Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1. ДНК-маркеры и их практическое использование 10
1.1.1. RFLP-маркеры 12
1.1.2. STS-маркеры 13
1.1.3. RAPD-маркеры 14
1.1.4. AFLP-маркеры 16
1.1.5. SSR-маркеры 17
1.1.6. ISSR-маркеры 24
I.1.7.RGA -маркеры 25
1.1.8. QTL-маркеры 30
1.2. Характеристика культуры: огурец (Cucumis sativus h.) 31
1.2.1. Краткая ботаническая характеристика 33
1.2.2. Хозяйственное значение 34
1.3. Молекулярно-генетическая характеристика генома огурца 36
1.3.1. Геномный состав и кариотип 36
1.3.2. Молекулярное маркирование 37
1.4. Роль гибридов F1 в селекции огурца. 38
1.5. Настоящая мучнистая роса огурца 42
1.5.1. Возбудители болезни 43
1.5.2. Генетика устойчивости к настоящей мучнистой росе 46
Глава II. Материалы и методы 49
II.1. Растительный материал 49
II.2. Методы исследований 49
II.2.1. Выделение ДНК из растительного материала 49
II.2.2. ПЦР-анализ 51
II.2.3. Клонирование ПЦР-продуктов 57
II.2.4. Секвенирование 57
II.2.5. Анализ нуклеотидных последовательностей 57
II.2.6. Анализ расщепления 57
II.2.7. Определение гриба-возбудителя 57
Глава III. Результаты и обсуждение 58
III.1. Изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus L) с использованием ISSR-метода 58
III.2.Использование RGA-праймеров для маркировании признака устойчивости к настоящей мучнистой росе 64
III.2.1. Анализ расщепления популяции F2 64
III.2.2. Идентификация возбудителя мучнистой росы 65
III.2.3. Адаптация метода RGA-ПЦР для анализа генома огурца 67
III.2.4. Анализ RGA-ПЦР 70
III.3. Оценка эффективности SSR- и STS-маркеров, ассоциированных с QTL устойчивости к мучнистой росе на расщепляющейся популяции F2 и иогенных линиях 75
III.4. Разработка эффективной системы оценки уровня гибридности гибридов F1 на основе SSR-маркеров. 80
III.4.1. Поиск надежного экспресс-метода выделения ДНК 83
III.4.2. Оптимизация условий амплификации SSR-ПЦР 85
III.4.3. Анализ SSR -ПЦР 86
Выводы 91
Список использованной литературы 92
Введение к работе
Актуальность темы. Огурец посевной (Cucumis sativus L.) - один из самых древних и популярных видов овощных культур в мире. В современных программах по селекции огурца большое внимание уделяют использованию гетерозисных гибридов с комплексной устойчивостью к наиболее вредоносным заболеваниям. Оценка уровня гибридности семян является важной задачей в семеноводстве гетерозисных гибридов. Наиболее удобными для этих целей являются молекулярные маркеры, их использование позволяет защитить авторские права и контролировать качество полученных семян.
Мучнистая роса - одна из наиболее распространенных болезней огурца. При поражении огурца мучнистой росой потери урожая достигают 40% (Нои & Ма, 1999). Создание устойчивых форм к этой болезни имеет ряд сложностей: 1) необходимость отбора на инфекционном фоне в больших выборках; 2) наличие нескольких видов грибов-возбудителей; 3) нет единого мнения о природе наследования устойчивости. Применение молекулярных маркеров значительно ускорит и упростит селекцию огурца на устойчивость к мучнистой росе. Выбор метода RGA-ПЦР с праймерами на основе консервативных последовательностей R-генов для маркирования устойчивости к мучнистой росе обусловлен характером устойчивости к этой болезни (Morishita, 2003).
В создании молекулярных маркеров ключевым моментом является поиск полиморфизма в геноме. С помощью RAPD и RFLP маркеров, широко применяемых в селекции растений, был выявлен низкий уровень внутривидового полиморфизма в геноме огурца (Kennard et al., 1994, Horejsi & Staub, 1999).
В поисках полиморфных маркеров мы остановились на таких маркерных системах, как ISSR и SSR, которые успешно были применены на различных сельскохозяйственных культурах (Deng et al., 2000, Cekic, 2001, Reddy et al., 2002, Tikunov et al., 2003, Staub et al, 2007).
