Введение к работе
Актуальность темы. В XX веке бурное развитие методов селекции привело к значительному улучшению многих хозяйственных признаков домашнего скота. Потенциал крупномасштабной селекции далеко не исчерпан и в наше время. Однако возникновение и развитие биотехнологии на базе клеточной и генной инженерии открыли новые возможности в этой области.
Вначале искусственное осеменение, замораживание спермы, затем трансплантация ранних эмбрионов позволили значительно сократить период создания и размножения новых пород (Прокофьев М.И., 1983). На следующем этапе были разработаны методы получения, созревания и оплодотворения in vitro ооцитов, которые открыли новые перспективы для ускоренной селекции, путем более полного использования генетического материала самок.
Известно, что число ооцитов, овулирующих спонтанно во время эструса, составляет лишь незначительную часть от тысяч половых клеток в яичниках при рождении самок домашнего скота. Остальные дегенерируют внутри яичника, что обычно называют атрезией. Достижения эмбриологической науки в настоящее время обеспечивают возобновление мейотического созревания у большинства ооцитов, извлекаемых из антральных фолликулов, со стадии диакинеза до метафазы II, однако эффективность их развития после оплодотворения in vitro остается более низкой по сравнению с оплодотворенными in vivo. Прогресс в этом направлении требует накопления данных фундаментальных исследований о процессе созревания, оплодотворения ооцитов и культивирования ранних эмбрионов in vitro в сравнении с оплодотворением in vivo.
С другой стороны, развитие молекулярной генетики привело к разработке методов, открывающих животноводству возможность работы на генном уровне (выделение, копирование, рекомбинация и интеграция в геном организма отдельных генов). Цель таких исследований заключается в получении трансгенных особей, у которых введенные гены путем синтеза чужеродных белков оказывают влияние на определенные свойства животного или придают организму определенные качества. В случае передачи трансгена по наследству возможно создание трансгенных линий.
В последние годы введение чужеродных генов в геном мышей стала рутинной процедурой (Palmiter R.D. et al., 1983; Ward K.et al., 1986; Peshon J.J. et al., 1987; Bowen R.A. et al., 1994). С помощью этой модели удалось достичь значительных успехов в изучении механизма интеграции, экспрессии и наследования введенных генов, и тем самым вплотную подойти к получению трансгенных сельскохозяйственных животных (Ernst L.K. et al., 1991; Прокофьев М.И. и др., 2003).
Одними из первых были получены трансгенные сельскохозяйственные животные (кролики, овцы, свиньи) с экзогенным геном гормона роста
(Hammer R.E., 1985). Известно, что соматотропин играет ключевую роль в обменных процессах. Так, при введении коровам гипофизарного гормона роста человека удается повысить уровень молочной продуктивности на 10-15% (Machlin L.J., 1973). Помимо увеличения надоев, после инъекции гормона роста (гипофизарного или микробного происхождения) молодняку различных сельскохозяйственных животных их скорость роста и качество мясной продукции возрастали (Wagner Т.Е. et al., 1981, 1986; Armstrong D.G., 1985).
Еще одним успешным направлением трансгенеза является генетическая
модификация сельскохозяйственных животных для производства
рекомбинантных белков фармацевтического назначения с молоком кроликов,
коз, коров и с белком яйца кур. В настоящее время получено более 60 таких
белков с молоком трансгенных животных. Некоторые из них находятся уже
на III фазе клинических испытаний. Использование трансгенных
сельскохозяйственных животных в качестве живых биореакторов по
сравнению с другими технологиями производства рекомбинантных белков
обусловлены целым рядом преимуществ. Получение рекомбинантных белков
с использованием генетически модифицированных микроорганизмов не
обеспечивает посттрансляционных модификаций, таких как
гликозилирование, фолдинг белка, что приводит к снижению стабильности и физиологической активности получаемого белка. Несмотря на то, что в культуре клеток млекопитающих происходят все необходимые посттрансляционные процессы в рекомбинантном белке, концентрация последнего очень низкая, а сам процесс культивирования дорогостоящий и требует высокого технологического оборудования.
