Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
1. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА
ДІМСЕШКЦИИЗЕРНОВЬГХКОЛОСОВЬГХ КУЛЬТУР 14
1.1. Проблема создания исходного материала и использования генетических
ресурсов ДИКИХ ВИДОВ ПШеНИЦЫ И ЭГИЛОПСОВ В СелеКЦИИ ЗерНОВЫХ КОЛОСОВЫХ
культур 14
1.2. Пути расширения генетической изменчивости и использование метода
эмбриокультуры для улучшения генофонда зерновых колосовых культур 20
Добавление к геному пшеницы целого генома растений родственного или отдаленного вида 21
Замещение генома D мягкой пшеницы геномами диплоидных видов пшеницы, эгилопсов и ржи 22
Добавление к полному набору хромосом пшеницы отдельной пары хромосом (дополненные линии) 24
Замещение отдельных хромосом пшеницы хромосомами других видов (замещенные линии) 27
1.2.5. Замещение отдельных участков хромосом пшеницы участками
чужеродных хромосом, несущих гены полезных признаков
(транслокации) 30
1.3. Получение гаплоидов и их использование в качестве исходного
материала для селекции растений 33
Классификация гаплоидов и методы их получения 33
Факторы, влияющие на процессы андрогенеза при культивировании пыльников зерновых культур 36
1.3.3. Значение и перспективы использования гаплоидных технологий в
селекции зерновых культур 44
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 48
2.1 Материал и схема получения гибридов, амфидиплоидов, геномно-
замещенных форм и гомозиготных линий пшеницы 48
2.2 Методы исследования 49
3. СОЗДАНИЕ ГЕНОМНО-ЗАМЕЩЕННЫХ ФОРМ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ,
МЕЖВИДОВЫХ И МЕЖРОДОВЫХ АМФИДИПЛОИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ЭМБРИОКУЛЬТУРЫ IN VITRO 61
3.1. Получение гексаплоидных геномно-замещенных форм {In = 42) пшеницы на основе тетраплоидных компонентов АВ Tr. aestivum L. и
диплоидных видов пшеницы, эгилопсов и ржи 61
3.1.1. Цитогенетическое изучение межвидовых и межродовых гибридов Fi,
геномно-замещенных форм и их гибридов с мягкой пшеницей 68
3.1.1.1. Определение чисел хромосом в соматических клетках межвидовых
и межродовых гибридов Fi и геномно-замещенных форм 68
3.1.2 Исследование скрещиваемости геномно-замещенных форм с мягкой
пшеницей 74
3.2. Создание межвидовых и межродовых амфидиплоидов с использованием
эмбриокультуры in vitro 77
3.2.1.Синтез гомолога мягкой пшеницы с геномным составом AbGD
(2и=42) 78
3.2.2. Получение тетраплоидных амфидиплоидов (2п = 28) с различными
геномными составами 79
3.3. Получение озимых гексаплоидных (2п = 42) форм тритикале 81
Влияние генотипа твёрдой пшеницы и ржи на завязывание зёрен...83
Влияние генотипа твердой пшеницы и ржи на развитие зародышей в гибридных зерновках 86
Влияние генотипа твёрдой пшеницы и ржи на развитие зародышей на питательной среде 90
Удвоение генома гибридных растений F/ от скрещивания твердой пшеницы с рожью 95
4.П0ЛУЧЕНИЕГАПЛ0ИД0ВИГОМОЗИГО1НЫХЛИНИЙ ПРИКУЛЬТИВИЮВАНИИ ПЫЛЬНИКОВ ПШЕНИЦЬІ И ЭГИЛОПСОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ УСКОРЕННОЙ
ТЕШОЛОШИ(^1ЕКЦИОННОГОПЮЦЕССА 98
4.1. Норма реакции образования эмбриоидов и регенерантов при
культивировании пыльников различных сортов, видов пшеницы и
эгилопсов 98
4.1.1. Образование эмбриоидов при культивировании пыльников озимых
сортов мягкой пшеницы 98
4.1.2. Образование эмбриоидов и регенерация растений при
культивировании пыльников яровых сортов мягкой пшеницы 101
Изучение видовых особенностей образования эмбриоидов при культивировании пыльников представителей родов Triticum и Aegilops ПО
Регенерация растений из эмбриоидов у представителей родов пшеницы и эгилопсов 114
Оптимизация с использованием метода планирования эксперимента состава питательных сред для получения эмбриоидов при культивировании пыльников озимой мягкой пшеницы и последующей регенерации из них растений 119
