Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Природа устойчивости растений к фитопатогенам и способы создания сортов, устойчивых к болезням 11
1.2. Клеточная селекция растений на устойчивость к фитопатогенам 16
1.2.1. Использование тканевых и клеточных культур в селекции
на устойчивость к фитопатогенам 25
1.2.2. Использование патогенов в клеточной селекции растений 28
1.3. Селекция огурца на устойчивость к фузариозу 37
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 46
ГЛАВА 2. УСЛОВИЯ, ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ, СХЕМА И МЕТО ДИКИ ПРОВЕДЕНИЯ ОПЫТОВ 46
2.1. Исходный материал 46
2.1.1. Растительный материал 46
2.1.2. Штаммы возбудителя фузариозного увядания огурца F. oxysporum 49
2.2. Схема исследований 49
2.3. Методы исследований 51
2.3.1. Методы выращивания растений 51
2.3.2. Методики лабораторных опытов 51
2.4. Условия выращивания эксплантов 59
2.5. Методы оценки огурца на устойчивость к фузариозу 59
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 63
3.1. Оптимизация факторов, влияющих на морфогенетическую спо собность эксплантов огурца 63
3.1.1. Стерилизация семян и сегментов растений огурца для введения в культуру in vitro 64
3.1.2. Обоснование выбора эксплантов 67
3.1.3. Изучение влияния фитогормонов на морфогенетическую активность тканей огурца 71
3.1.4. Получение растений - регенерантов огурца, укоренение и адаптация к почвенным условиям 75
3.2. Разработка селективных условий для создания in vitro тканевых культур, устойчивых к фильтрату культуральной жидкости гриба F. oxysporum и фузариевой кислоте 77
3.2.1. Изучение влияния концентрации фильтрата культуральной жидкости F. oxysporum на тканевые культуры огурца in vitro 77
3.2.2. Изучение влияния фузариевой кислоты на морфогенетическую активность тканей огурца при культивировании in vitro 81
3.3. Усовершенствование экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу 84
3.3.1. Усовершенствование экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанные на проращивании семян на фильтрате культуральной жидкости гриба F. oxysporum 85
3.3.2. Усовершенствование экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанные на культивировании проростков in vitro на селективных средах, содержащих фильтрат культуральной жидкости гриба F. oxysporum 89
3.3.3. Оценка огурца на устойчивость к фузариозу на искусственном инфекционном фоне 91
3.4. Коэффициенты корреляции признаков при сравнительной оценке методов на устойчивость к фузариозу 94
3.5. Биохимическая оценка растений огурца на основании колориметрического метода суммарного содержания фенольных соединений 97
3.6. Экономическая эффективность 99
ВЫВОДЫ 101
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ
ПРАКТИКЕ 103
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 104
ПРИЛОЖЕНИЕ 119
- Природа устойчивости растений к фитопатогенам и способы создания сортов, устойчивых к болезням
- Растительный материал
- Стерилизация семян и сегментов растений огурца для введения в культуру in vitro
Введение к работе
Решение большинства практических задач селекции во многом может определяться эффективностью вовлечения современных методов в селекционный процесс. Значительное место в решении этих задач занимает клеточная селекция, основанная на отборе клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору, и регенерации из них растений (Поляков А.В., 2003; Калашникова Е.А., 2003).
При использовании методов клеточной селекции в нашей стране и за рубежом достигнуты значительные результаты: созданы устойчивые линии люцерны (Мезенцева О.Н., 1992) и льна (Поляков А.В., 2000; Пролетова Н.В., Поляков А.В., 2003) к фузариозу; томатов (Нгуен Х.М., 1991) и моркови (Калашникова Е.А., Ипатова Н.В., 2004) к альтернариозу; картофеля - к фи-тофторозу и бактериальной гнили (Калашникова Е.А., 2000). Благодаря достижениям клеточной селекции стало возможным получение in vitro расте-ний-регенерантов с измененными признаками, среди которых селекционер может отобрать устойчивые к болезням формы и при этом сохранить положительные черты исходного образца (Бутенко Р.Г., 1999). Однако, несмотря
на определенные успехи, имеющиеся в селекции огурца, до настоящего времени не созданы сорта и гибриды, устойчивые к фузариозному увяданию. В связи с этим необходимо шире использовать в селекционном процессе методы in vitro.