Дели и задачи исследования. Целью работы являлось изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus) с использованием ISSR-, SSR-, RGA-маркеров и его применение для оценки гибридности семян и маркирования устойчивости к мучнистой росе.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи: 1. Провести анализ полиморфизма межмикросателлитных последовательностей генома огурца с использованием ISSR-праймеров на сортах и селекционных линиях.
-
Провести анализ полиморфизма последовательностей аналогов генов устойчивости методом RGA-ПЦР на сортах и селекционных линиях.
-
Изучить наследование устойчивости огурца к мучнистой росе.
-
Идентифицировать возбудителя мучнистой росы огурца на изучаемых популяциях с помощью микроскопического анализа клейстотециев гриба.
5. Провести RGA-анализ образцов огурца, различающихся по
устойчивости к мучнистой росе.
-
Оценить эффективность STS- и SSR-маркеров, ассоциированных с локусами количественных признаков (QTL) устойчивости к мучнистой росе на расщепляющейся популяции F2 и изогенных линиях, полученных на селекционной станции им. Н.Н. Тимофеева.
-
Разработать эффективную систему оценки уровня гибридности гетерозисных гибридов Fb основанную на SSR-маркерах.
Научная новизна. Впервые проведен анализ генома огурца с использованием ISSR-ПЦР, позволивший выявить высокий уровень полиморфизма. Наиболее полиморфными оказались межмикросателлитные последовательности, выявляемые праймером К28 на основе динуклеотидного повтора [GT]8A (83%). Такие результаты дают нам основание предположить, что данные повторы ДНК наиболее подвержены изменениям в процессе эволюции огурца. В геноме огурца выявлен высокий полиморфизм как длины самих микросателлитов, так и межмикросателитных последовательностей ДНК. Полученные нами результаты расширяют современные представления об эволюции генома огурца.
Проведен анализ наследования устойчивости к мучнистой росе, вызываемой Podosphaera xanthii. Впервые на огурце применен метод RGA-ПЦР для маркирования признака устойчивости к мучнистой росе. С помощью RGA-праймеров XLLRf-r из LRR-группы был амплифицирован фрагмент, связанный с устойчивостью к фитопатогену.
На основе нуклеотидной последовательности полученного фрагмента сконструированы SCAR-праймеры, позволяющие выявлять растения огурца с различной степенью устойчивости.
Впервые был разработан простой и эффективный метод анализа уровня гибридности гетерозисных гибридов Fi огурца, основанный на применении микросателлитных маркеров в агарозном геле.
Практическая значимость. В наших исследованиях ISSR-ПЦР зарекомендовал себя как хорошо воспроизводимый метод, позволяющий выявлять высокий уровень полиморфизма. Поэтому данный метод может быть
рекомендован для использования в селекции огурца при подборе пар для скрещиваний.
На основании оценки эффективности SSR- и STS-маркеров, ассоциированных с QTL устойчивости к мучнистой росе, на расщепляющейся популяции F2 и изогенных линиях, мы можем рекомендовать данные маркеры для выявления устойчивости исходного материала и сортов огурца к мучнистой росе: EACMCTG116STS - как доминантный маркер, EAAGMCAT280-282STS -как кодоминантный маркер.
Разработана эффективная система оценки уровня гибридности гетерозисных гибридов F, огурца на основе SSR- маркеров, которая рекомендуется для контроля качества полученных семян.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», 2005; на международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства», 2007.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста и включают 37 рисунков, 10 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 221 наименований, из них 175 иностранных.
SSR-маркеры
В 1989 г. появились первые сообщения о возможности получения ДНК-маркеров на основе полиморфизма микросателлитных или простых повторяющихся последовательностей (Tautz, 1989; Weber&May, 1989). Метод получил название микросателлитного или SSR-анализа.
Микросателлиты (SSRs) - последовательности геномной ДНК различной длины, состоящие из коротких повторов. Простые повторяющиеся последовательности распределены по всему геному и образованы многократным (до нескольких тысяч раз) повторением структурного повтора. Количество нуклеотидов, составляющих такой повтор, варьирует по данным из разных источников: 1 - 6 нуклеотидов (Metzgar et al., 2000), 1 - 5 (Tautz&Renz, 1984; Tautz, 1989), 2-5 (Schmidt and Heslop-Harrison, 1996), 2 -4 (Areshchenkova and Ganal, 1999), 2-6 (Celtic et al., 2001).
Число таких повторов и, следовательно, длина самих SSR-последовательностей, как правило, сильно варьируют, что и позволяет их использовать в качестве маркеров (Brown et al., 1996).
