Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Разработка принципов классификации биодобавок для роста растений 6
1.1. Биодобавки для роста растений на основе микробной биомассы 9
1.2. Биодобавки для роста растений на основе регуляторов роста 16
1.3. Биодобавки для роста растений на основе минеральных компонентов 31
Глава 2. Разработка метода экспертной оценки выбора биодобавок 33
2.1. Принцип разработки экспертной системы и алгоритма ее реализации на ЭВМ 33
2.2. Критерии оценки эффективности применения биодобавок для роста растений 44
Глава 3. Конструирование новой микробной биодобавки (1) и исследование ее биотехнологии 57
3.1. Подбор микроорганизмов для производства биодобавки (1) 57
3.2. Анализ влияния углеродсодержащего субстрата для культивирования микроорганизмов биодобавки 75
3.3. Исследование кинетики роста бактериальных культур и разработка рациональной технологии получения микробной биодобавки 77
3.4. Анализ влияния внесения в почву консорциума подобранных культур микроорганизмов на численность естественной почвенной микрофлоры 93
Глава 4. Разработка и исследование новой биодобавки (2) на основе регуляторов роста и микроэлементов 102
4.1. Подбор компонентного состава биодобавки и исследование
ее эффективности в лабораторных опытах 102
4.2. Изучение влияния биодобавки на качественные изменения в растениях на основе анализа метаболизма фенольных соединений 105
4.3. Технолого-аппаратурное оформление процесса получения биодобавки на основе регуляторов роста и оценка экономического эффекта 11О
Глава 5. Результаты практической реализации разработанных биодобавок 116
5.1. Экспериментальное исследование влияния применения биодобавок на рост растений 116
5.2. Сравнительная оценка эффективности разработанных биодобавок с применением экспертного подхода 117
5.3 Разработка научно-технической документации на предлагаемые биодобавки для реализации технологии их производства 120
Основные результаты и выводы 123
Список литературы 125
Приложение 1 139
- Биодобавки для роста растений на основе микробной биомассы
- Принцип разработки экспертной системы и алгоритма ее реализации на ЭВМ
- Подбор микроорганизмов для производства биодобавки (1)
Введение к работе
' Актуальность темы. Последнее десятилетие прошлого века
охарактеризовалось повышенным интересом к лекарственным и лечебно-профилактическим средствам природного происхождения. К числу наиболее популярных объектов следует отнести эфиромасличные растения, которые на протяжении многих веков применялись не только как пряности и источники парфюмерной продукции, но и как лекарственные средства.
Ведущее место среди выращиваемых эфиромасличных культур занимает лаванда, эфирное масло которой широко используется в медицине, парфюмерно-косметической, пищевой промышленности, лакокрасочном
і производстве и других отраслях.
Отечественная промышленность всегда испытывала острый дефицит в сырье эфиромасличных растений. После распада СССР ситуация с этим видом сырья для России еще больше обострилась, так как основные площади под эфиромасличными культурами были сосредоточены на юге
, Украины и в Молдове (Воронина и др., 2001). Возрастающую потребность в
эфиромасличных растениях можно удовлетворить в первую очередь с выведением новых продуктивных и генетически устойчивых сортов, содержащих высококачественное эфирное масло.
Новые возможности для селекции открываются при использовании технологии клонального микроразмножения. Высокая чувствительность каллусной культуры в сочетании с возможной изменчивостью клеток, создают реальные предпосылки для клеточной селекции. Данный метод позволяет быстро размножить уникальный генотип или новый сорт, что ускоряет его практическое использование. В настоящее время найдены условия размножения более 500 экономически важных или исчезающих видов дикорастущих растений. Многие из них размножаются уже в производственных условиях. Что касается лекарственных растений,
технологии клонального микроразмножения разработаны в отделе биологии
клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН для мандрагоры туркменской, кирказона маньчжурского, женьшеня, в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии для ряда видов раувольфии, в ВИЛАРе для стефании гладкой. Имеющиеся литературные данные о биотехнологических исследованиях эфиромасличных культур, и в частности лаванды узколистной, крайне ограничены.
В этой связи нами проведены исследования возможностей использования биотехнологических приемов в расширении генофонда исходного материала лаванды узколистной - культуры, обладающей огромным биологическим и экономическим потенциалом.
