Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 Биологическая характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота 10
1.2 Изучение методов диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота 16
1.3 Биотехнологические закономерности устойчивости и восприимчивости к персистентному лимфоцитозу 21
1.4 Главный комплекс гистосовместимости-МНС (Major Histocompatibility Complex) 22
1.4.1 История изучения МНС 24
1.4.2 Генетика МНС 27
1.4.3 Функция МНС 28
1.4.4 Биотехнология устойчивости и восприимчивости к лейкозу
в зависимости от полиморфизма гена BoLA-DRB3.2 31
1.5 История и биотехнология методов полимеразной цепной реакции (ПЦР), полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ) 36
1.6 Влияние полиморфизма гена каппа-казеина на технологические свойста молока 40
2. Материалы и методы исследований 44
3. Исследование биотехнологических аспектов молекулярно-генетических методов 57
3.1 Разработка схемы исследований 57
3.2 Исследование ингибирующих свойств антикоагулянтов на ход ПЦР 58
3.3 Подбор оптимальных температурно-временных режимов ПЦР 60
3.4 Определение оптимальной концентрации реагентов 62
3.5 Модификация диагностики лейкоза методом ПЦР 65
3.6 Совершенствование метода ПДРФ при установлении генотипов по BoLA-DRB3.2 66
3.7 Сравнительная оценка эффективности ПЦР при диагностике лейкоза 73
4. Изучение влияния гена BoLA-DRB3 на иммунитет к лейкозу и гена капа-казеина на молочную продуктивность 77
4.1 Результаты типирования животных по гену BoLA-DRB3.2 77
4.2 Влияние полиморфизма гена BoLA-DRB3.2 на иммунитет к лейкозу 80
4.3 Влияние генотипа по локусу BoLA-DRB3.2 на уровень молочной продуктивности 81
4.4 Сравнительная характеристика продуктивности здоровых, инфицированных и больных животных 85
4.5 Определение аллельных вариантов гена каппа-казеина 85
4.6 Связь аллельных вариантов гена каппа-казеина с молочной продуктивностью 87
4.7 Экономическое обоснование исследований 89
4.7.1 Экономическая эффективность диагностики ВЛКРС методом ПЦР 89
4.7.2 Экономический эффект от внедрения маркера
устойчивости к лейкозу 94
4.7.3 Экономический эффект от внедрения маркера каппа-казеина 96
5. Заключение 99
ВЫВОДЫ 106
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ 109
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 11 о
ПРИЛОЖЕНИЯ 129
- Биологическая характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота
- Материалы и методы исследований
- Разработка схемы исследований
Введение к работе
Актуальность исследований
В структуре инфекционной заболеваемости КРС лейкоз занимает лидирующее место. Это заболевание, этиологическим агентом которого является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), наносит значительный экономический ущерб животноводству.
На сегодняшний день возможность инфицирования человека этим вирусом не доказана, однако имеются данные о том, что ВЛКРС (BLV -bovine leukemia virus) имеет эволюционное родство с Т- лимфотропными вирусами человека I и II типов (HTLV I, HTLV II) и некоторую степень гомологии с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Необходимо отметить, что все вышеперечисленные вирусы относятся к одному семейству - ретровирусы (retroviridae).
В последние годы установлены случаи, когда вирусы, ранее от животных не передававшиеся человеку, приобретали такую способность. Например, возбудителем тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС - атипичная пневмония) - Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS), является мутантный штамм коронавируса, выделенный от азиатских виверр.
Показательной также в этой связи является ситуация с вирусом гриппа птиц (influenza virus). Из множества штаммов этого вируса один - H5N1 передается человеку, причем зачастую с летальным исходом.
ВЛКРС зафиксирован во всех районах Ставропольского края. По данным диагностики с использованием реакции иммунодиффузии (РИД), на сегодняшний день инфицированность составляет: в Арзгирском, Нефтекумском, Предгорном районах - до 10%; в Апанасенковском, Ипатовском, Курском, Степновском, Советском, Туркменском районах - до 20%; в Андроповском, Александровском и Новоселицком районах - до 30%; в Благодарненском, Буденновском, Георгиевском, Грачевском, Изобильненском, Кочубеевском, Красногвардейском, Кировском, Левокумском, Минерал овод ском, Новоалександровском, Петровском, Труновском, Шпаковском районах - более 30% от общего поголовья КРС.
В настоящее время диагностика лейкоза КРС проводится с использованием реакции иммунодиффузии (РИД) и гематологическим методом (ГЕМ). Однако они не позволяют выявить заболевание на ранних стадиях. Поэтому представляло интерес изучить возможность использования метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в данном направлении.