Отмечено более 40 видов микросателлитов, например таких как, [СА]п, [GT]n, [CAC]n, [GATA]n и другие. Общее количество микросателлитных последовательностей различных типов у разных организмов отличается. Так, например в геноме человека их содержится в 10 раз больше, чем в геноме растений (Powell et al., 1996), где их общее количество оценивается от 5 х 103 до 3 х 105 на геном (Condit and Hubbell, 1991). Среди различных типов микросателлитов наиболее широко распространены у всех живых организмов микросателлиты - тринуклеотидные повторы [AAG]n, [AAT]n (Gupta et al., 1996). Однако в геномах различных групп организмов превалируют, как правило, ограниченное количество типов микросателлитов. Например, в геномах млекопитающих и Drosophila чаще встречаются микросателлиты [GT]n. У Arabidopsis thaliana, который является модельным объектом для генетических исследований, относительная частота [СА]п и [GA]n составляет примерно один микросагеллит на каждые 430 и 244 тыс. п. н., соответственно. Микросателлиты [АТ]п - наиболее распространённые в геноме этого вида. Этот тип повтора также превалирует у дрожжей (Lagercrantz et al., 1993; Schlotterer, 1998). Однако, данные, полученные при изучении генома Arabidopsis thaliana, не могут быть автоматически экстраполированы на другие виды растений. Так, частота встречаемости у других высших растений микросателлитов [СА]п составляет один микросателлит на каждые 86 - 300 тыс. п. и., а микросателлитов [GA]n -один на каждые 17 - 125 тыс. п. н. (Condit and Hubbell, 1991; Lagercrantz et al., 1993). В целом наиболее распространённые типы микросателлитов среди растений это динуклеотиды [АС]п и [GA]n - они встречаются в геномах всех растений, хотя их количество у отдельных видов может сильно варьировать. Так, например, общее количество [АС]п и [GA]n составляет у Zea mays примерно 12000 и 18000 соответственно (Condit and Hobbell, 1991), в то время как у Pinus strobes количество [АС]п оценивается числом в 38000-120000 , a [GA] - 46000-60000 (Echt et al, 1997).
По данным Wang et al. (1994) микросателлиты встречаются в геномах растений следующим образом, в порядке убывания количества: [АТ]п, [А]п, [AG]n, [AAT]n, [AACln, [AGC]n, [AAG]n, [AATT]n, [AAAT]n, [AC]n.
Одним из объяснений того, что в геномах различных видов преобладают различные типы микросателлитных повторов, может служить то, что система репарации ДНК, проявляет различную эффективность в репарации одних и тех же типов ошибок у различных таксонов (Modrich&Lahue, 1996; Marra and Schar, 1999).
Присутствие микросателлитов характерно как для ядерной ДНК, так и для ДНК органелл. По меньшей мере, около 500 микросателлитных локусов описаны для хлоропластного генома растений (Powell et al., 1996). У сосны и кукурузы ДНК хлоропластов содержит, в основном, мононуклеотидные повторы [А]п средней и малой длины. Также у кукурузы, печёночного мха {Marchanita polymorpha) и гороха встречаются динуклеотидные повторы [АТ]п и [TA]n (Powell et al., 1996).
