Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Эпизоотическая ситуация по туберкулёзу в России 10
1.2. Современные методы диагностики туберкулёза животных 15
1.3. Иммуногенетический аспект противотуберкулезного гуморального ответа 29
1.4. Применение моноклональных антител в диагностике туберкулеза животных 35
1.5. Антигены, применяемые в лабораторной диагностике туберкулеза животных 40
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 45
2.1. Материалы и методы 45
2.1.1. Материалы 45
2.1.2. Методы 49
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 55
2.2.1. Получение хроматографических фракций микобактерий разных видов и исследование их белкового состава 55
2.2.2. Получение моноклональных антител против антигена МРВ83 Mycobacterium bovis и изучение их иммунобиологических свойств 65
2.2.3. Выявление в хроматографических фракциях микобактерий разных видов антигена МРВ83 с помощью моноклональных антител S2H6G4 72
2.2.4. Определение видоспецифичности антигена МРВ83
для микобактерий 74
2.2.5. Разработка тест-системы ИФА для диагностики туберкулеза животных 79
2.2.6. Оценка специфичности и чувствительности разработанной тест-системы ИФА с использованием сывороток крови здоровых и больных туберкулезом коров 87
2.2.7. Расчет себестоимости приготовления тест-системы ИФА для диагностики туберкулеза животных и определение экономической эффективности ее применения в сравнительном аспекте 98
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 106
4. ВЫВОДЫ 111
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 112
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 113
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 114
ПРИЛОЖЕНИЯ 139
- Эпизоотическая ситуация по туберкулёзу в России
- Современные методы диагностики туберкулёза животных
- Материалы и методы
Введение к работе
Актуальность темы. Ветеринарная фтизиатрия имеет дело более чем с сотней видов земной фауны, различными возбудителями болезней у млекопитающих, птиц, холоднокровных и большой группой атипичных микобакте-рий (58).
Ученые и ветеринарные специалисты изучают, в основном, проблемы туберкулеза сельскохозяйственных животных, особенно, вопросы, касающиеся туберкулеза крупного рогатого скота, вследствие огромного эпизоотического и экономического значения болезни для животноводства, а также возможности передачи возбудителя человеку (38).
Туберкулез, вызываемый Mycobacterium bovis, является серьезной проблемой в России и за рубежом. По данным многих отечественных и иностранных специалистов (27, 64, 89, 95, 112), туберкулез крупного рогатого скота широко распространен в мире, причем борьба с ним значительно затрудняется все возрастающей интенсификацией сельскохозяйственного производства.
Несмотря на активное и неуклонное проведение национальных и международных программ по борьбе с туберкулезом, а также постоянный контроль со стороны правительственных и межправительственных органов, по данным Международного эпизоотического бюро, только 24 страны мира полностью свободны от этого заболевания (58).
Как считает Bothamley G. (116), основополагающие принципы всех программ по борьбе с туберкулезом - строго поставленный учет, аттестация стад, карантинирование, своевременная диагностика болезни, убой больных животных (а при необходимости всего стада) и др.
По сообщениям Овдиенко (69-71), Найманова А.Х. (65), Н.П. Колычева Н.М. (48), Куликовской Н.В. (55) и др., значительных успехов в оздоровлении России от туберкулеза достигла отечественная ветеринарная медицина.
Однако, существующая в большинстве случаев разобщенность медицинских и ветеринарных организаций в проведении противотуберкулезных мероприятий значительно снижает их эффективность и тормозит успешное решение проблемы ликвидации туберкулеза.
Перед ветеринарными исследователями стоят важнейшие задачи в самых различных областях биологии возбудителей и эпизоотологии туберкулеза. Огромное значение имеет расшифровка механизма видовой восприимчивости животных к микобактериям, антигенная структура возбудителя и усовершенствование методов диагностики болезни (15).
В настоящее время в России широко используемым методом для диагностики туберкулеза животных является туберкулинизация (48, 51).
Однако, по последним статистическим данным, количество ложно положительных туберкулиновых проб составляет около 17 %,. что связано с ги-перчувствительностыо организма животных в отношении непатогенных атипичных микобактерий и возбудителей некоторых инфекционных и инвазионных болезней (17, 58, 64, 78, 95).
Для дифференциации специфических и неспецифических реакций при туберкулезе используют комплексный аллерген из атипичных микобактерий, птичий туберкулин или сенситины, однако, последние весьма дороги, а результаты не всегда достоверны (7, 15, 28, 79).