Оптимизация с использованием метода планирования эксперимента компонентов питательных сред для получения эмбриоидов при культивировании пыльников яровой мягкой пшеницы и последующей регенерации из них растений 131
4.1.7. Оптимизация компонентов питательных сред для образования
эмбриоидов и регенерации растений при культивировании пыльников
диплоидных видов пшеницы Tr. urartu (геном А"), эгилопса Ае. squarrosa
(геном D) и синтезированного тетраплоидного амфидиплоида Tr. erebuni
(AUD) 145
4.1.8. Получение эмбриоидов и регенерантных растений озимой пшеницы
при культивировании пыльников гибридов F] 149
4.2. Статистические закономерности образования эмбриоидов при
культивировании пыльников сортов и гибридов F] мягкой пшеницы 160
Идентификация по уровню плоидности регенерантов, полученных при культивировании пыльников пшеницы и эгилопсов 186
Цитоэмбриологическое исследование жизнеспособности микроспор и развития из них эмбриоидов в процессе культивирования пыльников пшеницы и эгилопсов 196
4.4.1. Определение жизнеспособности микроспор в процессе культивирования
пыльников пшеницы и эгилопсов 198
4.4.2. Пути развития микроспор в процессе культивирования пыльников
различных видов пшеницы и эгилопсов 203
5. СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА
И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ 212
5.1. Селекционно-генетическая оценка исходного материала, полученного в
результате межвидовой и межродовой гибридизации с применением метода
эмбриокультуры 212
5.2. Селекционно-генетическая оценка гомозиготных линий озимой
пшеницы, полученных при культивировании пыльников гибридов Fj 219
ВЫВОДЫ 235
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ 239
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 240
ПРИЛОЖЕНИЯ
,267
Введение к работе
Для успешного осуществления современных программ селекции зерновых колосовых культур важное значение имеет проблема поиска и создания нового исходного материала. Значение нового исходного материала особенно возросло в последние годы в связи с приближением к пределу биологической продуктивности зерновых колосовых культур и ограничением генетических ресурсов внутривидовой гибридизации, в особенности по генам устойчивости к болезням и вредителям и по генам качества зерна.
В реализации биологического потенциала урожайности зерновых культур актуальной проблемой является создание нового исходного материала и эффективных методов переноса новых генов устойчивости к грибным, бактериальным и вирусным болезням, генов определяющих высокое содержание и качество белка в зерне в геном растений современных сортов, а также ускоренное получение гомозиготных линий из гибридных популяций в культуре пыльников.
Источником новых эффективных генов для расширения генофонда мягкой пшеницы могут служить ее ближайшие сородичи - диплоидные и тетраплоидные виды пшеницы, а также виды родов Aegilops, Agropyron, Secale, Haynaldia, Elymus и др. Однако перенос генетического материала этих видов и родов в геном мягкой пшеницы традиционными методами селекции осложняется наличием прогамной и постгамной несовместимости.
Для преодоления барьера нескрещиваемости был использован метод эмбриокультуры, а для переноса генов родственных и отдаленных родов в геном мягкой пшеницы был предложен новый метод создания исходного материала. Принципиальное отличие этого метода от других заключается в создании гексаплоидных амфидиплоидов, сочетающих геномы АВ мягкой пшеницы и геномы диплоидных видов пшеницы, эгилопсов, ржи и пырея. Это дает возможность эффективно переносить генетический материал чужеродных
диплоидных видов в геном мягкой пшеницы путем скрещивания мягкой пшеницы с гексаплоидными амфидиплоидами различного геномного состава.