Варьирование частоты распределения микросателлитов характерно не только для видов, но и для хромосом одного и того же организма. Более того, неравномерность распределения этих последовательностей наблюдается и во внутренней организации отдельных хромосом. Некоторые исследования, проведённые с использованием флюоресцентной in situ гибридизаии, показали, что микросателлиты распределены, в основном, в прицентромерном гетерохроматине хромосом: 1) [GGAT]n, [GATA]n, [CAC]n, [GA]n, [CA]n и [TA]n сахарной свеклы (Schmidt&Heslop-Harrison, 1996); 2) [GATA]n, [CA]n и [GATA]n вики (Gortner et al., 1998); 3) [GAA]n ячменя (Roder et al., 1995; Pederson&aLinde-Laursen, 1994), некоторых других видах Triticea; 5) [AAG]n, [AGC]n, [GGC]n риса (Parsons et al., 1997). Ha томатах показано, что.микросателлиты [GATA]n и [GACAJn организуются в кластеры также вокруг центромер хромосом (Brown&Tanksley, 1996; Grandilo &Tanksley, 1996; Vosman and Arens, 1997). Результаты других исследований, использующих методы генетического и физического картирования, свидетельствуют о том, что большие микросателлитные кластеры могут располагаться в различных участках хромосом (Cuadrado&Schwarzacher, 1998), в том числе и в кодирующих регионах (Levin et al., 2000; Echt et al., 1996). Микросателлиты [A],6, [TA]9 и [AAC]5 в хромосомах вики располагались в эухроматине и не обнаруживались в прицентромерном гетерохроматине (Gortner et al., 1998). В геномах рыб и приматов микросателлиты располагаются в различных областях хромосом — в гетерохроматине, в областях ядрышкового организатора и R-бэндах. Однако распределение микросателлитов в кодирующих областях ДНК хромосом ограничено. В геноме дрожжей 5 cerevisiae некодирующие области ДНК содержат больше моно- и динуклеотидных повторов (более, чем 8 единиц повтора в длину), чем кодирующие области, а количество тринуклеотидных микросателлитов примерно одинаково как в некодирующей, так и в кодирующей ДНК (Field and Wills, 1998). Так как микросателлиты характеризует мутация, связанная с изменением их длины, было предположено, что ограничение экспансии микросателлитов в кодирующие участки ДНК связано с отбором направленным на устранение мутаций, вызывающих сдвиг рамки считывания генетического кода (Metzgar et al., 2000). Данная гипотеза объясняет равное распределение тринуклеотидных повторов в кодирующих и некодирующих участках. При экспансии таких повторов в кодирующие участки сдвиг рамки считывания не происходит и в результате экспрессии может образоваться вполне функциональный белковый продукт.
SSR-маркеры получают на основе ПЦР с использованием двух олигонуклеотидных праймеров, комплементарных уникальным последовательностям, граничащим с SSR-последовательностями. Разработка SSR-праймєров - трудоемкий процесс, однако, затраченные усилия и средства по созданию новых SSR-маркеров оправдываются рядом преимуществ при их непосредственном использовании.
Во-первых, это высокая надежность и воспроизводимость. Во-вторых, относительно высокий уровень полиморфизма, основанный на изменчивой природе SSR-локусов (Brown et al., 1996). Основными причинами, лежащими в основе гипервариабельности SSR-локусов, как полагают, являются "скольжение" ДНК-полимеразы во время репликации ДНК и отсутствие исправления допущенной ошибки, неправильно спаренных оснований, которое должно за этим следовать (Schloterrer, 1998).
Причиной видоспецифичности SSR-маркеров могут являться отсутствие гомеолокусов у представителей разных родов, либо, что более вероятно, высокая степень дивергенции в сайтах отжига прайм ера.
Необходимо отметить, что для микросателлитов описаны так называемые «нулевые аллели» (null alleles) (Gupta and Varshney, 2000), где локус-специфичные праймеры не амплифицируют продукт. Такие аллели обычно появляются в результате мутации в последовательности, комплементарной праймеру, поэтому отжиг праймера становится невозможен на ДНК-матрице и микросателлит не амплифицируется. Последствия таких мутаций могут варьировать от слабого проявления бэнда при электрофоретическом разделении продуктов ПЦР до полного их исчезновения. Анализ генома человека показал, что 25% микросателлитных локусов содержат свыше 15% нулевых аллелей (Callen et al., 1993; Paetku and Strobeck, 1995).
Так же нулевые аллели описаны и для растений: в геноме пшеницы два отдельных исследования показали, что 13% микросателлитных локусов в одном исследовании и 10% в другом содержали по 25% нулевых аллелей (Plaschke et al., 1995; Prasad et al., 2000). Присутствие нулевых аллелей ведёт к недооценке гетерозиготности внутри популяции, потому что в гетерозиготе нельзя выявить присутствие нулевого аллеля на одной гомологичной хромосоме из-за амплификации продукта с другой. С одной стороны это становится проблемой при использовании локусов с нулевыми аллелями в практических целях селекции, с другой стороны, если природа мутации известна, то могут быть синтезированы другие праймеры и проведена работа по изучению расщепления нулевых аллелей как кодоминантных маркеров (Callen et al., 1993).
ПЦР-анализ
Для проведения ISSR-ПЦР были синтезированы следующие праймеры (таблица 2).
Подбор праймеров осуществлялся на основе анализа литературных данных по эффективности их использования на других видах растений.