Большая роль по увеличению урожайности огурца, улучшению качества и стабильности урожая отводится селекции. Снижение урожайности на 30
- 50 % является следствием широко распространенного и вредоносного за
болевания - фузариоз. Ее вызывает ряд патогенов, основными из них явля
ются грибы рода Fusarium: F. oxysporum, F. solani. Провоцируют болезнь
резкие перепады температуры воздуха, переувлажнение почвы, пониженная
температура. Источником инфекции являются компосты, рассадные смеси,
недостаточно продезинфицированные грунты, растительные остатки, а также
семена, где патоген находится в состоянии глубокого покоя. Причиной забо
левания являются в основном фитотоксичные выделения возбудителя забо
левания - несовершенного гриба F. oxysporum, вызывающие нарушения фи
зиологического гомеостаза растений. Реже наблюдается трахеомикозная за
купорка сосудов проводящей системы, приводящая к увяданию и гибели рас
тений из - за нарушений водного обмена. (Будынков Н.И. и др., 1999; На-
стенко Н.В. и др., 1994; Юрина О.В., 1986).
Традиционным методом селекции огурца на повышенную устойчивость к фузариозу является отбор устойчивых растений из гибридов и сортов в фазе первого настоящего листа на искусственном инфекционном фоне. Этот метод хорошо себя зарекомендовал, но он остается трудоемким и длительным.
Одним из путей решения этой проблемы является получение растений
- регенерантов, характеризующихся повышенной устойчивостью к фузари
озному увяданию. Их создание возможно с использованием методов биотех
нологии.
Исходя из вышеописанных проблем, целью исследований являлось усовершенствование методов in vitro применительно к культуре огурца для повышения эффективности селекционного процесса этой культуры и создания форм, характеризующихся повышенной устойчивостью к фузариозу.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- оптимизировать факторы, влияющие на морфогенетическую способность
эксплантов огурца;
разработать селективные условия для создания in vitro тканевых культур, устойчивых к фильтрату культуральной жидкости (ф.к.ж.) гриба Fusarium oxysporum и фузариевой кислоте (ф.к.);
усовершенствовать элементы методики экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанные на проращивании семян на ф.к.ж. гриба F. oxysporum и культивировании проростков in vitro на селективных средах, содержащих ф.к.ж. гриба F. oxysporum;
оценить полученные от гибридов и линий формы огурца на устойчивость к фузариозу на искусственном инфекционном фоне с использованием традиционных методов.
Объект исследований - методы культуры ткани и органов в селекции огурца и методы селекции на устойчивость к фузариозу.
Предмет исследований - каллус, почки, побеги, сегменты растений, растения - регенераты, семена огурца.
Научная новизна работы. Усовершенствована методика экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанная на культивировании семян и растений на ф.к.ж. и селективной среде, содержащей ф.к.ж. гриба F. oxysporum в концентрации 10 % в условиях in vitro, позволяющая в течение 12 и 14 суток оценить селекционный материал и выделить образцы с повышенной устойчивостью к фузариозу.
Усовершенствован метод клеточной селекции in vitro, основанный на ступенчатом культивировании эксплантов и трансплантов огурца на селек-
тивной среде, содержащей ф.к.ж. гриба F. oxysporum в концентрации 10 % и на среде без селективного фактора, позволяющий получать каллусные линии растения огурца с повышенной устойчивостью к фитопатогену.
Оптимизированы условия получения растений-регенерантов огурца. Подобран режимы стерилизации семян и сегментов растений для введения в культуру in vitro. Определено соотношение фитогормонов в питательной среде для культивирования эксплантов и трансплантов.
Практическая ценность работы состоит в том, что оптимизирован процесс получения растений - регенерантов огурца in vitro на основе верхушечных почек, гипокотильных сегментов и каллуса. Получены растения - регенераты, характеризующиеся повышенной устойчивостью к фузариозу. Разработаны и опубликованы методические рекомендации «Получение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию методами in vitro» (2006 г.).
Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.
Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены или представлены на III Международной конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова (Москва, 2003), Международной научно - практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» (Москва, 2004), Международной научно - практической конференции «Проблемы научного обеспечения овощеводства юга России» (Краснодар, 2004), III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2006).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
элементы технологии получения растении-регенерантов огурца в условиях in vitro;
система селективных условий для создания in vitro тканевых культур, устойчивых к ф.к.ж. гриба F. oxysporum и ф.к.;
усовершенствованный метод экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу.
Публикации результатов исследований. По результатам исследований по теме диссертации опубликовано 8 работ. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы, содержащего 155 наименований, в том числе 37 иностранных авторов и приложений.
Диссертационная работа изложена на 133 страницах, иллюстрирована 22 таблицами, 20 рисунками.