В решении проблемы получения гомозиготных линий из гибридных комбинаций для ускорения селекционного процесса основную роль играет разработка методов оптимизации компонентов питательных сред и изучение закономерности образования эмбриоидов и регенератов при культивировании пыльников пшеницы.
Цель исследования заключалась в создании и изучении геномно-замещенных форм мягкой пшеницы, межвидовых и межродовых амфидиплоидов различного геномного состава, разработке метода переноса чужеродных генов в геном мягкой пшеницы; получении и исследовании гаплоидов и гомозиготных линий в культуре пыльников сортов и гибридов Fj мягкой пшеницы для создания ускоренной технологии селекционного процесса.
В связи с поставленной целью решали следующие задачи:
Создать гексаплоидные геномно-замещенные формы пшеницы (2п = 42) на основе тетраплоидных компонентов АВ Tr. aestivum L. и диплоидных видов пшеницы, эгилопсов и ржи.
Провести цитогенетическое исследование соматических и генеративных клеток гибридов F], геномно-замещенных форм и их гибридов с мягкой пшеницей.
Получить тетраплоидные амфидишюиды (2я = 28) между диплоидными видами пшеницы и эгилопсами секции Sitopsis.
С интезировать гомолог мягкой пшеницы с геномным составом AbGD (2п = 42).
Исследовать влияние генотипа твердой пшеницы и ржи на развитие гибридных зародышей в культуре in vitro в процессе получения озимых гексаплоидных форм тритикале (2п = 42).
Изучить норму реакции образования эмбриоидов и регенерантов в культуре пыльников различных видов пшеницы и эгилопсов.
Оптимизировать компонентный состав питательных сред с использованием метода планирования эксперимента для получения максимального количества эмбриоидов в культуре пыльников мягкой пшеницы.
8. Выявить закономерности образования эмбриоидов в культуре пыльников
сортов и гибридов F/ мягкой пшеницы.
9. Разработать экспресс-метод определения уровня плоидности по длине
замыкающих клеток устьиц регенерантов, полученных в культуре
пыльников мягкой пшеницы и эгилопсов.
Ю.Исследовать жизнеспособность, динамику роста и цитоэмбриологические пути развития микроспор в процессе культивирования пыльников различных видов пшеницы и эгилопсов на питательной среде.
Научная новизна. Впервые было получено 27 гексаплоидных геномно-замещенных яровых и озимых форм пшеницы (2п = 42), сочетающих геномы АВ мягкой пшеницы с геномами А диплоидных видов пшеницы (Тг. boeoticum, Тг. топососсит, Тг. sinskajae); геномами S (Ае. speltoides), ІЇ (Ае. scharonensis), U (Ае. wnbellulata), If (Ae. uniaristata) диплоидных видов эгилопсов; геномом R (S. cereale).
Впервые создан гомолог мягкой пшеницы Тг. miguschovae с геномным составом AbGD, несущий гены комплексной устойчивости к грибным болезням и легкого обмолота от Тг. militinae.
Впервые получены 7 тетраплоидных амфидиплоидов {In = 28) с различным геномным составом: Ае. speltoides х Тг. sinskajae, (Sa3) Ае. sharonensis хТг. urartu (SA1), Ае. sharonensis xTr. boeoticum (SA), Ae. sharonensis xTr. .топососсит (SA), Ae. sharonensis xTr. sinskajae (SA ), Ae. bicornis xAe. squatrosa (S^D) яАе. squarrosa xTr. boeoticum (DAb).