Для анализа полиморфизма последовательностей аналогов генов устойчивости и маркирования признака устойчивости к настоящей мучнистой росе использовали праимеры, созданные на основе консервативных доменов нескольких известных генов устойчивости (Zhang et al, 2002) (таблица 3).
Объем смеси для проведения ПЦР составлял 25 мкл. В 25 мкл смеси содержалось:
0.2 мМ dNTP (СилексМ)
1х буфер для Taq-полимеразы (СилексМ)
100 -150 нг ДНК-матрицы
0,5 мкМ каждого праймера
2.5 U Taq-полимеразы (СилексМ)
ПЦР-анализ проводили на амплификаторах «Терцик» («ДНК-технология», Москва) и «DNA Engine Tetrad 2» (Bio-Rad, USA) при следующих параметрах:
Амплификация межмикросателлитных маркеров: 94С -5 мин - начальная денатурация; затем 30 циклов 94С - 1 мин, 55С - 2 мин, 72С - 30 сек; 72С - 7 мин конечная элонгация.
Амплификация аналогов генов устойчивости:
94С -4 мин - начальная денатурация; затем 36 циклов 94С - 1 мин, 50С - 1 мин, 72С - 1 мин 30 сек; 72С - 7 мин конечная элонгация.
Амплификация микросателлитных маркеров:
94С -5 мин - начальная денатурация; затем 40 циклов 94С - 30 сек, 55 - 65 С (специфичная для каждой пары праймеров см.табл.З)- 1 мин, 72С -1 мин 30 сек; 72С - 7 мин конечная элонгация.
Продукты ISSR- и SSR- ПЦР разделяли соответственно в 2%-и 3%-ном агарозном геле с буфером ТВЕ при напряжении бВ/см.
Продукты RGA-ПЦР разделяли в 6%-ом полиакриламидном геле с буфером ТВЕ при напряжении бВ/см. В качестве маркера размеров использовали «100 bp DNA-Ladder» (Fermentas). После окрашивания бромистым этидием продукты ГЩР были визуализировали и зарегистрированы с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD (США) в УФ-свете.
II.2.3. Клонирование ПЦР-продуктов.
Клонирование ПЦР-продуктов проводили с помощью набора pGEM-Т Easy Vector Systems (Promega, USA) в соответствии с инструкцией, предложенной производителем.
П.2.4. Секвенироеание
Секвенирование осуществляли методом терминирующих дидезоксирибонуклеотидов на капиллярном сиквенаторе Applied Biosystems 3130x1.
ЇЇ.2.5. Анализ нуклеотидных последовательностей.
Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программных пакетов GeneDoc (Multiple sequence alignment editor and shading utility. Ver. 2.6.002. Copyright by K. Nicholas), Clone manager 6 version 6.00 (Sci Ed Central), Vector NTI 9.0.0 (InforMax).
Поиск гомологичных последовательностей и их анализ проводили в открытых базах генетических данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (по алгоритмам MegaBlast и BlastN).
Анализ RGA-ПЦР
Популяция F26bma проанализирована с помощью 10 пар праймеров, сконструированных на основе различных групп аналогов генов устойчивости (таблица 2, глава 2).
Все пары праймеров обеспечили амплификацию 6-28 фрагментов ДНК, дающих полосы, стабильно воспроизводимые и хорошо различимые при электрофорезе в полиакриламидном геле.
9 пар праймеров (RLRRf- RLRRr, CLLRf-CLLRr, ANo.2-ANo.3, NBSfor-NBSrev, S1-AS1, S2-AS3, Ptokinl-Ptokin2, Ptokin3-Ptokin4, Ptofen-s-Ptofen-as) амплифицировали полиморфные последовательности аналогов генов устойчивости, но не дифференцировали образцы по устойчивости.
На рисунках 15 и 16 представлены электрофореграммы амплифицированных RGA- последовательностей праймеров ANo.2-ANo.3. и RLRRf- RLRRr. На данных рисунках показано наличие множественных амплификационных продуктов, но выявленный полиморфизм связан только с изменчивостью внутри данной популяции.
Таким образом, анализ полученных результатов позволяет сделать вывод, что LRR-, NBS- и PtoKin- содержащие последовательности обильно представлены в геноме огурца. Подобные результаты получены Zhang с coTp.et al. (2002) при исследовании аналогов генов устойчивости томата. Для RGA-ГЩР характерно образование большого числа амплифицируемых фрагментов, хорошо разделяемых в высокоразрешающем полиакриламидном геле.
