Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9
1.1. Промышленное Цветоводство 9
1.1.1 Хризантема 10
1.2. Размножение декоративно-цветочных культур в условиях in vitro 12
1.3. Культивирование хризантем в условиях in vitro 23
1.4. Оздоровление посадочного материала от вирусов 25
1.5. Карлавирусы 28
1.5.1. Морфология и физико-химические свойства вирусных частиц 29
1.5.2. Симптоматика и круг хозяев 33
1.5.3. Цитопатология 35
1.6. В Вирус хризантемы 35
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3 8
2.1. Объект исследования 38
2.2. Культура изолированных тканей хризантемы 43
2.2.1. Техника культивирования in vitro 43
2.2.2. Условия культивирования 43
2.2.3. Статистическая обработка результатов 44
2.3. Выделение тотальной РІЖ из растительной ткани 44
2.3.1.Выделение тотальной растительной РНК тризольным методом 45
2.3.2. Выделение тотальной растительной РНК по модифицированному методу Хомчинского 45
2.3.3. Выделение тотальной растительной РНК на основе LiCl 46
2.4. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (RT-PCR) 47
2.5. Электрофорез нуклеиновых кислот 49
2.6. Выделение амплифицированных фрагментов из продукта PCR 49
2.7. Секвенирование продуктов PCR 50
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 51
3.1. Методы выделения тотальной РНК 51
3.2.Идентификация В вируса хризантем методом RT-PCR 54
3.2.1.Характеристика праимеров, используемых для выявления ВВХ методом RT-PCR 54
3.2.2. Влияние концентрации РНК хризантем для обратной транскрипции на протекание RT-PCR 58
3.3. Анализ ВВХ в растениях некоторых сортов хризантем, выращиваемых в условиях теплицы 60
3.4. Анализ нуклеотидной последовательности изолята ВВХ, распространенного в растениях хризантем 64
3.5. Введение полевых клонов хризантем в культуру in vitro 67
3.5.1. Изолирование и стерилизация первичных эксплантов 67
3.5.2. Изучение морфогенетического потенциала различных эксплантов хризантем 71
3.5.3. Культивирование черенков хризантем in vitro IS
3.5.4. Зависимость микроразмножения хризантем in vitro от состава питательной среды и условий выращивания 76
3.6. Оздоровление посадочного материала от ВВХ 83
3.6.1. Схема получения оздоровленных растений хризантем 84
ВЫВОДЫ 87
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 89
Введение к работе
Хризантемы сегодня входят в список наиболее популярных цветочных культур, которые распространены по всему миру. Для потребителя предлагаются как срезочные, так и горшечные, садовые и тепличные растения. По объему продаж хризантемы уступают только розам. Более чем за 2000-летнию историю культуры создано около 7000 сортов хризантем, часть из которых используют в кулинарии, в фармацевтической промышленности, а также в качестве инсектицидов.
В настоящее время существует много различных сортов хризантем отечественной и зарубежной селекции, которые являются перспективными для использования их в озеленении, особенно в южных районах Российской Федерации. Для выращивания в средней полосе европейской части России предпочтение отдают финским, немецким, английским, голландским и местным сортам; французские и китайские используют на юге.
Выращивание хризантем часто связано с физиологическими проблемами. Например, культивирование растений в условиях ограниченного пространства питания часто приводит к угнетению роста, нарушению образования бутонов и развитию дегенеративных цветков, поражению листьев. Данные физиологические отклонения могут привести к гибели растения (Миронова, 2006).
Вегетативное размножение хризантем связано с существенным накоплением в их искусственных популяциях различных заболеваний. Основной урон цветочной продукции наносят в этом случае вирусные заболевания, которые не поддаются химическому контролю. Наибольшее распространение в растениях хризантем получил В вирус хризантем (ВВХ), который приводит к снижению качества товарной продукции и привлекательности для покупателя. По прогнозам ученых в XXI веке роль вирусных заболеваний будет возрастать, поэтому обнаружение, идентификация, изучение строения и экспрессии генома вирусов, а также
получение оздоровленного посадочного материала является актуальной проблемой не только для цветоводства, но и для всего растениеводства.
Цели и задачи исследований: идентификация в растениях хризантем ВВХ и создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала. В задачи исследований входило:
Подбор оптимального метода выделения тотальной РНК из тканей хризантем.
Подбор оптимальных условий для проведения RT-PCR.
Анализ ВВХ в растениях некоторых сортов хризантем, выращиваемых в тепличных условиях.
Введение полевых клонов хризантем в культуру in vitro.
Изучение морфогенетического потенциала различных эксплантов хризантем in vitro.
Изучение зависимости микроразмножения хризантем in vitro от состава питательной среды и условий выращивания.
Создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала и тестирование пробирочных растений на наличие вируса.
