Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. специфические органические вещества в биосфере 17
1.1 Процесс гумификации и структурная организация гумусовых кислот 17
1.2 Групповой и фракционный состав гумусовых кислот 29
1.3 Элементный состав и функциональные группы гумусовых кислот 38
1.4 Структурная организация гумусовых кислот 47
1.5 Биологические свойства гумусовых кислот 53
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 68
2.1 Этапы проведения исследования, характеристика объекта исследования и условия проведения экспериментов 68
2.2 Выделение, фракционирование и очистка гумусовых кислот Пелоидов 73
2.3 Методы идентификации гумусовых кислот. Определение экологической чистоты пелоидопрепаратов 76
2.4 Методы исследования структурной организации гумусовых кислот пелоидов 79
2.5 Методы исследования гетерогенности гумусовых кислот 85
2.6 Определение биологической активности гумусовых кислот 86
2.6.1 Методы исследования биологической активности гумусовых кислот в условиях «in vivo» 86
2.6.2 Методы исследования биологической активности гумусовых кислот в условиях «in vitro» 90
2.7 Статистическая обработка результатов исследования 92
ГЛАВА 3. Группы и фракции специфических органических веществ иловых сульфидных грязей 95
3.1 Групповой состав гуминовых веществ з
3.2 Фракционный состав и показатели биотрансформации гумусовых кислот 101
3.3 Определение органических и неорганических экотоксикантов в лечебных грязях и пелоидопрепаратах
3.3.1 Содержание экотоксикантов органической природы 108
3.3.2 Содержание тяжелых металлов 111
3.3.3 Динамика взаимодействия с ионами различных металлов 117
ГЛАВА 4. Идентификационные признаки гумусовых кислот пелоидов
4.1 Элементный состав и строение гумусовых кислот 124
4.2 Инфракрасные спектры гумусовых кислот 139
4.3 Электронные спектры поглощения гумусовых кислот 142
ГЛАВА 5. Структура и физико-химические свойства гумусовых кислот
5.1 Характеристика кислотно-основных свойств гумусовых кислот 147
5.2 Исследование полидисперсности гумусовых кислот
5.2.1 Исследование молекулярно-массового распределения гумусовых кислот 152
5.2.2 Изучение гидрофильно-гидрофобных свойств гумусовых кислот 154
5.2.3 Исследование гумусовых пелоидов методом капиллярного электрофореза 157
5.3 Характеристика структуры и свойств макромолекул гумусовых кислот пелоидов физико-химическими методами 160
5.3.1 Изучение гумусовых кислот методом дифференциально-термического анализа 5.3.2 Парамагнетизм в ряду гумусовых кислот 162
5.3.3 Определение коэффициента самодиффузии в ряду гумусовых кислот методом ядерно-магнитного резонанса с импульсным градиентом магнитного поля 165
5.3.4 Адсорбционная способность в ряду гумусовых кислот 168
ГЛАВА 6. Исследование биологической активности гумусовых кислот в условиях "in vivo" 173
6.1 Определение острой токсичности гумусовых кислот 173
6.2 Влияние гумусовых кислот на развитие острого каррагениново го воспаления 175
6.3 Влияние гумусовых кислот на течение адъювантного артрита 190
6.3.1 Характеристика влияния гумусовых кислот на прооксидантные и антиоксидантные процессы 200
6.3.2 Характеристика иммунотропного действия гумусовых кислот 228
6.3.3 Динамика морфологических изменений в периферических органах иммуногенеза 236
ГЛАВА 7. Исследование биологической активности гумусовых кислот в условиях "in vitro" 236
7.1 Влияние гумусовых кислот на активность дегидрогеназ в полиферментной и полисубстратной системе 237
7.2 Влияние гумусовых кислот на структурно-функциональные показатели нативных и модифицированных клеток крови 244
7.3 Влияние гумусовых кислот на функциональную способность мужских гамет 248
Заключение 255
Выводы 270
Список литературы
- Элементный состав и функциональные группы гумусовых кислот
- Методы идентификации гумусовых кислот. Определение экологической чистоты пелоидопрепаратов
- Определение органических и неорганических экотоксикантов в лечебных грязях и пелоидопрепаратах
- Исследование молекулярно-массового распределения гумусовых кислот
Элементный состав и функциональные группы гумусовых кислот
Гуминовые вещества - это совокупность биотермодинамически устойчивых соединений, образующихся в процессе разложения и трансформации растительных и животных остатков не имеютпих аналогов в живых опганизмах и отличающихся темной окраской, полидисперсностью, высокими молекулярными массами (Averett R.C. et. al., 1989; Zimmermann W., 1993; Stevenson F.J., 1994). Гумификация - процесс превращения органических остатков в гуминовые вещества - одно из величайших изобретений природы (Орлов Д.С. 1985, 1990; Kastner М. et al., 1999; Filip Z., Berthelin J., 2001; Trubetskaya O.E. et al., 2001) . В отсутствие такого механизма можно было бы ожидать осуществления двух прямо противоположных процессов: полной минерализации органических остатков до оксидов, нарушающей непрерывность существования жизни на Земле, или абсолютной сохранности органических веществ, что привело бы к полному покрытию ими поверхности планеты. В реальности часть органических остатков минерализуется, а часть трансформируется в термодинамически устойчивые гуминовые вещества (Орлов Д.С, 2000; Дошофур Ф., 1998; Kastner М., Mahro В., 1996).