При использовании пары праймеров XLLR г из LRR - группы был амплифицирован фрагмент длиной около 200 п.н., специфичный для всех проанализированных растений огурца, как устойчивых так и с промежуточной устойчивостью (рис. 17). Анализ 91 растения, восприимчивых к заболеванию, не обнаружил наличия данного фрагмента. Найденный фрагмент был секвенирован методом терминирующих дидезоксирибонуклеотидов на капиллярном сиквенаторе Applied Biosystems 3130 xl. На полученном сиквенсе с помощью специфичных праймеров была выявлена искомая нуклеотидная последовательность размером 212 п.н.: TCAGGGCTGTTTGACAAATTCGTAGGGAGTAAACTCCACGAAATC CGCGACTTTCACGGTCACGCCCGTCACCCGCCCATTCTCTGTCCGGAAC GGGAAGATGGCTTTCCCGAACTCGGGATCGGTGAAGACGGCATAGAAC CGGTCCCCGCCCAAAGATTCCAGACGGGCATACATATCAGGATGATGG GAGAACTTCATCCGCA TCTCAC
Для данной последовательности был произведен в GenBank поиск последовательностей с высокой гомологией по алгоритмам MegaBlast и BlastN.
Анализ нуклеотидной последовательности не выявил гомологии к имеющимся в базах данных последовательностям генов устойчивости. На основании данного сиквенса с использованием программы OLIGO 3.1. были подобраны и сконструированы праймеры.
Тестирование расщепляющейся популяции и образцов изогенных линий с помощью данных SCAR-праймеров выявило различия в электрофореграммах устойчивых и восприимчивых к мучнистой росе образцов огурца (рис. 18).
Полученный нами SCAR-маркер был успешно применен лишь на одной расщепляющийся популяции. В связи с этим SCAR-маркер может быть рекомендован для использования в селекции огурца на устойчивость к мучнистой росе только после его масштабного тестирования.
Анализ SSR -ПЦР
В результате проведенной SSR-ПЦР было показано, что все 19 пар праймеров амплифпцировали фрагменты ожидаемой длины у всех изученных 67 генотипов огурца. Профили электрофоретического разделения продуктов амплификации ДНК гибридов сравнивали с родительскими. Выбор праймеров для подобного анализа базируется на выявлении полиморфизма у исходных родительских форм и идентификации их потомства по сумме амшшфицированных фрагментов. В нашем исследовании было выявлено 4 пары праймеров, которые обеспечили амплификацию полиморфных фрагментов (таблица 10). Праймеры SSR apKepoB FLK01, F03, IS, GA09 амшшфицировали по 2 полиморфных фрагмента у различных гибридов. Так, с использованием праймеров SSR-маркера F03 у гибридов 49, 46, 54, 60, 99 были амплифицированы два фрагмента размером 230 и 260 п.н. (рис.26).
Праймеры SSR-маркера FLK01 амплифицировали два фрагмента размером 300 и 320 п.н., у гибридов Fi Кураж, Атлет, гибридов под номерами 47, 50, 57, 58, 59, 68, 98, а также у гибридов в комбинациях ГК1, ГК2, ГКЗ. У родительских форм гибридных комбинаций было получено по одному фрагменту (рис. 27 и 28).
Праймеры SSR-маркера IS амплифицировали по одному фрагменту размером 180 и 220 п.н. у родительских форм гибридных комбинаций ГК1, ГК2, соответственно, и оба этих фрагмента у их гибридов (рис. 29).
Праймеры SSR-маркера GA09 амплифицировали два фрагмента размером 300 и 330 п.н. у гибридов под номерами 60 и 61, а также у гибридов Fi Карим и Айкас.
Таким образом, показана эффективность применения SSR-маркеров F03, FLK01, IS, GA09 для оценки уровня гибридности 20 из исследованных 31 гибрида F,.
На основе полученных данных, для вышеперечисленных гибридов Ft создана эффективная система оценки уровня гибридности, включающая в себя оптимизированные методы экспресс-выделения ДНК и SSR-ПЦР с визуализацией результатов в 2%-ом агарозном геле. Данные маркеры обладают кодоминантным типом наследования и способны надежно определять гибридную природу данных образцов.
Разработанная система успешно применяется нами при массовом анализе семян гибридов Fi огурца селекционных фирм «Гавриш» и «Манул». На рисунке 30 представлен пример получаемых электрофореграмм. Стрелками указаны негибридные образцы семян.