Получение животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, является еще одним важным направлением в трансгенезе. За последние десятилетия существенно расширились представления о вирусной природе целого ряда заболеваний сельскохозяйственных животных. Подробно изучены механизмы репродукции некоторых вирусов. Генетическое регулирование активности вирусных генов может позволить выводить формы животных с повышенной, устойчивостью к вирусным заболеваниям. Большой интерес в этом отношении представляют антисмысловые РНК (асРНК).
Однако, несмотря на тот факт, что в настоящее время различные виды домашних животных (и растений) подверглись генетической модификации, а именно, насекомые, рыбы, птицы, свиньи, кролики, козы, крупный рогатый скот, применение трансгенеза в области животноводства пока не связано с большими успехами, однако уже сейчас можно прогнозировать, что в будущем традиционные методы разведения животных будут дополнены, а отчасти и заменены новыми технологиями.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлось изучение молекулярно-клеточных механизмов эмбриогенеза домашних животных, разработка и усовершенствование биотехнологических методов их
размножения и генетической трансформации путем введения чужеродных генов.
Для выполнения поставленной цели считали необходимым решить следующие задачи:
Изучить особенности развития половых клеток и ранних эмбрионов сельскохозяйственных животных и усовершенствовать на этой основе методы созревания, оплодотворения ооцитов и дальнейшего культивирования вне организма эмбрионов крупного рогатого скота.
Изучить динамику белкового синтеза у ранних эмбрионов крупного рогатого скота, подвергшихся процедурам культивирования вне организма, замораживанию, а также инъекции чужеродными генами.
Разработать новые способы диагностики оплодотворяющей способности спермы быков с использованием процедуры всплывания спермы ("swim-up") и метода оплодотворения вне организма.
4. Усовершенствовать методы инъекции чужеродных генов в
оплодотворенные вне организма ооциты крупного рогатого скота.
5. Усовершенствовать методы получения телят из полученных вне
организма, замороженных эмбрионов, а также после трансплантации
эмбрионов, полученных из инъецированных чужеродным геном зигот.
6. Получить трансгенных кроликов и изучить взаимосвязь между структурой
генных конструкций, эффективностью и характером их интеграции у кроликов, а также их потомков.
7. Усовершенствовать методы получения трансгенных химерных эмбрионов
кур.
Научная новизна исследований: Впервые нами показано, что для созревания ооцитов крупного рогатого скота in vitro достаточно 18 часов, а не 22-24 часа, как было установлено ранее.
На основании полученных данных о наличии аналогии в процессе продвижения живчиков быка по половым путям самки и их всплывании в процедуре «swim-up» было сделано предположение, что концентрация мужских гамет в шейке матки остается постоянной (пока они жизнеспособны) за счет той силы, которая поддерживает динамическое равновесие между концентрированной малоподвижной (в цервикальном канале) и подвижной разбавленной (в матке) спермой.
Впервые показано, что оценка качества спермы быков по числу подвижных сперматозоидов в процедуре «swim-up» может бьпь объективным критерием прогнозирования оплодотворяющей способности спермы.
Исходя из концепции процесса оплодотворения у млекопитающих, выдвинутой академиком В.К. Миловановым, выявленное нами повышение эффективности развития эмбрионов крупного рогатого скота после 2-х кратного добавления спермы к ооцитам в условиях in vitro по сравнению с однократным, может бьпь результатом более эффективного освобождения яйцеклеток от клеток яйценосного бугорка, лучшей избирательностью
проникновения сперматозоидов в яйцеклетку и, как следствие, уменьшением вероятности возникновения эпигинитических нарушений у эмбрионов.