Гуминовые вещества представляют собой макрокомпоненту органических веществ почвенных (Кононова М.М., 1963; Манская СМ., Дроздова Т.В., 1971; Успенский В.А., 1975, Александрова Л.Н., 1980; Орлов Д.С, 1985, 1997, 2000; Перминова И.А., 2000; Ben-Dor Е., Вашп А., 1989; Schnitzer М., Schuppli Р., 1989; Mishra В., Strivastava L.L., 1990; Beck A.J. et al., 1993; Clapp C.E. et al., 1996; Myneni S.C. et al, 1999; McDowell R.W., Sharpley A.N., 2001) и водных (ШвецВ.М., Кирюхин В.К., 1974; Варшал Г.М. с соавт., 1976, 1993, 1994; Sarkar J.M. et al, 1988; Michaelis W. et al., 1989; Hernandes M.T. et al, 1990; Companella L. et al., 1991; Flaten T.P., 1991; Randow F.F. et al., 1996; Hessen D.O., Travnik L.J., 1998; Peng A. et al., 1999) экосистем, твердых горючих ископаемых (Драгунов С.С., 1962, 1970, 1975; Лиштван И.И. с соавт., 1976; Горелова Т.А., 1982; Лукошко Е.С. с соавт., 1982; Дементьева Т.В., 1991; Кречетова Е.В., 1995; Knauf Н. et al., 1983; Пейчева В., 1985; Schacht S. et al., 1999; Swift R.S., Spark K.M. et al., 2001), пелоидов (Бахман В.И. с соавт., 1965, 1971; Черепанова М.Н., 1969, 1976, 1981; Пунтус, 1976; Шустов Л.П., 1996, 1999; Агапов А.И., 1999; Hayes М.Н.В., Wilson W.R., 1997). Их содержание в почвах и водах составляет 60-80 % от общего органического вещества (Перминова И.В., 2000), в торфах и углях оно колеблется от 20 до 90 % (Trmrman Е.М., 1985), в пелоидах -45-90% (Степанова Е. А., 1996).
До настоящего времени не существует единого мнения о природе гумино-вых веществ. Ряд исследователей рассматривают их как продукт превращения лигнина (Trigo С, Ball A.S., 1994), что не подтверждается балансовыми опытами (Манская СМ., Кодина Л.И., 1968). Другие авторы (Комиссаров И.Д., 1982; Wunderwald U. et al., 2000) считают гуминовые вещества результатом синтеза из фенолов и дубильных веществ. Некоторые исследователи основную роль отводят углеводному компоненту (Бамбалов Н.Н., Комаренко В.В., 1973). Однако углеводы не принимают прямого участия в синтезе гумусовых кислот, а являются лишь материалом для микробиологического «передела» (Орлов Д.С.,1990; SolaN.Z., CbreraZ.Z., 1993).