Цель и задачи исследования. Целью наших исследований было разработать и оптимизировать биотехнологию получения каллусной культуры и растений-регенерантов Lavandula angustifolia Mill.
В соответствии с целью исследования нами были поставлены следующие задачи:
разработать технологию индукции каллусогенеза Lavandula angustifolia Mill;
выявить наиболее эффективный режим стерилизации растительных эксплантов;
оптимизировать технологию получения каллусных культур Lavandula angustifolia Mill;
подобрать питательные среды для длительного культивирования каллусной ткани;
разработать технологию получения из каллусной культуры растений-регенерантов;
исследовать биологическую активность полученной клеточной культуры.
Научная новизна. Впервые разработана технология получения каллусных культур Lavandula angustifolia Mill., позволяющая получить за 20-25 дней до 1300 - 1400 мг биомассы клеток. Оптимизированный состав
питательной среды Мурасиге и Скуга для индукции каллусогенеза содержит следующий гормональный состав: 2,4Д - 1мг/л, ИУК - 0,5 мг/л, кинетин 0,5 мг/л. Подобраны оптимальные режимы стерилизации растительных эксплантов Lavandula angustifolia Mill.
Изучены физико-химические свойства полученных культур, в результате чего выяснено, что каллусная ткань лаванды узколистной содержит все биологически активные вещества, присутствующие в интактном растении.
Разработана технология длительного культивирования каллусной ткани лаванды узколистной, позволяющая поддерживать активно растущую каллусную ткань неограниченное количество времени (2,5 года).
Впервые разработана технология получения из каллусной культуры лаванды узколистной растений-регенерантов, включающая в себя семь стадий. Постепенная адаптация растений-регенерантов к естественным условиям позволило получить нам до 94,7% приживаемости.
В результате проведенных микробиологических исследований выявлена эндо- и экзогенной активности каллусных культур Lavandula angustifolia Mill. На основе каллусной культуры лаванды узколистной получен биопрепарат стимулирующий рост бифидобактерий.
Практическая ценность работы. Разработка биотехнологических методов культуры in vitro позволяет получить возможность комплексного оздоровления посадочного материала; высокий коэффициент размножения; возможность получения большого количества растений за короткий срок; возможность хранения и накопления растений для высадки в оптимальные сроки; возможность тиражирования форм, обладающих пониженной способностью к репродукции в обычных условиях и получение материала с увеличенным потенциалом к дальнейшему размножению за счет повышенной способности к ризогенезу и образованию большого числа побегов у древесных растений.
Разработка альтернативных имеющимся технологиям использования лекарственных растений становится возможной благодаря биотехнологическим методам. Использование каллусных культур в получении веществ растительного происхождения позволяет независимо от влияния климатических, сезонных и географических условий стабильно выпускать продукцию в течение года, уменьшить площади почвы, вовлеченной в хозяйственный оборот.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
технология получения каллусной культуры Lavandula angustifolia Mill, позволяющая в кроткие сроки получить необходимую клеточную биомассу;
исследование физико-химических характеристик полученной культуры, в результате которой выявлена биологическая активность каллусной культуры;
технология длительного пассирования каллусной культуры Lavandula angustifolia Mill, позволяющая поддерживать активно растущую каллусную ткань неограниченное время;
технология получения растений-регенерантов из каллусной культуры Lavandula angustifolia Mill, позволяющая получить до 94,7% приживаемости;
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научно-практических конференциях: 7-ой Пущинской школе - конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003), II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), Nova Science Publishers, Inc. New York, 2004; международной конференции "Наука и бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразия, окружающая среда, биомедицина". (Пущино 2004), 8-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004), 3-й съезд Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова
(Москва, 2005), XVIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2006).
Публикации: по теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав теоретических и экспериментальных исследований, выводов, списка литературы, включающего 173 работ, в том числе 100 работ отечественных авторов и 73 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами и 26 рисунками.