Показана возможность успешного культивирования in vitro ранних эмбрионов крупного рогатого скота на монослое эпителиальных клеток и с сывороткой крови других видов животных, в частности, клеток яйцевода кролика и эстральной сывороткой северных оленей.
Выявлены существенные различия в биосинтезе белка между полученными in vitro и in vivo эмбрионами, свидетельствующие о задержке в переходе синтетической активности с материнской мРНК на мРНК собственного генома у полученных in vitro эмбрионов.
В результате проведенных экспериментов впервые в нашей стране получены трансгенные кролики с геном гормона роста человека, а также выявлена экспрессия этого гена.
Получены впервые трансгенные животные (кролики) с геном асРНК против аденовируса человека. Показана возможность получения потомства от этих трансгенов и наследования введенного гена у потомков. Установлено, что линейная форма плазмиды по сравнению с кольцевой в пять раз более эффективно встраивается в геном кролика.
Определены оптимальные режимы скорости центрифугирования для визуализации пронуклеусов у зигот у крупного рогатого скота.
Процедура микроинъекции чужеродного гена в зиготу крупного рогатого скота после предварительного центрифугирования не останавливала развитие ранних эмбрионов, а также не влияла на уровень и качественный состав синтезируемых белков, как сразу же после инъекции, так и при последующем развитии.
Определены оптимальные концентрации чужеродного гена и плотность эмбриональных клеток кур (бластодермальных и гонадных первичных половых клеток (ППК)) в культуре с целью достижения с их помощью высокого уровня трансфекции эмбрионов.
Практическая значимость работы. Результаты исследований, полученные при изучении процесса созревания ооцитов крупного рогатого скота в условиях культивирования вне организма, могут быть использованы при внедрении данной технологии в производство, а также в целях рационального использования рабочего времени при проведении научных экспериментов.
Использование предложенного способа культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro вместе с соматическими клетками и сывороткой крови от других видов (кролика и северного оленя, соответственно) исключает вероятность переноса инфекционных агентов с белковыми или клеточными компонентами от животных-доноров (авторское свидетельство №1578859 от 15.03.1990).
Преложенный метод 2-х кратного добавления сперматозоидов в среду для оплодотворения с 2-х часовым интервалом повышает в три раза выход полученных вне организма бластоцист крупного рогатого скота.
Определены оптимальные соотношения между сроками в проявлении охоты у реципиента и возрастом эмбриона для проведения эффективной пересадки полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота, а именно, возраст эмбриона должен совпадать или опережать на один день стадию полового цикла реципиента.
Разработанный модифицированный способ отбора подвижных сперматозоидов быка позволяет примерно в пять раз повысить эффективность использования спермы быка при оплодотворении in vitro яйцеклеток крупного рогатого скота.
Предложенный метод диагностики оплодотворяющей способности спермы быков путем сравнительного изучения подвижности сперматозоидов от разных быков в условиях in vitro отличается простотой, дешевизной и быстротой исполнения (положительное решение о выделении патента на изобретение от 30.01.1996 г., заявка №95109519/15 (016259).
Отработана технология замораживания в азоте полученных вне организма эмбрионов . крупного рогатого скота с применением этиленгликоля.
Результаты исследований уровня биосинтеза белка в полученных in vitro эмбрионах крупного рогатого скота в сравнении с полученными in vivo эмбрионами, а также до и после их замораживания, могут быть использованы в качестве оценочного критерия при совершенствовании методов культивирования и криоконсервации ранних эмбрионов.
Установлено, что ППК гонад кур, выделенные на 7-е сутки инкубации, более удобный объект для получения как химер, в том числе и трансгенных, так и для создания долгосрочных культур с целью их, стабильной трансфекции чужеродным геном.