Нет полной ясности в формировании иммунного ответа на ВЛКРС. В связи с вышеизложенным, особую актуальность приобретают исследования с использованием биотехнологических и молекулярно-генетических методов, направленные на изучение механизма генетической устойчивости, предрасположенности к лейкозу КРС. Для использования методов ПЦР и полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ), в наших исследованиях потребовалась их модификация с последующей отработкой технологических параметров.
Работа выполнена в соответствии с планами научных исследований Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства по теме, зарегистрированной под № 01.200.110987 гос. регистрации. Цель и задачи исследований
Цель диссертационной работы - установить оптимальные технологические параметры биотехнологических и молекулярно-генетических методов с целью диагностики ВЛКРС и изучения полиморфизма генов BoLA-DRB3.2 и каппа-казеина.
В связи с этим программа исследований включала решение следующих задач:
- опытным путем установить концентрации компонентов, входящих в состав ПЦР, и температурно-временные режимы ПЦР для обеспечения максимального выхода и специфичности ПЦР-продукта;
- определить сравнительную эффективность диагностики лейкоза КРС методами ПЦР, РИД, ГЕМ;
- усовершенствовать анализ полиморфизма длин рестриктных фрагментов при изучении ДНК-полиморфизма второго экзота гена DRB3 главного комплекса гистосовместимости; выявить животных, чувствительных и устойчивых к инфекции, вызываемой ВЛКРС;
- установить взаимосвязь полиморфизма генов BoLA-DRB3.2 и каппа казеина с молочной продуктивностью КРС;
- установить экономическую рентабельность от внедрения в практику методов молекулярной биологии.
Научная новизна исследования
Усовершенствован метод ПДРФ при определении ДНК-полиморфизма гена BoLA-DRB3.2, с использованием дополнительной рестриктазы Bst2UI. Обоснована эффективность использования усовершенствованного ПДРФ-метода при изучении механизма клеточного иммунитета на ВЛКРС.
Предложен модифицированный метод выявления ДНК-провируса ВЖРС на основе ПЦР. Показана целесообразность использования данного метода в диагностике BLV. Установлены оптимальные температурно-временные режимы и концентрации компонентов, входящих в состав реакции при амплификации участков исследуемых генов.
Проведен анализ влияния аллельных вариантов гена BoLA-DRB3.2 и каппа казеина на уровень молочной продуктивности животных. Установлена статистически достоверная взаимосвязь между генотипами по BoLA-DRB3.2 и уровнем молочной продуктивности. Доказано, что уровень экспрессии гена каппа-казеина статистически достоверного влияния на молочную продуктивность не оказывает. Практическая значимость и реализация результатов исследований
Доказано, что усовершенствованный метод рестриктного анализа обладает высокой разрешающей способностью при исследовании полиморфизма гена BoLA-DRB3.2. Данное усовершенствование позволяет с высокой точностью выявлять животных, чувствительных к гематологической стадии лейкоза. Доказана возможность выявления инфицированных животных на ранних стадиях заболевания методом ПЦР, до образования у них антител к ВЛКРС. Результаты исследований внедрены в племенных хозяйствах Ставропольского края (акт б/н от 14.10.2005 г.) и в лабораторной практике ГНУ СНИИЖК (акт б/н от 10.09.2005 г., акт б/н от 24.03.2006 г,). Внедрение в хозяйствах позволило сократить прямые потери, связанные с выбраковкой животных по причине лейкоза. В лабораторной практике произошло снижение затрат на проведение исследований и повышение точности интерпретируемых результатов.
Авторами разработаны, изданы и внедрены «Методические рекомендации по применению методов ДНК-диагностики в селекции КРС» в племенных хозяйствах Ставропольского края (акт б/н от 06.05.2006 г.). Рекомендации рассмотрены и утверждены на ученом совете ГНУ СНИИЖК 26.12.2005 г., протокол №5. На защиту выносятся следующие положения
1. Действие ВЛКРС на организм зависит от генетических особенностей животного.
2. Предлагаемые технологические параметры ПЦР позволяют применять данный метод для диагностики ВЛКРС на ранних стадиях инфицирования животных.
3. Усовершенствованный метод рестриктного анализа увеличивает степень точности выявления животных, чувствительных к лейкозу.
4. Внедрение в практику животноводства биотехнологических и молекулярно-генетических методов позволяет повышать рентабельность производства.
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались на региональной конференции «Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики» (Ставрополь, 2005 г,), на международной научно-практической конференции
«Животноводство - продовольственная безопасность страны» (Ставрополь, 2006 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Здоровые города: роль межсекторального сотрудничества в сохранении и укреплении здоровья населения» (Ставрополь, 2006 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Структура и объём работы
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, предложений производству, списка использованных источников, включающего 167 работ, в том числе 80 зарубежных авторов, и приложений. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 11 рисунков.