Биодобавки для роста растений на основе микробной биомассы
С давних времен человек применял почвенные микроорганизмы для повышения урожайности сельскохозяйственных культур. До появления химически связанного азота при возделывании хлебов или использовании пастбищ люди могли рассчитывать на пополнение почвы азотом только в результате деятельности микроорганизмов. На основе почвенных бактерий в XX веке были созданы такие удобрения как азотобактерин и фосфоробактерин [2, 3]. Однако опыт их применения показал, что они не являются альтернативой внесения органических или минеральных удобрений и оптимальным вариантом является применение их в качестве дополнения (биодобавки) к традиционной агротехнике возделывания сельскохозяйственных культур. В связи с этим в последние годы активно ведутся работы по изучению свойств почвенных микроорганизмов с целью использования их в интенсивном растениеводстве. Для повышения эффективности действия вносимых в почву удобрений было предложено, например, [4] введение в смесь торфа, извести и минеральных добавок, предварительно обработанной водными растворами активаторов минерализации торфа, водной суспензии бактериальных культур (бактериальные молочные культуры АМБ и азотобактера), а также суспензии дрожжей и одноклеточных водорослей [5].
Предложено [6] использование консорциума молочнокислых термофильных бактерий: Streptococcus thermophilus, Streptococcus bovis, Lactobacillus salivarius var salicinicus, Lactobacillus acidophilus. При этом, по данным авторов, урожай сельскохозяйственных культур увеличивается на 15-35%.
Известно также [7] введение в сапропель суспензии микроорганизмов в количестве 0,001 - 0,3% (по массе). Указанная суспензия содержит бактерии: азотфиксирующие (Azotobacter chroococcum), фосфаторастворяющие (Bacillus mucilaginosus) и молочнокислые в виде консорциума, содержащего
Streptococcus thermophilus, Streptococcus bovis, Lactobacillus salivariec var salicinicus, Lactobacillus salivariec var salivarus, Lactobacillus acidophilus. Дополнительно могут быть внесены Trichoderma viride, Beauveria bassiana.
Японскими авторами [8] было предложено культивировать на органическом субстрате из коралловых рифов, экскрементах домашних животных и сточных водах микроорганизмы Azotobacter vinelandii, Bacillus megaterium, Rhizobium leguminosarm, Trichoderma viride и Candida utilis. В результате получается комплексный продукт, который можно использовать для повышения урожая сельскохозяйственных культур.
Получают бактериальное удобрение, содержащее клетки таких микроорганизмов как Azotobacter vinelandii и Azospirillus brasilense [9] и жидкий микробный препарат, в состав которого входят Bacillus, Trichoderma, Saccharomyces [10].
Описано [11] получение биоудобрения, главным компонентом которого является рекомбинантный штамм Streptomyces sp. Он генетически модифицирован и включает в себя гены азотфиксации из Alcaligenes, а также гены фосфат-разлагающих бактерий Bacillus megaterium.
Меланин культуральной жидкости Bacillus thuringiensis [12] предлагается использовать для стимуляции корнеобразования на начальном этапе развития растений для усиления роста надземных частей.
Для бактеризации семян фасоли используют бактерии рода Pseudomonas [13], при этом наблюдают стимуляцию роста растений.
Разработаны биологические препараты Ризобактерин С и Фитостимофос [14] для повышения урожайности растений. Действующим началом Ризобактерина С является культура Klebsiella planticola и ее метаболиты. Культура способна фиксировать атмосферный азот, продуцировать /3-ИУК и подавлять действие корневых фитопатогенов. Фитостимофос представляет собой живую культуру и ростстимулирующие метаболиты Agrobacterium radiobacter, которая оказывает положительное действие на рост и развитие семян.
Предлагается также использовать бактерии рода Pseudomonas, обладающие ростстимулирующими свойствами и устойчивостью к тяжелым металлам, для ремедиации почв [15].
Принцип разработки экспертной системы и алгоритма ее реализации на ЭВМ
Структура любой экспертной системы включает в себя следующие компоненты: базу знаний, машину логического вывода, модуль извлечения знаний и интерфейс пользователя (рис. 3) [102].
Применительно к существу данной проблемы под базой знаний будем понимать определенным образом организованное хранилище структурированных знаний (фактов) и правил принятия решений. Тогда структурно базу знаний создаваемой системы следует разделить на базу фактов и базу правил.
База фактов представляет собой совокупность поименованных наборов статических фреймов, предназначенных для описания свойств биодобавок. Каждый набор фреймов базы фактов соответствует одной биодобавке. Количество статических фреймов может быть увеличено по мере внесения в базу знаний новых видов биодобавок. Структура слотов статических фреймов соответствует структуре свойств той или иной биодобавки. При этом следует различать наименование слотов и их содержимое. Наименование слота соответствует наименованию свойства биодобавки, а содержимым слота является значение рассматриваемого свойства.
