также использовались интактные кролики.
Всего методом ПЦР-анализа было исследовано 164 кролика, в том числе 57 кроликов второго поколения, 55 кроликов третьего и 52 кролика четвертого поколения. Для получения потомства использовалось скрещивание по типу трансген-нетрансген и трансген-трансген.
Из 57 исследованных кроликов поколения F2, количество трансгенных составило 21 животное (36,8%), в том числе 17 животных, полученных от спаривания трансген - нетрансген и 4 животных, полученных от спаривания трансген - трансген.
В з из 55 исследованных кроликов 23 оказалось трансгенными (41,8%), в том числе 13, полученных от спаривания трансген - нетрансген и 10, полученных от спаривания трансген - трансген.
Из 52 исследованных кроликов поколения F4 27 были идентифицированы как трансгенные (51,9%), из них 11, получены от спаривания по типу трансген-нетрансген и 16 от спаривания по типу трансген-трансген.
На рисунке 6 показан ПЦР анализ кроликов на трансгенность по генному кластеру RCA.
С другой стороны, заметные различия в наследовании трансгена были выявлены при спаривании животных по типу трансген-трансген. Так, если в 1-ом поколении трансгенных кроликов было получено 50% трансгенных потомков, то в последующих двух поколениях - 71,4 и 72,7%. Такую высокую вариабельность в наследовании трансгена можно объяснить более высокой степенью инбридинга при спаривании животных второго поколения, когда большинство трансгенных животных было представлено полусибсами. Более низкий процент трансгенного потомства в первом поколении от спаривания трансген-трансген, по сравнению со вторым и третьим поколением аналогичного скрещивания можно также объяснить небольшой выборкой исследуемых животных (п=8), поскольку при спаривании трансген-нетрансген между тремя поколениями существенной разницы не выявлено.
Полученные нами данные существенно не отличаются от результатов, полученных Прокофьевым М.И. [Прокофьев, 2003], где процент трансгенных особей у кроликов первого, второго и третьего поколений от спаривания трансгенных особей с нетрансгенными составила 16,6%, 36,6% и 44,9%, соответственно, а при спаривании трансгенных особей второго поколения наследование гена наблюдалось у 79,5%.
Было установлено, что на наследование трансгена существенное влияние оказывает происхождение животных. Первоначально были отобраны 2 трансгенных самца поколения Fj (№ 025 и № 074), которые были использованы для дальнейшего разведения трансгенной линии. В таблице 4 представлены данные о наследовании трансгена в зависимости от используемого трансгенного самца. Было установлено, что при анализирующем скрещивании с нетрансгенными самками более высокая доля трансгенного потомства наблюдалась у самца №025 - 40,9%, в то время как доля трансгенных потомков, полученных от самца №074, составляла 29,6%.
Известно, что в норме наследование трансгена соответствует законам Менделя для моногибридного скрещивания, так как в большинстве случаев интеграция трансгена происходит в одной хромосоме. Таких животных принято называть гемизиготными, а не гетерозиготными поскольку у них на гомологичной хромосоме отсутствует соответствующий трансгену аллель. При спаривании гемизиготного трансгенного потомства в норме ожидается следующее расщепление: 50% - гемизиготы, 25% - гомозиготы и 25% - нетрансгенные особи. При спаривании гемизиготных особей с нетрансгенными в потомстве ожидается расщепление трансгенных и нетрансгенных особей 1:1, причем все трансгенные особи будут гемизиготами. В случае спаривания двух трансгенных особей, один из которых является гомозиготным, а другой гемизиготным все потомство будет трансгенным, но лишь половина потомства будет гомозиготным. Результатом спаривания гомозиготной особи и не-трансгенной будет гемизиготное трансгенное потомство.
Случайность интеграции трансгена у первичных трансгенных животных может приводить к нарушению таких областей генома, которые имеют существенное значение в процессе развития. В таком случае если трансгенное животное является гемизиготой, эта, так называемая «мутация интеграции» не приводит к существенным аномалиям, поскольку в гомологичных хромосомах таких животных имеется интактный аллель. Исключения ветречаются в случае аддитивного действия гена, вследствие чего происходит снижение выраженности эндогенных аддитивных признаков. При спаривании гемизиготных особей с «мутацией интеграции» не может быть получено гомозиготное потомство. Подобные явления наблюдались в потомстве трансгенных мышей с геном гормона роста человека [Wagner et ah, 1983]. В таком случае, при скрещивании двух гемизигот, по закону Менделя ожидается уменьшение размера помета (из-за отсутствия гомозигот - 25%), а среди живорожденных особей соотношение трансгенных и нетрансгенных будет составлять 2:1.