Биологическая характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота
Название болезни «лейкоз» происходит от греческого слова LEUCOS, что означает «белый». Начало учения о лейкозе связано с именем известного немецкого морфолога Рудольфа Вирхова (1821-1902 гг.), который впервые описал болезнь у человека и выделил ее в самостоятельную нозологическую единицу под названием «лейкемия», или белокровие, поскольку белые элементы крови придают ей более или менее белую окраску. При этом автор выделил две ее формы: селезеночную, проявляющуюся увеличением селезенки и появлением в крови больных лейкоцитарных форм, и лимфатическую, характеризующуюся увеличением лимфоузлов и появлением малых клеток - лимфоцитов. Несколько позднее появились сообщения о заболевании лейкозом животных. Первый случай лейкемии у лошади описал патологоанатом Дрезденского ветеринарного института Лейзеринг в 1858 году. Зидамгродский в 1871 г. сделал сообщение о лейкемии у собак и кошек, а в 1878 году он же описал эту болезнь у крупного рогатого скота. В обзоре литературы по лейкозам животных Н. Добберштейн отметил, что лейкозом болеют 29 видов животных и 15 видов домашних и диких птиц. Есть все основания считать, что лейкоз диагностируют у всех видов млекопитающих (информация с сайта www.vetlab.spb.ru).
Доказано, что вирус лейкоза крупного рогатого скота может преодолевать межвидовой барьер. Экспериментально были заражены морские свинки, кролики, овцы, лошади, свиньи, обезьяны. На сегодняшний день возможность инфицирования человека этим вирусом не доказана (P. Creighton, A. Eggen, R. Fries, S.A. Jordan, J. Hetzel, E.P. Cunningham, P. Humphries, 1992; P.B. Облап, В.И. Глазко, АЛ. Созинов, 1998).
Лейкоз - хроническая инфекционная болезнь с длительным латентным периодом, поражающая органы кроветворной системы. Примерно у 30% животных, имеющих высокий титр антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), болезнь переходит в следующую стадию -персистентный лимфоцитоз (Ю.П. Смирнов, 1999). Развитие персистентного лимфоцитоза находится под генетическим контролем хозяина (M.J. Stear, С.К, Dimmock, M.J.T. van Eijk, L.A. Stewart-Haynes, L.E. Beever, R.L. Fernando & H.A. Lewin, 1992). Однако полной ясности в формировании иммунного ответа на ВЛКРС нет; не решена проблема совершенствования прижизненной диагностики, что позволило бы предотвратить значительные прямые потери (Н. Ammer, F-W. Schwaiger, С. Kammerbauer, 1991; Г.Е. Сулимова, 2001; В.И. Колесников, Т.И. Чайка, С.С. Абакин, 2003).
Следует отметить, что все оздоровительные мероприятия базируются на первоначальной диагностике методом РИД, который идентифицирует антитела к ВЛКРС. РИД обладает низкой чувствительностью и специфичностью, характеризуется высоким процентом ошибочных результатов (D.M. Stone, A.J. Hof, W.C. Davis, 1995; M.B. Wheeler, 1995).
Зрелые вирионы ВЛКРС состоят из расположенного в центре электронно-плотного нуклеотида, диаметр которого варьирует от 50 до 90 нм.; сердцевина вириона (cor) отделена от вирусной оболочки промежуточным слоем. Внешняя оболочка представлена двухконтурной мембраной; на её поверхности имеются шипики длиной 8-11нм. с пуговкообразными утолщениями на концах (В.М. Авилов, В.М, Нахмансон, 1995; А;Д. Белов, Г.В. Рогожина, 1997; А.Д. Альштеин, 2000). Основным биохимическим признаком семейства Retroviridae является наличие в вирионе обратной транскриптазы (ОТ) (РНК - зависимой ДНК -полимеразы) (Л.Г Бурба, 1988; Н.В. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина, 1991; Л.Б. Прохватилова, 1998).
Материалы и методы исследований
Исследования проводились в 2003-2006 гг. в хозяйствах Краснодарского, Ставропольского краев и Ростовской области. Для исследования были отобраны 185 голов КРС. Группу I составила голштинская порода КРС п=117 (приложение А). Группа II п=48 (приложение Б) представлена следующими породами; красной степной, голштинской черно-пестрой, голштинской красно-пестрой, с различной долей кровности. В группу III вошли племенные быки, использующиеся при искусственном осеменении в племенных хозяйствах Ставропольского края. Анализы проводились в лаборатории иммуногенетики, биохимии и общей химии, отдела биотехнологии ГНУ Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства, а также в лаборатории биотехнологии Северо-Кавказского НИИ животноводства.