В изучении роли гормонов, интерлейкинов, антител при туберкулезе чередовались периоды, когда главное внимание исследователей, занимавшихся проблемами противотуберкулезного иммунитета, было приковано к разным группам таких веществ (139, 144).
После того, как было установлено, что главное звено в защите организма от туберкулеза - взаимодействие Т-лимфоцитов и макрофагов, силы исследователей были сконцентрированы на изучении факторов, способствующих дифференцировке иммунокомпетентных клеток, и межклеточном взаимодействии. Однако, как считает Черноусова Л.Н. и др. (93, 95), определение
современными методами уровня и спектра противотуберкулезных антител далеко не исчерпало себя в качестве средства иммунодиагностики и характеристики особенностей течения туберкулеза, а сами препараты противотуберкулезных антител, в том числе моноклональных, еще не в достаточной степени используются для характеристики микобактериальных антигенов, приготовления диагностикумов и других целей не только у нас в стране, но и за рубежом.
Кроме того, по мнению Авдиенко В.Г. (4), действие антител не обязательно должно быть направлено непосредственно на сами микобактерии, существуют более обширные возможности для балансировки противотуберкулезного иммунитета, например, путем идиотип - антиидиотипических взаимодействий.
Некоторые антигены M.bovis приобрели особые иммунологические свойства, позволяющие возбудителю выживать в макрофагах хозяина. Одним из таких антигенов, по данным Lin М. (165), Morris J. (175) и др., является антиген МРВ83, препятствующий фаголизосомальному слиянию. Поэтому, обнаружение антигена МРВ83 у микобактерии разных видов является важной исследовательской задачей.
По мнению Лысенко A.M. (59), Маслова Е.В. (63), Andersen А. (108), Armbrust А. (109), Lightbody К. (164) и др., для диагностики туберкулеза животных наиболее удобен иммуноферментный анализ, т.к. этот метод позволяет ставить диагноз на туберкулез в лабораторных условиях одновременно у большого количества животных в отличие от туберкул и низаци и, прост в применении, обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
В связи с этим, получение и изучение иммунологических характеристик микобактериальных антигенов, возможности их использования для диагностики туберкулеза животных методом ИФА являются актуальной задачей не только для ветеринарной, но и для медицинской практики.
Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований - получение антигена МРВ83 M.bovis для диагностики туберкулеза животных методом ИФА.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Получить хроматографические фракции из микобактерий разных видов и исследовать их белковый состав.
Получить моноклональные антитела, направленные против антигена МРВ83 M.bovis, и изучить их иммунобиологические свойства.
3.Исследовать хроматографические фракции микобактерий разных видов на наличие антигена МРВ83 с помощью моноклональных антител S2H6G4.
4. Создать тест-систему для диагностики туберкулеза животных методом ИФА.
5.Определить специфичность и чувствительность разработанной тест-системы ИФА с использованием сывороток крови здоровых и больных туберкулезом коров.
6. Рассчитать себестоимость приготовления тест-системы ИФА для диагностики туберкулеза животных и определить экономическую эффективность ее применения в сравнительном аспекте. Научная новизна.
Впервые на основе антигена МРВ83 и моноклональных антител S2H6G4 создана тест-система ИФА для диагностики туберкулеза животных.
Разработан способ получения антигена МРВ83 M.bovis, который входит в состав белковых фракций патогенных микобактерий.
Предложен метод получения моноклональных антител S2H6G4, которые специфически связываются с антигеном МРВ83.
Установлено, что антиген МРВ83 является видоспецифичным для патогенных микобактерий M.bovis, M.tuberculosis и М.avium.
Исследован спектр антимикобактериальных антител в сыворотке крови
здоровых и больных туберкулезом коров, и показано, что у больных животных иммунодоминантпыми являются антитела к антигенам M.bovis с молекулярной массой 22-25 KDa, в диапазоне которой находится антиген МРВ83.
6. Создана высокочувствительная тест-система ИФА на основе антигена МРВ83, позволяющая диагностировать туберкулез крупного рогатого скота в 89,3 % случаев.
Практическая значимость.
Для диагностики туберкулеза разных видов животных получены антиген МРВ83 и моноклональные антитела S2H6G4, которые были использованы для приготовления тест-системы ИФА.
Разработаны «Инструкция по получению антигена МРВ83 для диагностики туберкулеза животных», «Инструкция по получению моноклональных антител S2H6G4 для диагностики туберкулеза животных», утвержденные ректором ФГОУ ВПО МГАВМиБ им К.И.Скрябина 24 ноября 2005 г.