Поскольку гуминовые вещества биотермодинамически более устойчивы, чем попадающие в почву органические соединения и растительные остатки, то гумусообразование можно рассматривать как процесс, в ходе которого относи-тельно непрочные лабильные вещества растительных и животных остатков и продукты их трансформации быстро минерализуются, разлагаются и усваиваются микроорганизмами, существуя в биообъектах лишь короткий промежуток времени, а цепь превращений всей совокупности органических компонентов задерживается на звене, которое представлено наиболее термодинамически устойчивыми соединениями (Salonen К. et al., 1992; De Bertoldi M. et. al., 1996; Frimmel F.H. et al., 2002). Этот общий принцип определяет только одну сторону явления - направленность процесса гумификации. Биотермодинамически процесс гумификации всегда имеет принципиальное направление - отбор устойчивых продуктов - независимо от факторов и объектов образования. Поэтому гумификация - явление глобальное, а гуминовые вещества всех биосистем имеют общий принцип строения (Орлов Д.С.,1975, 1980, 1997, 2000; Steinbrenner К., Matschke J., 1971). Возможные пути генеза гуминовых веществ можно представить в виде схемы, приведенной на рис. 1.
Одна из первых реакций в процессе формирования молекул гуминовых веществ - ферментативное окисление ароматических соединений с образованием хинонов, отличающихся высокой реакционной способностью. Хиноны взаимодействуют с аминосоединениями, в большинстве случаев эта реакция идет ферментативным путем. Она может идти с образованием диаминобензо-хинонов, азотистых гетероциклических соединений, а также по типу образования меланинов. Аминосоединения, вступающие в реакцию с хинонами, могут быть продуктами распада белка, либо промежуточными соединениями мела-ноидиновой реакции. В то же время хиноны могут окисляться с образованием димеров и диенов, которые при взаимодействии с аминосоединениями также служат основой для построения молекулы гуминовых веществ. Окисление хи-нонов под действием микроорганизмов может привести к распаду ароматического кольца и образованию алифатических кислот, углекислоты и воды. Продукты взаимодействия хинонов с аминосоединениями подвергаются дальнейшей конденсации, образуя молекулу гуминовых веществ через меланиновую реакцию. Однако одного понятия «направленность процесса» еще недостаточно для понимания особенностей строения и определения влияния эколого-биотермодинамических условий на особенности гуминовых веществ. Важно не только выявить направленность процесса, но и оценить его интенсивность, которая зависит от скорости отдельных стадий процесса и, главным образом, от наиболее медленной, лимитирующей стадии.
Методы идентификации гумусовых кислот. Определение экологической чистоты пелоидопрепаратов
Экспериментальное моделирование на животных имеет целью в более простых условиях опыта изучить разные стороны патологических процессов и исследовать влияние новых веществ, в том числе и природных, на биологическую активность. Определение острой токсичности проводили в соответствии с методическими указаниями по изучению новых нестероидных противовоспалительных препаратов (2000).
Для определения LD50 крысам линии Wistar, массой 180-200 г, содержащихся в питомнике Рапполова на стандартном рационе и в стандартных условиях вивария, перорально вводили взвесь препарата в 1%-ном крахмальном клейстере и наблюдали в течение трех дней. Кроме того внутримышечно вводили 1%-ные растворы гумусовых кислот. Наблюдения проводили в течение 12 дней. Оценивали общее состояние животных, особенности поведения, двигательную активность, координацию движений, визуально частоту и глубину дыхательных движений, состояние волосяного покрова, окраску слизистых оболочек, характер фекальных масс, изменение массы тела.
Биологическую активность в ряду гумусовых препаратов оценивали по противовоспалительному действию на моделях острого каррагенинового и хронического иммунного воспаления, динамика которых известна (Тринус Ф.П. с соавт., 1975; Насыров Х.М. Чернух A.M., 1979; СуйВ.М. 1990).
Острую воспалительную реакцию воспроизводили субплантарным введе-ниєм 0,1 см 1%-ного раствора каррагенина крысам линии Wistar массой 180-200,0 г; выраженность воспалительной реакции оценивали через 1, 2, 3, 24, 48, 72 часа после индукции воспаления. Исследуемые препараты вводили объемом 0,2 см внутримышечно за 10 минут до каррагенина в виде водных растворов (рН =7,4) в широком диапазоне концентраций (от 0,01% до 0,5%). В качестве вещества сравнения использовали официнальный раствор диклофенака натрия 0,1% и 2,5%. Контрольной группе вводили 0,2 см изотонического раствора.