Результаты исследований, направленные на разработку оптимальных приемов микроинъекции чужеродных генов в зиготы кроликов и крупного рогатого скота, трансфекции куриных ППК могут быть использованы как в практической работе по получению трансгенных животных, так и в целях дальнейшего развития методов трансгенеза.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Незрелые ооциты крупного рогатого скота в условиях культивирования вне организма завершают стадию созревания через 18 часов и в течение последующих 6 часов сохраняют свои потенции к оплодотворению.
Модифицированный способ отбора подвижных сперматозоидов быка позволяет примерно в пять раз повысить эффективность использования спермы при оплодотворении яйцеклеток крупного рогатого скота in vitro.
Новый метод диагностики оплодотворяющей способности спермы быков в условиях in vitro основан на измерении концентрации подвижных живчиков быка при проведении процедуры «swim-up».
4. Полноценное развитие полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого
скота до стадии бластоцисты может поддерживаться сывороткой крови
северных оленей или эпителиальными клетками яйцевода кролика.
Использование же биологической жидкости другого вида может в значительней степени ограничить перенос определенных инфекций.
Эффективность развития эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты после 2-х кратного добавления сперматозоидов более чем в три раза выше, чем после однократного.
Существуют значительные индивидуальные различия между коровами-донорами по эффективности оплодотворения in vitro ооцитов и дальнейшему развитию эмбрионов. Процент дробящихся зигот к числу осемененных ооцитов составил в среднем 36.7% с колебаниями от 22.2% до 72.7% у отдельных животных. Стадии морулы и бластоцисты достигали в среднем 2.4±1.8 эмбриона на корову с колебаниями от 0 до 5 эмбрионов.
Приживляемость эмбрионов крупного рогатого скота повышается при их трансплантации реципиентам в дни цикла, совпадающие с возрастом эмбриона (16.1%) или опережающие на один день (23.1%) по сравнению с отстающими на 1-2 дня (7.1-11.8%).
Белковый синтез у полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота имеет минимальную активность на стадии зиготы, вдвое возрастает к 8-ми клеточной стадии и втрое к стадии бластоцисты.
Эффективность получения трансгенных кроликов от числа рожденных потомков, в пронуклеусы зигот которых инъецирован ген гормона роста человека, составляет 10.9%. Установлена экспрессия гена гормона роста человека в сыворотке крови трансгенных кроликов.
10. Максимальная эффективность получения трансгенных кроликов от числа
рожденных потомков продемонстрирована при инъекции гена асРНК
против аденовируса человека и составила 35.7%. Линейная форма
плазмиды PGMA с геном асРНК по сравнению с кольцевой более
эффективно интегрируется в хромосомную ДНК зигот кроликов.
Наследование чужеродного гена наблюдалось у 5 из 14 кроликов первого
поколения.
11. Подобранные параметры позволяют трансфецировать бактериальным
геном Р-галактозидазы около 30% эмбриональных клеток кур в культуре
(бластодермальных и гонадных ППК). После инъекция суспензии
трансфецированных клеток реципиентам была выявлена экспрессия
чужеродного гена в тканях химерных эмбрионов.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных отчетных сессиях Биотехцентра, НИИПЗК и ВИЭВ в период с 1988 г. по 1997 г., а также на: международных конференциях (Харьков, 1988, Аскания- Нова, 1993, Санкт-Петербург, 1993, Киев, 1994, Дубровицы, 2003 г., Москва 2004 г.), международном симпозиуме (Санкт-Петербург, 1994), международном обществе по пересадке эмбрионов (Ницца, 1997), всероссийской научной школы-конференции в Московской сельскохозяйственной академии им. КА. Тимирязева (1997).
Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 30 печатных работах, в том числе в центральных журналах - 12, книгах - 2, в зарубежных изданиях - 2, получено 1 авторское свидетельство и 1 положительное решение о выдаче патента на изобретение и методических рекомендациях.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 270 страницах компьютерного текста, содержит 45 таблиц, 19 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, их результатов и обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы. Список литературы включает 437 источников, в том числе 419 иностранных авторов.