3. Совместно с лабораторией биотехнологии Центрального научно-исследовательского института туберкулеза (ГУ ЦНИИТ РАМН) получены тест-системы для диагностики туберкулеза разных видов животных методом ИФА, которые прошли контроль на чувствительность и специфичность.
Высокая специфичность и чувствительность разработанной тест-системы ИФА доказана в опытах с сыворотками крови здоровых, подозреваемых в заражении и больных туберкулезом коров, принадлежащих ОПХ «Победа», Ртищевского района Саратовской области и ЗАО «Медвежьи озера», Щелковского района Московской области, что подтверждено актами, утвержденными руководителями хозяйств.
На тест-систему ИФА получено заключение из отдела кинологической и ветеринарно-санитарной службы Управления охраны уголовно-исполнительной системы Министерства Юстиции, в котором указывается о востребован-ности разработанной тест-системы ИФА для диагностики
туберкулеза у служебных собак.
6. Результаты исследований по созданию технологии приготовления антигена МРВ83 и моноклональных антител S2H6G4 для диагностики туберкулеза животных методом ИФА используются в учебном процессе на кафедре биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина.
Личный вклад соискателя. Автору принадлежат непосредственное осуществление исследований по приготовлению антигена МРВ83 и моноклональных антител S2H6G4, создание тест-системы ИФА и оценка ее специфичности и чувствительности с использованием сывороток крови лабораторных и сельскохозяйственных животных, анализ и теоретическое обобщение полученных данных.
В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаборатории биотехнологии ЦНИИ туберкулеза РАМН Авдиенко В.Г., которому выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований изложены в 4 печатных работах, научных отчетах «Получение антигена МРВ83 M.bovis и его диагностическая оценка» (утвержден 02.11.2005 г) и «Иммунохимическая характеристика моноклональных антител S2H6G4, направленных против антигена МРВ83 M.bovis» (утвержден 15.11.2005 г) и доложены на международной научной конференции «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине» (Москва, 2003), международной научной конференции «Актуальные проблемы развития животноводства» (Львов, 2003), международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И. Скрябина (Москва, 2004).
Публикации. По результатам диссертации опубликованы 4 научные работы в сборниках статей международных конференций.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 152 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список литературы (223 источника, из которых 106 отечественных и 117 зарубежных авторов). Работа содержит 18 таблиц, 18 рисунков и 14 страниц приложений.
На защиту выносятся следующие положения:
Теоретическое обоснование использования антигена МРВ83 Mycobacterium bovis для диагностики туберкулеза животных методом ИФА.
Способы получения антигена МРВ83 и моноклональных антител S2H6G4.
3. Видоспецифичность и чувствительность антигена МРВ83 и разработка тест-системы при диагностике туберкулеза животных методом ИФА.
Эпизоотическая ситуация по туберкулёзу в России
Туберкулез как проблема ветеринарии не теряет свою актуальность, несмотря на успехи в борьбе с этим заболеванием. На Земле еще сохраняется большой резервуар туберкулезной инфекции, наличие которого представляет опасность не только для животных, но и для населения развивающихся и экономически развитых стран (23).
По мнению Драбкиной P.O. (31), хроническое течение туберкулеза объясняется медленным размножением возбудителя in vivo и длительностью инкубационного периода (от недель до нескольких лет).
По данным Благодарного ЯЛ. (16), основным источником возбудителя туберкулеза животных как в России, так и за рубежом служат зараженный крупный рогатый скот и больные туберкулезом люди. Определенное значение в распространении болезни имеют также зараженные и больные козы, свиньи, овцы, лошади, кошки, собаки.
Кузин А. И. (53) считает, что козы наиболее восприимчивы к бычьему виду возбудителя туберкулеза. У 40 % коз, реагирующих на туберкулин, обнаруживали типичные для туберкулеза изменения и выделяли М. bovis.
Никаноров А.И. (68) установил важную роль микобактерий человеческого и птичьего типов в эпизоотологии туберкулеза маралов.
Урбан В.П. (84), изучая природу повторных вспышек туберкулеза, отмечал, что от больных собак выделялись М. tuberculosis в 67 % случаев, М. bovis - в 29 % и М. avium - в 0,7 %.
Доказанным фактом является то, что от больных людей животные могут заразиться как бычьим, так и человеческим видами микобактерий (24).