Для выявления особенностей влияния пелоидопрепаратов на картину пе риферической крови и иммунную систему нами были проведены 3 серии экс периментов, в которых изучалось действие препарата на здоровых животных, а также животных с каррагениновым отёком и адьювантным полиартритом (Исследование проводилось в ЦНИЛ СамГМУ).
1-я серия. Здоровым белым лабораторным крысам вводили 0,1% растворы фульвокислот, гиматомелановых, гуминовых кислот, суммарного препарата в дозе 0,2см ежедневно в течение 12 дней. В качестве группы сравнения были использованы интактные животные и крысы, которым вводили физиологический раствор в том же объёме и по той же схеме. Через 3, 7 и 12 суток животных выводили из эксперимента декапитацией (гильотина) и забирали кровь для исследований.
2-я серия. У животных вызывали отёк путём однократного введения 0,2см 1% раствора каррагенина, которому предшествовала инъекция 0,2см3 0,1% раствора препаратов или физиологического раствора в том же объёме. Кровь для исследований забирали после декапитации через 3 часа после инъекций.
3-я серия. Хроническое иммунное воспаление моделировали у крыс суб-плантарным введением в правую заднюю лапу 0,1 мл адъюванта Фрейнда (взвесь БЦЖ 2,5 мг/мл в вазелиновом масле). Лечение начинали с 14-го дня после инъекции адъюванта. Пелоидопрепараты в виде 0,1% водных растворов (рН=7,4) вводили ежедневно. Воспалительная реакция оценивалась на 3, 7, 12 сутки после начала лечения (Newbould В.В., 1963). По окончании эксперимента животных выводили из опыта декапитацией (гильотина). Оценивали изменение содержания общего пула лейкоцитов, эритроцитов, тробоцитов в крови, определяли концентрацию гемоглобина, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), количество нейтрофильных гранулоцитов (в том числе палочкоядерных и сег-ментоядерных), лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов. Для более детального изучения влияния препарата на макрофагально-фагоцитарную и иммунную системы определяли уровень с-реактивного белка (СРБ) и циркулирующих иммунных комплексов, содержание фибронектина, а также провоспа-лительных цитокинов (интерлейкин 1-р и фактор некроза опухоли -а) в сыворотке крови, оценивали уровень спонтанной и стимулированной люминол-зависимой хемилюминесценции лейкоцитов. При развитии экспериментального полиартрита дополнительно определяли содержание иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов (CD4+ и CD8+ лимфоцитов) с расчётом иммунорегуляторного индекса. Указанный подбор параметров, на наш взгляд, комплексно оценивает как изменение картины периферичечской крови в целом, так и особенности состояния фагоцитарно-макрофагальной системы, клеточного и гуморального звеньев иммунитета.
Рассчитывали индекс стимуляции и отношения максимальных значений спонтанной хемилюминесценции к стимулированной. Измерения проводили на приборе ПХЛ-1 (Москва).
Диеновую конъюгацию ненасыщенных высших жирных кислот определяли в сыворотке крови экспериментальных животных спектрофотометрически при длине волны 233нм (Стальная И.Д., 1977).
Содержание малонового диальдегида определяли с использованием тио-барбитуровой кислоты, спектрофотометрически при длине волны 532 нм (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977).
Активность каталазы в нмоль/мл мин определялась в сыворотке крови с использованием 4,0% раствора молибдата аммония и спектрофотометрирова-нием на СФ-26 при 410 нм (Королюк С.Н., 1988).
Активность супероксиддисмутазы определяли в сыворотке крови крыс спектрофотометрически на СФ-26 с 0,1% официнальным раствором адреналина. Активность рассчитывали в условных единицах на миллилитр сыворотки. За единицу активности принимали количество фермента, которое в указанных условиях ингибирует реакцию окисления адреналина на 50% (Гуревич B.C. с соавт., 1990).
Концентрацию фибронектина в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью ИФА набора Labodia-Хема (Хаитов P.M. с соавт., 1995).
Оценку содержания циркулирующих иммунных комплексов проводили с помощью тест-наборов производства НПО «Реакомплекс» на основе метода нефелометрии различной растворимости мономеров иммуноглобулинов в со 90 ставе иммунных комплексов при наличии в среде полиэтиленгликоля (ПЭГ 6000) (Гембицкий Е.В., 1987). Оценку результатов проводили с помощью анализатора иммуноферментных реакций АИФР-01 Униплан ТМ.