Впервые исследован процесс конъюгации хромосом в мейозе геномно-замещенных форм и их гибридов с мягкой пшеницей и показана возможность прямой интрогрессии генетического материала диплоидных видов пшеницы, эгилопсов и ржи в геном мягкой пшеницы.
Установлена степень влияния генотипов твердой пшеницы и ржи на развитие изолированных гибридных зародышей, созданных с их участием, в процессе их культивирования на питательной среде.
Впервые в одном генотипе первичного амфидиплоида АД Зеленый удалось объединить высокий уровень зерновой продуктивности, высокое
8 содержание белка в зерне и зеленой массе, устойчивость к полеганию и
высозимоморозостойкость.
Выявлена наследственная норма реакции образования эмбриоидов и регенерантных растений в культуре пыльников 20 сортов яровой мягкой пшеницы в зависимости от условий выращивания донорных растений (в ростовой камере, теплице и полевых условиях), 23 сортов озимой мягкой пшеницы и 38 образцов диких видов пшеницы и эгилопсов различного геномного состава.
Определены оптимальные сочетания и концентрации фитогормонов в питательных средах для получения максимального количества эмбриоидов и регенерантов от числа инокулированных пыльников озимой (32,5 % и 40,9 %, соответственно) и яровой мягкой пшеницы с геномами ABD (42,8 % и 49,3 %, соответственно), а также видов диплоидной пшеницы Tr. urartu с геномом А" (20,2 % и 15 %, соответственно) и синтезированного тетраплоидного амфидиплоида Tr. erebuni с геномами AD (42,2 % и 10 %, соответственно).
Впервые установлены закономерности образования эмбриоидов в культуре пыльников сортов и гибридов Fj мягкой пшеницы: вариационные ряды значений образования эмбриоидов конкретного сорта или гибрида F{ подчиняются нормальному закону распределения, распределение наборов сортов или гибридов F] по среднему значению образования эмбриоидов соответствует показательному закону.
На основе статистических параметров (X, а и Sx) распределения длины замыкающих клеток устьиц (ДЗКУ) определены границы доверительного интервала двух независимых выборок генеральной совокупности регенерантов, полученных в культуре пыльников сортов и гибридов Fi озимой мягкой пшеницы: для гаплоидов 33,7-f54,9 мкм, диплоидов 42,5 н-78,6 мкм и трансгрессивной совокупности гаплоидов и диплоидов 42,5 + 54,9 мкм.
Разработан экспресс-метод разделения регенерантных растений по уровню плоидности, позволяющий идентифицировать растения по результатам 3-5 измерений на основе доверительных границ интервалов ДЗКУ без применения цитологической фиксации, окраски и подсчета числа хромосом.
9 На основании исследования жизнеспособности, динамики роста и
цитоэмбриологического пути развития микроспор определен биологический
потенциал образования гаплоидов в процессе культивирования пыльников
пшеницы и эгилопсов на питательных средах.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. а) Гексаплоидные геномно-замещенные формы мягкой пшеницы, (2п = 42),
сочетающие геномы АВ мягкой пшеницы с диплоидными видами пшеницы Тг.
А А А
boeoticum, Tr. monococcum, Tr. sinskajae с геномами А0 (ААВВАА), эгилопсов Ае. speltoides Ае. scharonensis Ае. umbellulatanAe. uniaristata с геномами S,s!,Uulf(AABBSS, AABBS'S', AABBUU, AABBlflf), соответственно, и ржи S. cereale с геномом R (AABBRR).
б) Гексаплоидный гомолог мягкой пшеницы Tr. miguschovae с геномным
составом AbAbGGDD.
в) Сорт озимого тритикале АД Зеленый.
г) Тетраплоидные амфидиплоиды с различными геномными составами: Ае. speltoides х
Tr. sinskajae (SSA А ), Ае. sharonensis х Tr. boeoticum (SSA А ), Ае. sharonensis х
Tr. monococcum (SSA А ), Ае. sharonensis х Tr. sinskajae (SSA А ), Ае. sharonensis х
Tr. urartu (S's'A'A1), Tr. urartu x Ае. sharonensis (AUAUSS), Ae. squarrosa x Tr. boeoticum
(DDAbAb).