Научная новизна и значимость. Оптимизирована методика диагностики ВВХ, включающая протокол выделения РНК, набор праймеров и условия метода PCR. Выявлены сорта (Помпон сиреневый и Лучистая), способные подавлять влияние В вируса хризантем. Установлена степень гомологии между штаммом ВВХ, распространенным на территории Главного Ботанического сада, и штаммами Chail и Bangalore, которая составила 94%-95% соответственно. В результате проведенных экспериментов усовершенствована технология клонального микроразмножения хризантем, позволяющая получать до 100 тыс. растений в год с одного узла независимо от сроков- введения в культуру in vitro. Выявлено, что распространение В вируса хризантем в пробирочных растениях неравномерное, причем максимальная его концентрация отмечается в нижних ярусах растений.
Проведенные исследования показали, что использование в качестве транспланта при клональном микроразмножении хризантем только верхней части пробирочных растений (макс. 2 междоузлия) возможно получать более качественный посадочный материал за счет снижения нагрузки вируса на целое растение или осуществлять оздоровление посадочного материала.
Практическая ценность исследований. Полученные данные свидетельствуют о том, что подобранная методика по идентификации ВВХ может быть применена для тестирования различных сортов хризантем на наличие вируса у растений разного происхождения. Обнаружены два сорта (Помпон сиреневый, Лучистая), способные подавлять влияние В вируса хризантем, которые являются перспективными для дальнейшего их применения в селекционном процессе. Усовершенствованная технология клонального микроразмножения хризантем направлена на повышение эффективности их производства. Разработанная схема получения оздоровленных растений хризантем может быть применена для производства качественного посадочного материала, а также при проведении селекционных работ.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007), на Международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии» (Брянск, 2008), на Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения» (Саранск, 2008), на Международной конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в развитие инноваций в аграрной науке» (Москва, 2009).
Хризантема
Хризантема {Chrysanthemum) — многолетнее растение из семейства сложноцветных (Asteraceae Dum.). Стебли прямостоячие высотой 25—120 см, иногда сильно разветвленные, на углубленной в почву части стебля развиваются столонообразные подземные побеги. Листья стеблевые, очередные, сильно варьируют по форме и рассеченности. Верхняя поверхность листьев зеленая, редко опушенная, нижняя — тускло- или серовато-зеленая может быть с довольно обильным опушением. Соцветия хризантемы — корзинка. Цветки в корзинке неоднородны. По краю располагаются язычковые женские цветки, а в середине — трубчатые, обоеполые. В трубчатых цветках находятся 5 тычинок, которые срослись с венчиком. Соцветия различаются- величиной, строением, формой и расположением цветков. Корневая система мочковатая (Дьяченко, 2004).
Хризантема - растение короткого дня: сокращение длины дня ускоряет развитие растений, вызывает закладку и формирование соцветий, поэтому их цветение начинается в августе и заканчивается в декабре. Высокорослые сорта используют на срезку, низкорослые — для горшечной культуры и высадки в открытый грунт.
Размножение хризантем. Хризантемы размножают вегетативно -черенкованием. Для получения черенков используют маточные растения, обладающие типичными сортовыми признаками (форма и величина соцветия, интенсивность окраски цветков.и продуктивность) (Hayashi et al, 2006). Их отбирают в период цветения. Осенью с них срезают всю надземную часть, так как старые стебли могут быть носителями вредителей и болезней, а удаление поросли способствует отрастанию весной большого числа побегов. Отобранные растения выращивают (по 40-50 шт./м ) в светлом вентилируемом помещении в пикировочных ящиках высотой 12 см или горшках, и хранят 4-6 недель при температуре 4-6С. Для профилактики от вредителей (нематоды) перед посадкой корни очищают от субстрата и погружают в горячую воду (на 2 мин при 52С или на 5 мин при 45С). Ранние сорта черенкуют с ноября до конца мая, средние - с марта до июня, поздние - с марта до июля (Миронова, 2004).
Как только на маточниках начинают отрастать побеги, температуру и влажность повышают. Кроме того, для постоянного роста и получения однородного посадочного материала в любое время года необходимо дополнительное освещение 14-16 часов при оптимальной интенсивности света 1000-2000 люкс (ртутные лампы ДРЛ-40К), что приводит к увеличению выхода черенков до 70% и сокращению периода их укоренения на 7 дней (Миронова, 2006).
Черенки срезают с побегов второго, третьего и четвертого порядка длиной 12-15 см, на которых распалагается 7-8 листьев. Основание черенка должно быть упругим, но не одревесневшим, что препятствует- укоренению. Не пригодны для черенкования и мягкие черенки, то есть очень молодые, так как они подвержены гниению. Верхняя часть побега, срезанная на черенок, должна быть длиной 6-8 см и иметь 3-4 листа. На срезанной части побега оставляют 2-3 листа, так как через 12-15 дней из пазушных почек развиваются побеги, которые также срезают на черенки (Zalewska et al, 2007).