Содержание провоспалительных цитокинов интерлейкина 1р и фактора некроза опухоли а определяли по маркерам ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург (человек) и "Biosource", Бельгия (крысы).
Матриал для гистологических исследований (кусочки селезенки и паховые лимфатические узлы как со стороны поражения, так и с противоположной стороны) помещали в 10%-ный забуференный формалин (рН =7,2 - 7,4), проводили через спирты возрастающей концентрации по стандартной методике и заливали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, азур-эозином. Морфологические исследования проводили на 15, 19, 25 сутки после индукции воспаления у животных группы сравнения и на 3, 7, 12 сутки от начала введения пелоидопрепаратов у животных основной группы ( что соответствует 17, 21 и 25 суткам у животных группы сравнения). Морфологическое наблюдение осуществляли на автоматизированной аналитической системе, включающей микроскоп ALFA-PHOTO-2 JS-H, камера КСС- 310 PD, программа «Видео-тест-морфо».
Определение органических и неорганических экотоксикантов в лечебных грязях и пелоидопрепаратах
Фракционный состав специфических органических веществ является функцией биогеохимических процессов пелоидообразования. Сказанное предполагает исследование фракций специфических веществ пелоидов с целью прогнозирования их биологической активности. Результаты распределения гумусовых кислот по фракциям представлены в таблице 7. Характер распределения гумусовых кислот между фракциями 2 и 3 примерно одинаковый по всем месторождениям, их средний состав представлен нарис. 11,12.
Содержание гумусовых кислот фракции-2 относится к таковым фракции-3 в среднем как 2,3/1,0, что характеризует исследуемые органические вещества как весьма подвижные. Обращает на себя внимание увеличение подвижности,
Характеристика фракционного состава гумусовых кислот пелоидов в зависимости от месторождения грязи и сезона года
Месторождение грязи 1 Сезон года Содержание СоРг. Гумусовых кислот в % от возд. -сухой навески Содержание фракций в% отуглерода гумусовыхкислот то есть увеличение доли фракции-2 органических веществ в летний период (до 2,90), что, по всей вероятности, связано с повышенным содержанием в этот сезон продуктов биоты, способствующих подвижности органического вещества. Это делает его более доступным для участия в процессах жизнедеятельности микроорганизмов в качестве энергетического материала. С точки зрения получения пелоидопрепаратов, обогащенных гуминовыми кислотами, предпочтительнее летние образцы грязи.
Динамика содержания во фракции-2 представителей основных групп специфических органических веществ в воздушно-сухом образце по сезонам года такова, что доля гуминовых кислот в осенний период времени уменьшается (таблица 8).
Меньшим количеством во всех месторождениях представлена группа гимато-мелановых кислот, несколько выше содержание фульвокислот. Группы гима-томелановых кислот фракции-2 в расчете на воздушно-сухую грязь практически не претерпевают существенных количественных изменений по сезонам года (таблица 8).