Природа устойчивости растений к фитопатогенам и способы создания сортов, устойчивых к болезням
Для всех сельскохозяйственных культур полезность нового сорта зависит, прежде всего, от его урожайности и качества продукции; поэтому, как правило, более высокие урожайность и качество - это две важнейшие цели селекции. Устойчивость к болезням является важной дополнительной целью, потому что следствием высокой восприимчивости, обычно, бывает снижение урожаев и качества продукции. Устойчивость - это любой исследуемый признак растения - хозяина, ослабляющий влияние паразита. Паразит - это организм или вирус, обитающий на другом живом организме или внутри него и получающий за счет этого некоторые преимущества без какой - либо компенсации хозяину. Большинство растений иммунно (полностью устойчиво) к большинству паразитов. Растение восприимчиво к патогенному организму, который может поражать его, но существуют разные степени восприимчивости. Устойчивость может сопровождаться такими прилагательными, как высокая, средняя или низкая, потому, что может иметься вся шкала переходов от крайней устойчивости к крайней восприимчивости. Растения, зараженное в такой же степени, как и другие, но менее пострадавшее (в отношении урожая или качества продукции) в результате этого, называют выносливым (толерантным) (Рассел Г.Э., 1982; Robinson R.A., 1976). Установлено несколько типов устойчивости, и их классифицировали различным образом. Например, механизм наследования был использован для различения трех основных типов устойчивости: моногенной, олигогенной и полигенной, в которых устойчивость контролируется соответственно одним, немногими или многими генами (Рассел Г.Э., 1982).
Растительный материал
В качестве объекта исследований использовали 12 образцов огурца селекции ГНУ ВНИИО, характеризующиеся различной полевой устойчивостью к фузариозу: высокоустойчивые - гибриды Fj Натали, Норд, Тополек; средне-устойчивые - гибриды Fi Восход, Кристалл, Костик, Дуняша, Рябинушка; слабоустойчивый - гибрид Fi Зодиак; среднеустойчивые линии: Л - 138, Л -340 и восприимчивая линия Л - 113. Семена образцов огурца были предоставлены заведующей лабораторией тыквенных культур отдела селекции ГНУ ВНИИО, кандидатом с. - х. наук Н.К. Бирюковой.
Натали F] - Включен в Госреестр по 2 - й световой зоне, устойчивый к фузариозу. Рекомендуется для выращивания в весенне - летнем обороте (пленочные теплицы). Пчелоопыляемый с частичной партенокарпией, салатный, консервный. В плодоношение вступает на 48 - 50 день после полных всходов. Растение полудетерминантное, среднеплетистое, среднеоблиствен-ное, преимущественно женского типа цветения. Вкус хороший. Горечь от-сутствует. Товарная урожайность 13-18 кг/м , ранняя 6 кг/м . Выход товарной продукции 92 - 95 %. Ценность гибрида: стабильная урожайность, короткоплодность, устойчивость к неблагоприятным погодным условиям, хорошие вкусовые качества продукции, устойчив к оливковой пятнистости, бактериозу, бурой пятнистости листьев, толерантен к аскохитозу, мучнистой и ложной мучнистой росе, корневым гнилям. Пригоден для выращивания во втором обороте зимних теплиц (Бирюкова Н.К., 1996, 2001; Литвинов С.С., 2002). Восход Fi - Включен в Госреестр по Российской Федерации для садово - огородных участков, приусадебных и мелких фермерских хозяйств для выращивания в весеннее - летнем обороте (пленочные укрытия). Пчелоопыляе-мый, с частичной партенокарпией, универсального использования. В плодоношение вступает на 49 - 50 - е сутки после полных всходов. Вкусовые каче-ства отличные. Урожайность 7,5 кг/м . Ценность гибрида: отличные вкусовые качества зеленцов, пригодность их для засола и консервирования, устойчивость к кладоспориозу, вирусу огуречной мозаике, толерантен к мучнистой росе, ложной мучнистой росе, бактериозу, бурой пятнистости листьев, корневым гнилям (Бирюкова Н.К., 2001; Литвинов С.С., 2002).
Стерилизация семян и сегментов растений огурца для введения в культуру in vitro
Цель этого этапа - получение стерильных проростков и эксплантов для исследования морфогенетической активности образцов огурца. Стерилизация необходима для удаления с поверхности семян и сегментов вегетирующих растений инфекции, которая может развиться при дальнейшем культивировании эксплантов in vitro и вызвать поражение и гибель растительного материала.
Наши исследования показали, что использование в качестве стерилизующего вещества гипохлорита натрия в концентрации 1% при экспозиции 30 мин привело в дальнейшем к полной потере всхожести анализируемых семян. Причем во время стерилизации наблюдалось изменение обычной окраски семян огурца от светло - желтой до темно - коричневой, т.е. своеобразный некроз. В связи с этим экспозицию воздействия стерилизующего вещества на семена огурца снизили до 15 и 20 минут.
Проведенные исследования позволили подобрать режим стерилизации и получить стерильные проростки. Так, наибольшее число стерильных про ростков (86,7 %) было получено при стерилизации семян 1% раствором гипохлорита натрия в экспозиции 15 мин. При стерилизации семян огурца 1% раствором гипохлорита натрия в экспозиции 20 мин. стерильных проростков было получено в 2 раза меньше (44,2 %). В результате проведенных исследований не выявлено существенных различий между изучаемыми образцами огурца