Кузина Л.Н. (54) выделяла от коров крупного рогатого скота 7,5 % культур микобактерий туберкулеза человеческого вида, а Козлов Н.Н. и соавт. (44) выделяли данные микобактерий в 11,5 % случаев от больных туберкулезом свиней.
По сообщениям Аликаевой А.П. (8), характер передачи возбудителя туберкулеза зависит от локализации его в зараженном организме и путей выделения, а внедрение в новый организм - от ворот инфекции. Так, в молоке зараженных коров может быть до 5 млн. микобактерий туберкулеза в 1 мл.
По данным Коромыслова (51), распространение туберкулеза через инфицированное молоко и необеззараженный обрат может происходить не только внутри неблагополучных хозяйств, но и являться одним из основных факторов эпизоотологических и эпидемических вспышек болезни.
Колычев Н.М. (49) установил, что в России вывоз необеззараженного навоза на поля приводит к тому, что на фермы поступают растительные корма, контаминированные возбудителем туберкулеза.
Имеются сообщения о механическом выносе микобактерий туберкулеза из почвы растущими растениями (42).
По данным Филимонова А.В. (89), повторное возникновение туберкулеза чаще регистрируют в стадах, оздоровленных в результате систематического выявления и убоя животных, реагирующих на туберкулин. Без заноса возбудителя туберкулеза извне болезнь возникает повторно в 80 - 89,5% хозяйств. В 76,7 - 91% случаев рецидив туберкулеза в хозяйствах регистрируют в первые 3-4 года после их оздоровления.
Хазипов Н.З. с соавт. (90), Тузова Р.В. (82), и др. установили, что в ряде хозяйств России туберкулез периодически выявляют в течение 25 - 50 лет. В этих хозяйствах интервалы между снятием ограничений и повторным установлением болезни, в большинстве случаев, составляют 3-5 лет.
Шаровым А.Н. (96) установлена прямая зависимость повторного возникновения туберкулеза от длительности неблагополучия хозяйств и наличия в них больного скота. Если хозяйства оздоравливали с передержкой больных животных, то риск повторного возникновения болезни возрастал в 2 - 3 раза.
По данным Шишкова В.П. с соавт. (98), в хозяйствах, длительно неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота, оздоровленных с применением химиопрофилактики, повторное возникновение болезни наблюдали уже через 1 - 2 года после оздоровления. Основная причина рецидива туберкулеза - наличие скрытых носителей возбудителя инфекции среди ремонтного молодняка, выращенного в условиях недостаточной изоляции в период неблагополучия фермы.
Современные методы диагностики туберкулёза животных
Для диагностики туберкулеза животных как в нашей стране, так и за рубежом используют комплексный подход. Применяют методы клинического, аллергического, патологоанатомического и бактериологического исследований с учетом эпизоотологических данных. Диагноз на туберкулез считают установленным при выделении культуры возбудителя или при получении положительных результатов биологической пробы. У крупного рогатого скота, помимо этого, диагноз также считают установленным при обнаружении в органах или тканях патологических изменений, типичных для туберкулеза. В необходимых случаях могут быть использованы дополнительные методы исследований (58, 78).
Аллергические методы диагностики туберкулеза. Для аллергической диагностики туберкулеза у млекопитающих применяют ППД-туберкулины для млекопитающих или стандартный раствор туберкулина (65).
Традиционно в России используют внутрикожный метод туберкулиниза-ции, как дополнительные методы - глазной и внутривенный.
Внутрикожный метод туберкулинизации был разработан в 1976 году Ов-диенко Н.П. (70) и стал широко применяться для прижизненной диагностики туберкулеза животных как в нашей стране, так и за рубежом.
Однако данный метод является трудоемким в применении, т.к. включает такие манипуляции, как фиксация каждого животного, выбривание места инъекции, подготовка безъиголыюго инъектора к работе, контроль качества работы инъектора, учет результатов реакции через 72 часа, измерение кожной складки кутиметром, анализ результатов исследований. Кроме того, внутрикожный метод туберкулинизации является субъективным и в большинстве случаев появляется необходимость проводить туберкулинизацию животных комиссионно (75, 104).
Биохимический состав ППД-туберкулина достаточно сложный. Основной его фракцией является белок, содержание которого колеблется от 70 до 85%. Кроме того, ППД - туберкулин содержит 4 - 5 % полисахаридов, 1 - 2 % нуклеиновых кислот и до 12 % липидов (51).