Содержание фульвокислот в грязях всех месторождений существенно квеличи-вается к осени. При анализе гумусовых кислот, входящих в состав фракции-3,
Содержание гиматомелановых кислот, как и в предыдущей фракции, минимально и не превышает 0,15% от воздушно-сухого образца. Содержание гуми-новых кислот уменьшается почти втрое и становится примерно равным количеству фульвокислот. Закономерности изменения содержания групп гумусовых кислот фракции-3 по сезонам года практически не выявляются. Приведенные данные свидетельствуют о том, что основная часть общего органического вещества всех образцов представлена гуминовыми кислотами. Содержание их характерно для каждого месторождения и подвергается сезонным колебаниям, понижаясь, как правило, к осени. Несмотря на изменения по месторождениям и сезонам, все грязевые месторождения курорта «Сергиевские минеральные воды» характеризуются подобным количественным составом, за исключением грязевого месторождения озера Тепловка, пелоиды которого несколько отличаются. Из данных по составу фракции-3 следует вывод, что в данном случае происходит относительное накопление наиболее термодинамически устойчивых и химически связанных с минеральной частью гумусовых кислот. Они в меньшей степени реагируют на внешние изменения и отражают наиболее общие свойства биогеохимических объектов. Выявление количественных соотношений между фракциями по результатам анализа существенно дополняет качественную характеристику структурной организации специфического органи ческого вещества разных объектов. Анализ соотношения углерода гуминовых кислот фракции-2 к общему содержанию углерода гуминовых кислот, представленному на рисунке 13, свидетельствует о его высоком содержании (более 60%) во всех грязях. Данный показатель подвергается сезонным колебаниям. В летних образцах содержание этой фракции характеризуется как очень высокое и составляет более 70%, а весной и осенью его содержание несколько снижается. оз.Молочка оз.Тепловка оз.Солодовка оз.Серное
Содержание гуминовых кислот фракции-3 в % к сумме гуминовых кислот в зависимости от месторождения и сезона года Соотношение углерода гуминовых кислот фракции-3 к общему количеству углерода гуминовых кислот представлено на рисунке 14. В целом картина на данном рисунке, как и следовало ожидать, противоположна картине рисунка 13. Выявляется связывание, иммобилизация подвижного органического вещества в осенний период, особенно для пелоидов озера Тепловка.
Изложенные выше результаты исследований фракционного состава специфических органических веществ пелоидов показывают, насколько подвижной является система гуминовых веществ, что, безусловно, подтверждает их активное участие в жизнедеятельности микроорганизмов с одной стороны, и постоянное образование в результате геохимических процессов, протекающих под влиянием биоты, с другой стороны.
Содержание экотоксикантов органической природы В исследовании объектов окружающей среды гуминовым веществам придается все возрастающее значение. Многие ученые отмечают, что они встречаются в воде, воздухе, почвах, пелоидах, образуя так называемый «гуминовый фон». Результаты масс-хроматографического анализа, проведенные в контексте экологических исследований, необходимость которых продиктована высокой антропогенной нагрузкой на экосистемы, установили отсутствие в образцах пелоидов 1990 и 2001 года полулетучих органических экотоксикантов: пиримидина, м-динитробензола, тетрахлорбензола, н-декана, триазола, дибутилфтала-та, нафталина, диметилгидразона ацетона, м-нитробензойной кислоты. В образце 1990 года, обработанного 2 М раствором хлороводородной кислоты, обнаружены фталаты (Рис. 15).
Отсутствие перечисленных веществ в нативных пелоидах и пелоидопрепаратах и определение на промежуточной стадии очистки фталатов позволяет отнести их образование в процессе пробоподготовки как внесенное извне, например из используемой воды.
Исследование молекулярно-массового распределения гумусовых кислот
Необходимо отметить уменьшение физиологического действия 0,5% ного раствора (Рис. 44). Как следует из рисунка, препарат проявляет высокую биологическую активность, имеющую дозозависимый характер. Интересно влияние суммарного препарата гумусовых кислот на динамику острого воспаления (Рис. 45). Этот препарат максимальную, одинаково выраженную актив Рис. 50. Динамика каррагенинового воспаления под действием 0,5%-ных растворов гумусовых кислот (5,0 мг/кг массы) ность проявляет в низших и высших изучаемых концентрациях (0,01% и 0,2%), уменьшая отек на 25% и 20% (р 0,02) соответственно. 0,5%-ный раствор гумусовых кислот увеличивает выраженность воспалительной реакции, то есть имеет место полимодальная зависимость от концентрации. Анализ результатов влияния ряда гумусовых кислот на динамику острого каррагенинового воспаления свидетельствует не только об их различной биологической активности, но и о неоднозначном влиянии на ход воспалительного процесса. Если сравнивать между собой влияние гумусовых препаратов одинаковой концентрации (Рис.46-50) на выраженность воспалительной реакции, то в концентрации 0,01% и 0,05% наибольшую активность проявляют гумусовые кислоты, снижая отек на 25% (Рис. 46) и 15% (Рис. 47) (р 0,0001) соответственно. В концентрации 0,1% и 0,2% максимальному уменьшению отека способствуют гуминовые кислоты: - 30% (р 0,01) (Рис. 48, 49). Все гумусовые кислоты, за исключением гуминовых в максимально используемой концентрации вызывали усиление каррагенинового отека (Рис. 50).