Кровь для получения сыворотки отбирали одноразовыми шприцами в объеме 10 мл,, после чего помещали 9,5 мл. в бактериологическую пробирку, выдерживали в теплом месте в течение 2 ч. Для лучшего отделения сыворотки образовавшийся сгусток обводили стальной спицей. После этого пробирки выдерживали в течение 24 ч. при t = +4; +5С. Полученные пробы сыворотки сливали в пробирки Флоринского для последующей детекции антител к ВЛКРС методом РИД.
Для постановки РИД использовали «Набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота» (ТУ 10-19-442-87), согласно рекомендациям, прилагаемым к набору. Учет и оценку результатов реакции проводили, опираясь на «Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота» № 13-7-2/2130 от 23.08.2000 г.
Гематологический анализ проводили согласно «лейкозному ключу» ГОСТ 25382-82.
Для выделения ДНК из крови, образцы в объеме 0,5 мл. помещали в пробирку «Эпендорф» объемом 1,5 мл., содержащую 25 мкл. 1,5 М цитрата натрия. Традиционно в хозяйствах для консервации крови используются такие антикоагулянты, как: гепарин, ЭДТА, цитрат натрия. В процессе исследований было установлено, что оптимальным консервантом крови для решения поставленных задач является цитрат натрия. Пробы транспортировали в термосе при t = +4; +5С, выделение ДНК из проб проводили не позднее четырех дней со дня взятия крови.
Для выделения ДНК из образцов крови использовали наборы реагентов Diatom Prep 100 и Diatom Prep 200 ООО «Лаборатория Изоген» г. Москва. Принцип выделения ДНК наборами Diatom Prep основан на способности лизировать клетки. Из лизированных клеток ДНК сорбируется на NucleoS, состоящий из суспензии сорбента, и затем отмывается от белков и солей спиртовым раствором. После чего очищенная ДНК переводится в жидкую фазу раствором ЭкстраГена.
Выделение ДНК из крови проводили следующим образом. В пробирку объемом 1,5 мл. вносили 100 мкл. исследуемой пробы, добавляли 400 мкл лизирующего реагента и перемешивали содержимое пробирки плавным переворачивание 5-Ю раз. Выдерживали в термостате 5-7 мин при температуре t = +65 С, затем центрифугировали 10 сек. при 5000 g. Прозрачную надосадочную жидкость полностью переносили в чистую пробирку и добавляли 20 мкл. суспензии сорбента NucleoSIM . Пробирку помещали на ротатор и перемешивали 10 мин. при 20 об/мин, после чего центрифугировали 10 сек. при 5000 g. Осторожно, не задевая осадка, удаляли надосадочную жидкость с помощью вакуумного насоса. Добавляли 200 мкл. лизирующего реагента и тщательно перемешивали на вортексе до полного гомогенного состояния. Добавляли 0,5 мл. солевого буфера, перемешивали переворачиванием 5-10 раз и центрифугировали 10 мин. при 5000 g. Осторожно удаляли супернатант и повторяли отмывание осадка солевым буфером дважды. Осадок подсушивали при температуре t = + 65 С в течение 4-5 мин и вносили 50 мкл. ЭкстраГена. Суспендировали содержимое пробирки на вортексе 5-10 сек. до получения гомогенной суспензии, после чего выдерживали в термостате 4-5 мин. при t = + 65 С. В последующем центрифугировали 1 мин. при 10 000 g. Переносили супернатант с выделенной ДНК в чистую пробирку для хранения при t = -20 С.
Выделение ДНК из криоконсервированной спермы быков-производителей проводили следующим образом. Сперму размораживали. В чистую пробирку объемом 1,5 мл. вносили 300 мкл. спермы, центрифугировали 5 минут при 4000 g. К осадку добавляли 1 мл. промывочного раствора, суспендировали на вортексе до полного гомогенного состояния. Центрифугировали 5 минут при 4000 g. Удаляли супернатант с помощью водоструйного насоса. К осадку добавляли 400 мкл. лизирующего реагента. Суспендировали на вортексе и термостатировали смесь при t = + 65 С 40 минут. Затем выделение ДНК проводили аналогично методике выделения из крови.
Разработка схемы исследований
Перед началом исследований были определены основные этапы работы, к которым авторы относят: исследование ингибирующих свойств антикоагулянтов на ход ПЦР, подбор оптимальных параметров ПЦР для синтеза участков исследуемых генов, совершенствование ПДРФ анализа при установлении генотипов по BoLA-DRB3.2, сравнение методов диагностики лейкоза и оценка эффективности ПЦР, анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3.2, анализ полиморфизма гена каппа-казеина, изучение влияния полиморфизма гена BoLA-DRB3.2 на переход стадии вирусоносительства в гематологическую стадию лейкоза. Исходя из основных этапов была разработана схема исследований (рис. 3).