Метод эффективного переноса генетического материала диплоидных видов пшеницы, эгилопсов и ржи в геном мягкой пшеницы путем её скрещивания с гексаплоидными геномно-замещенными формами различного геномного состава, конъюгации, кроссинговера и возникновения транслокаций в гибридном потомстве в зависимости от наличия родственных локусов в их хромосомах.
Составы питательных сред для культивирования пыльников озимой и яровой мягкой пшениц с высоким уровнем образования эмбриоидов и регенерантных растений, оптимизированные по сочетанию и концентрациям фитогормонов.
Дигаплоидная линия Лютесценс , полученная в культуре пыльников гибридов Fj мягкой пшеницы и обладающая высокой урожайностью, устойчивостью к грибным болезням и высоким качеством зерна
5. Закономерности образования эмбриоидов в культуре пыльников сортов и
гибридов F/ мягкой пшеницы.
6. Экспресс-метод для разделения на гаплоиды и диплоиды регенерантных
растений, полученных в культуре пыльников сортов и гибридов F] озимой
мягкой пшеницы, по длине замыкающих клеток устьиц.
Практическая ценность работы заключается в создании 27 гексаплоидных геномно-замещенных озимых и яровых форм с уникальными сочетаниями геномов АВ мягкой пшеницы с геномами Аь трех диплоидных видов пшеницы, геномами четырех диплоидных видов эгилопсов S, tf, U, If и геномом R ржи; одной гексаплоидной озимой формы с геномным составом AbGD (Гг. miguschovae) и 12 тетраплоидных форм с геномными составами: SAb, &Ab, ІЇА", Autf, DAb, 5*D.
Геномно-замещенные формы используются в качестве исходного материала в селекционных программах Краснодарского НИИСХ им. П. П. Лукьяненко для эффективного переноса генов устойчивости к мучнистой росе, бурой, желтой, стеблевой ржавчинам, высокого содержания белка в зерне от диплоидных видов пшеницы, эгилопсов и ржи в геном мягкой пшеницы без участия видов посредников.
С использованием синтезированной формы Tr. miguschovae в Краснодарском НИИСХ им. П. П. Лукьяненко выведено 4 сорта озимой мягкой пшеницы: Жировка, Фишт, Восторг и Ростислав.
Сорт озимого тритикале АД Зеленый входит в родословную 14 сортов тритикале и 2 сортов озимой мягкой пшеницы Краснодарского НИИСХ им. П. П. Лукьяненко, а также 2 сортов озимого тритикале Института сельского хозяйства НЧП им. В. В. Докучаева и 1 сорта Северо-Донецкой сельскохозяйственной опытной станции.
Дигаплоидная линия Лютесценс , полученная в культуре пыльников гибридов Fj, обладает уникальным сочетанием генов и может быть использована в скрещиваниях качестве донора высокой урожайности, устойчивости к болезням и качества зерна.
Тетраплоидные амфидиплоиды Ае. speltoides х Tr. sinskajae, Ае. sharonensis х Tr. boeoticum, Ае. sharonensis х Tr. monococcum, Ае. sharonensis x Tr. sinskajae,
Ae. sharonensis x Tr. urartu, Tr. и rartu x Ae. s haronensis использовались в исследовании происхождения геномов мягкой пшеницы (Жиров, 1989), а с помощью амфидиплоидов Ае. bicornis х Ае. squarrosa и Ае. squarrosa х Tr. boeoticum можно выделять тетракомпоненты BD и AD из генома мягкой пшеницы и создавать уникальные сочетания геномов, не встречающиеся в природе.
Предложенные нами оптимизированные составы питательных сред для культивирования пыльников могут использоваться для массового получения дигаплоидных линий мягкой пшеницы.