База правил представляет специфику причинно-следственных отношений между фактами данной предметной области. Для описания правил используются различные модели представления знаний: логические модели, в том числе, исчисление предикатов; продукционные модели; фреймы: семантические сети и др. Наиболее распространенной формой представления правил является исчисление предикатов и продукционные модели. Эта форма была принята нами за основу при построении экспертной системы.
Машина логического вывода - это подсистема экспертной системы, которая предназначена для формирования упорядоченной совокупности блоков принятия решений и данных, необходимых для решения каждой конкретной задачи. Набор блоков принятия решений представляет собой совокупность поименованных фреймов, предназначенных для представления правил выбора решений: по эквивалентности; по предпочтению; по соответствию свойств; для представления утверждений.
Интерфейс пользователя - наиболее функционально насыщенная подсистема экспертной системы. Она предназначена для: управления диалоговой средой конечного пользователя; организации функционирования машины логического вывода и модуля исчисления значений; управления процессом выбора биодобавки или создания новой; решения задач выбора биодобавки путем запуска на выполнение цепей блоков принятия решений, сформированных машиной логического вывода.
Подбор микроорганизмов для производства биодобавки (1)d
При разработке микробной биодобавки в качестве базового выражения использовали Бопт = (Бі + Б2 + ...)-» max . При этом, в целях достижения максимального эффекта применения состав препарата должен обеспечивать повышение урожайности и качества с/х культур, обогащать прикорневой слой растений легкодоступными соединениями азота, фосфора и калия. По этим критериям на основании литературных данных в качестве микроорганизмов продуцентов были выбраны свободноживущие фиксаторы атмосферного азота Azotobacter chroococcum и Beijerinckia fluminensis, почвенные бактерии Bacillus megaterium, разлагающие труднодоступные соединения фосфора и Bacillus mucilaginosus, переводящий в легкоусвояемую растениями форму соединения калия. Все четыре культуры продуцируют также стимуляторы роста растений.
Культуры для работы были получены из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ).
Все четыре вида микроорганизмов широко известны и описаны в различных определителях и методических пособиях, обобщенный материал которых и собственные исследования представлены в морфолого-физиологических картах культур. Собственные исследования касались изучения морфолого-культуральных свойств штаммов, при выращивании их на различных средах и изучения физиологии микроорганизмов, как основы для разработки технологии для производства биомассы. Azotobacter chroococcum. Azotobacter chroococcum - свободно живущий в почве микроорганизм, фиксирующий азот атмосферы, был открыт голландским микробиологом М.Бейеринком в 1901 году. Бактерии рода Azotobacter широко распространены в различных почвах, водоемах и каналах [103].
Морфологические признаки Azotobacter chroococcum. Клетки в молодых (односуточных) культурах палочковидные, 3-7 х 1,5-2,5 мкм, иногда 8-10 мкм длины, подвижные с перитрихиальными жгутиками; в старых культурах они кокковидные, соединены в пары, тройки и сарциноподобные пакеты, окружены обычно слизистой уплотненной оболочкой. Образует характерные инцистированные клетки, т.е. клетки с утолщенной оболочкой. Внутри клеток содержится большое количество блестящих зерен питательного запасного вещества. Эти зерна заполняют полностью или почти полностью всю клетку. Организм склонен к резко выраженному полиморфизму. При неблагоприятных условиях клетки инволюционируют, сильно раздуваются, приобретая различные формы и размеры [104].
Бактерии рода Azotobacter описаны в Определителе бактерий Берджи как крупные клетки овальной формы, диаметром 1,5-2,0 мкм, плеоморфные от палочковидных до кокковидных. Располагаются одиночно, парами или группами неправильной формы, иногда в виде цепочек. Эндоспор не образуют, но образуют цисты. Грамотрицательные. Подвижные за счет перитрихиальных жгутиков или неподвижные. Аэробы, но могут также расти при пониженном парциальном давлении кислорода [105].
В качестве запасного вещества Azotobacter chroococcum синтезирует поли /3-оксимасляную кислоту. Может вырабатывать большие количества капсульной полисахаридной слизи, особенно на средах с NaCl.