Безгиным В.М. с соавт. (13) было установлено, что в серийно производимом ППД-туберкулине для млекопитающих не содержатся фракции белка, обладающие высокой активностью и видовой специфичностью, но выявляются балластные антигены. Наличие балластных белков может приводить к ложно положительным или ложно отрицательным результатам туберкулинизации крупного рогатого скота.
По последним статистическим данным, количество ложно положительных туберкулиновых проб в России составляет около 17 %, что связано с гиперчувствительностью организма животных в отношении непатогенных атипичных микобактерий и возбудителей некоторых инфекционных и инвазионных болезней (64, 78).
Материалы и методы
Работа выполнена в период с 2002 по 2005 гг. на кафедре биотехнологии ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» и в лаборатории биотехнологии государственного учреждения «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза» РАМН (ГУ ЦНИИТ). Эксперименты по определению чувствительности и специфичности разработанных тест-систем ИФА проводили с использованием сывороток крови крупного рогатого скота, принадлежавшего хозяйствам ОПХ «Победа» Ртищевского района Саратовской области и ЗАО «Медвежьи озера» Щелковского района Московской области.
Материалы
Микроорганизмы. Для приготовления микобактериальных антигенов и моноклональных антител были использованы музейные штаммы микобакте-рий, любезно предоставленные ГУ ЦНИИТ. Культуры штаммов выращивались в сертифицированной лаборатории микробиологии ГУ ЦНИИТ:
- M.bovis 8, M.bovis BCG .М. bovis 4С1, M.bovis Vallee;
- M. tuberculosis H37Rv, M.tuberculosis Erdman;
- M. avium 1D3, M. avium E10C8, M. aviumlA9, M. avium E10E2, M. avium E10H4, M. avium E10D1, M. avium E10E10;
- атипичные микобактерии: M. smegmatis 2H10, M. smegmatis 3C10, M. kansassii, M.phlei, M.fortuitum, M.scrofulaceum, M.intracellulare, M. marinum.
В качестве неспецифического контроля использовали культуру E.coli.
Антигены. В качестве стандартного микобактериального антигена использовали туберкулин PPD (Statum Serum Institut, Дания; Batch RT-40).
Культуральные фильтраты микобактерии были получены при использовании 1-2-месячных культур, выращенных на синтетических питательных средах Сотона и ВКЛ.
Антигены различной молекулярной массы получали методом ультразвуковой дезинтеграции микобактерий (УЗД) и фракционирования антигенов с помощью ДЕАЕ-хромотографии (ДЕАЕ-фракции антигенов).
В работе использовали антигены различной молекулярной массы (14, 16, 19, 25, 23-28, 30, 32, 54-58 кДа), а также коммерческие моноантигены aS4ClG4, 85А, 85С и комплексный антиген «Con А фракция».
Культуры клеток. Для получения гибридом и МКА использовали культуры клеток миеломы РЗ-Х63 Ag8.6.5.3. Для изучения патогенности вирулентности штаммов микобактерий их выращивали в культурах клеток перитоне-альных макрофагов мышей линии BALB/C.
Моноклональные антитела. В работе использовали панель моноклональ-ных антител, направленных к разным антигенным детерминантам микобактерий туберкулеза (Авдиенко В.Г. с соавт., 1996). Для этого брали МКА, направленные как к уникальным антигенным детерминантам, так и перекрестно реагирующие с другими микобактериями. В работе использовали МКА, полученные при иммунизации мышей отдельными фракциями антигенного материала из M.tuberculosis H37Rv, направленные к белкам определенной молекулярной массы - от 16 до 42 кДа (D3H2, A2G9A9, СЗЕ4, С7Е4, G3D11, G3G11, G3A6, А11А6, Al 1F2, А11А6, Al 1F7), против антигенов M.avium с мол. массой 27 кДа (Е10С8, 1А9, Е10Е2, E10D1, Е10Н4, Е10Е10), против M.bovis с мол. массой 26 кДа (4С1) и M.smegmatis (2Н10, ЗС10).
Также в работе использовали МКА узкой направленности: 10G10, D4, 1F9, 4Н4, 10D6, полученные Авдиенко В.Г с соавт. путем иммунизации цельным соникатом M.tuberculosis H37Rv и МКА против антигена МРТ83/ МРВ83 анти-25-26 кДа S2H6G4. Гибридомы, продуцирующие антимикобак-териальные антитела, наращивали во флаконах объемом 50 мл, содержащих фидерный слой из перитонеальных макрофагов мышей линии BALB/C.
![Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза [Электронный ресурс]](/i/i/4598/199278.png "Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза [Электронный ресурс] Ефременко Дмитрий Витальевич")