Разработанный экспресс-метод позволяет разделять регенерантные растения по ДЗКУ на гаплоиды и диплоиды без применения цитологической фиксации, окраски и подсчета числа хромосом.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены и
представлены на Всесоюзном совещании по отдаленной гибридизации растений и
животных, (Москва, 1981); Международной научной конференции ученых стран-
членов СЭВ "Теоретические и прикладные аспекты селекции и семеноводства
пшеницы, ржи, ячменя и тритикале", (Одесса, 1981); Всесоюзном совещании
"Важнейшие проблемы увеличения производства растительного белка и развития
научных исследований в этой области в свете решений XXIV КПСС", (Краснодар,
1981); Всесоюзной конференции "Физиолого-генетические проблемы
интенсификации селекционного процесса", (Саратов, 1984); Международного
симпозиума "Клеточные и генные биотехнологии для зерновых злаков", (Алма-
Ата, 1989); Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии,
(Целиноград, 1991); III Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии
растений", (Пущино, 1995); Международной научной конференции "Актуальные
проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии",
(Москва 1996); VII Международной научной конференции "Биология клеток
растений in vitro биотехнология и сохранение генофонда", (Москва, 1997);
Международной научно-практической конференции "Биоресурсы.
Биотехнологии. Инновации Юга России", (Пятигорск, 2003); Всероссийской научно-практической конференции "Биотехнология-2003", (Сочи, 2003).
12 Публикация. Основные положения диссертации изложены в 25 печатных
работах, включая авторское свидетельство на сорт озимого тритикале АД
Зеленый и монографию.
Личный вклад соискателя. Экспериментальные материалы, представленные в диссертации, планировались, выполнялись, обобщались и регулярно докладывались на отчетных заседаниях Ученого совета Краснодарского НИИСХ им. П. П. Лукьяненко при непосредственном личном участии диссертанта или под его руководством.
В главе 5 диссертации, кроме данных автора диссертационной работы, приведены результаты исследования линий и сортов, полученных с использованием созданного нами исходного материала, и любезно предоставленные научными сотрудниками отдела селекции и первичного семеноводства озимой мягкой пшеницы и тритикале и лаборатории биотехнологии Краснодарского НИИСХ им. П. П. Лукьяненко.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнялась в соответствии с тематическими планами НИР Краснодарского НИИСХ им. П. П. Лукьяненко по программе 0.51.104 задания 02.02.Н2 "Разработать и усовершенствовать методы геномной и хромосомной инженерии на основе использования полиплоидных, гаплоидных и анеуплоидных форм" (№ ГР. 01.82.1.064545); по программе 0.74.06 (ГУ) задания 03.02. ТІ "Создать исходные формы и новые сорта с.-х. растений с использованием методов клеточной инженерии"; по программе О.СХ.01 "Сельскохозяйственная биотехнология", задания 01.04.Н1 и Н2. "Разработать и внедрить методы клеточной селекции на устойчивость к стрессовым факторам и главным заболеваниям с.-х. растений и создать технологии для регенерации целых растений на селективных средах для основных с.-х. культур" (№ ГР. 01.86.0 134222); по программе О.СХ.03. задания 02.02.Н2 "Разработать и применить методы получения форм основных с.-х. культур с измененным числом хромосом и на их основе создать методы геномной и хромосомной инженерии для улучшения селекционного материала и выведения высокопродуктивных и устойчивых сортов" (№ ГР. 01.86.0 134221); международной программе КП НТП СЭВ
13 5.1.1 задания 5.1.1.1. 3.1 "Разработка методов клеточной инженерии с целью создания
на их основе исходных форм для селекции"; по программе О.СХ.01. задания
01.04.Н.04. и Н.Об. "Разработка биотехнологических методов получения гомозиготных
линий из гетерозиготного материала различных с.-х. культур"(№ ГР. 01.09.10 041559).