Из всех исследуемых препаратов в широком диапазоне концентраций наиболее активным оказался 0,2%-ный раствор гуминовых кислот, который практически полностью снял отек. Для фульвокислот наиболее активной оказалась концентрация 0,05%, для гумусовых кислот -0,01%, для гиматомелановых -0,1% и 0,2% соответственно. Наиболее эффективным для всех препаратов оказалось действие 0,1%-ных растворов, при этом противовоспалительная активность возрастала в ряду: фульвокислоты (14,2%), гиматомелановые кислоты (30,1%), суммарный препарат (35,4%), гуминовые кислоты (39,8%) (Рис.51 ).
Препараты достоверно уменьшали воспалительный процесс во все сроки наблюдения, достигая максимального действия к третьему часу. По прошествии двух суток объем лапки уменьшался до исходного, тогда как в контрольной группе выздоровление наступало на третьи сутки. Сравнительное действие в гуминовых в максимально используемой концентрации вызывали усиление каррагенинового отека (Рис. 50).
Из всех исследуемых препаратов в широком диапазоне концентраций наиболее активным оказался 0,2%-ный раствор гуминовых кислот, который практически полностью снял отек. Для фульвокислот наиболее активной оказалась концентрация 0,05%, для гумусовых кислот -0,01%, для гиматомелановых -0,1% и 0,2%. Наиболее эффективной для всех препаратов оказалась доза 0,1 % и 0,2%. Наиболее эффективной для всех препаратов оказалась доза 0,1 мг/кг, при этом противовоспалительная активность возрастала в ряду: фульвокислоты (14,2%), гиматомелановые кислоты (30,1%), суммарный препарат (35,4%), гуминовые кислоты (39,8%) (Рис.51 ). Препараты достоверно уменьшали воспалительный процесс во все сроки наблюдения, достигая максимального действия к третьему часу. По прошествии двух суток объем лапки уменьшался до исходного, тогда как в контрольной группе выздоровление наступало на третьи сутки. Сравнительное действие в ряду гумусовых кислот с официальным препаратом диклофенака натрия (Рис. 52) показало, что применение этого нестероидного противовоспалительного средства в виде 0,1% рас 185 твора (1,0 мг/кг) лишь незначительно уменьшает отек только на первой стадии воспаления. Использование диклофенака натрия в виде 2,5% (25 мг/кг) раствора уменьшило отечность лапки почти на 20%, но увеличило длительность воспалительной реакции. Угнетение отека под действием фульвокислот различной концентрации свидетельствует о менее выраженном влиянии на патологический процесс по сравнению с 2,5% раствором диклофенака натрия. Фульвокис-лоты также оказывают максимальное воздействие через 1 и 3 часа, но их эффективность в 2 раза слабее (Табл. 34). Необходимо отметить, что через 72 часа отек под воздействием диклофенака натрия остается более выраженным. Для гиматомелановых кислот характерно более эффективное воздействие на выраженность отека, но удлинено время его протекания (табл.35). Максимальным противовоспалительным эффектом обладают 0,2% растворы гумусовых кислот, но уже в концентрации 0,5%, они усиливают воспаление. Общая картина угнетения отека, рассчитанная по формуле Тринус представлена на рис. 53. Результаты свидетельствуют о полимодальности влияния всех препаратов в зависимости от дозы. Регламентирующие документы МЗ РФ позволяют рекомендовать тот или иной препарат для исследования в качестве противовоспалительного средства, если выраженность каррагенинового отека через 3 часа под его влиянием уменьшается не менее чем на 30%. Как следует из рисунка 53 таким критериям отвечают гиматомелановые кислоты (0,01%, 0,1%, 0,2%); гуминовые кислоты 0,1%, 0,2%, 0,5%); гумусовые кислоты (0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,2%).
Следует отметить, что 0,01% -ный раствор гиматомелановых кислот, 0,2%-ный раствор гуминовых кислот, 0,01%, 0,1%, 0,2%-ные растворы гумусовых кислот обладают более выраженным противовоспалительным эффектом, чем 2,5%-ный раствор диклофенака натрия.
Морфологические исследования показали, что введение физиологического раствора в лапку не вызывает каких-либо изменений в лимфатических узлах (как на стороне введения, так и на противоположной стороне) и селезенке крыс.