Для реализации хризантем в горшках лучше использовать низкие растения позднего черенкования (апрель-май) (Миронова, 2004). Поздно размноженные декоративные мелкоцветковые сорта образуют небольшой куст, поэтому их сажают по 3-5 шт. в горшки диаметром 11-15 см.
Срезанные черенки хранят в защищенных от испарения воды контейнерах при температуре 0-1 С в течение 1-2 недель, а выращенные в хороших световых условиях и при высокой температуре (18-20С) могут сохраняться до 3-8 недель в зависимости от сорта. Черенки укореняют на стеллажах, в ящиках, наполненных снизу слоем земли или торфа (5-6 см), затем- (2-3 см) смесью песка и торфа в соотношении 2:1, высаживая на глубину 1-1,5 см по схеме 4x4 или 5x5. Быстрое укоренение хризантем происходит при температуре воздуха и почвы в пределах 16-18С. Продолжительность периода укоренения в декабре- марте составляет 20-25 дней, в апреле- мае - 12-15 дней; процент укоренения - 75-90%.
Количество черенков, заготовленных с маточника, зависит от группы хризантем. Так, в период черенкования с крупноцветковых сортов получают от 8 до 22 черенков, с мелкоцветных - до 20-30 черенков (Миронова, 2006). 1.2. Размножение декоративно-цветочных культур в условиях in vitro
Модели тонального микроразмножения. Существует несколько основных моделей клонального микроразмножения растений, характеризующихся различной степенью надежности в отношении сохранения генетической стабильности размножаемых форм, универсальности для определенного круга растений, коэффициента размножения, повторяемости результатов (Высоцкий, 1987). К таким моделям относятся:
Условия культивирования
В работе придерживались принятых на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА методик приготовления и стерилизации питательных сред, инструментов и оборудования, изложенных в практикуме «Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии» и «Практикум по сельскохозяйственной биотехнологии». (Шевелуха и др., 2004; Калашникова и др., 2006).
Экспланты стерилизовали 0,1% раствором сулемы с подбором оптимального времени обеззараживания и многократным промыванием стерильной дистиллированной водой.
Для культивирования хризантем использовали минеральную основу питательной среды Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962) в сочетании с агаром и сахарозой. В качестве регуляторов роста в питательную среду добавляли БАП, кинетин (К), НУК, ИУК, в различных концентрациях и комбинациях (таб. 2)
Культивирование эксплантов осуществляли в пробирках, чашках Петри, а также в колбах в световой комнате, где поддерживалась относительная влажность воздуха 70%, температура 23±1С, 12-часовой фотопериод или в климакамере с температурой 25С. Освещение осуществляли белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 2,5-5 тыс люкс.
Пересадку микрокультуры осуществляли с подбором оптимального времени культивирования, которое определялось скоростью роста микрорастений.
В экспериментах оценивали: количество первичных эксплантов, способных к прямому морфогенезу; интенсивность роста и развития микрокультуры; скорость вторичной регенерации; способность к ризогенезу и адаптации микрорастений к почвенным условиям.
Методы выделения тотальной РНК
Современные методы молекулярной биологии позволили использовать ее достижения в области диагностики вирусов растений, животных и человека. В основе методов молекулярной диагностики лежат иммунологические подходы и методы обнаружения специфических нуклеиновых кислот. При диагностике ВВХ наибольшее распространение получили методы идентификации вирусной инфекции с использованием PCR (Saiki et al, 1988; Aleraandri etaL, 2005).
Наибольшее число фитовирусов в качестве генома имеют одну или несколько молекул РНК, а проводить PCR прямо с РНК невозможно, так как Taq-полимераза является ДНК-зависимой. Поэтому после выделения РНК проводят реакцию обратной транскрипции, которая заключается в построении первой цепи ДНК с РНК ферментом ревертазой. После этого проводят PCR, которая заключается в многократном накоплении определенного специфичного фрагмента генома искомого патогена с использованием ДНК полимеразы. Этот фрагмент благодаря его высокой концентрации можно легко детектировать различными методами.
Выделение тотальной РНК из растений является необходимым этапом при диагностике РНК содержащих вирусом методом PCR. Клетки хризантемы содержат большое количество полисахаридов и фенолов, которые могут затруднять выделение РНК и ингибировать ферменты РНК-зависимую ДНК-полимеразу (ревертазу) и ДНК-полимеразу, участвующие в реакциях обратной транскрипции и PCR. Например, фенол снижает эффективность PCR при содержании 0,2%, а при его концентрации 0,5% реакция останавливается (Kovarova, 2000). Поэтому ключевыми моментами при выделении РНК являются сведение к минимуму рибонуклеазной активности на всех этапах выделения, исключение возможности случайного внесения РНКазы, а также уменьшение содержания органических примесей в полученных образцах.
Выделение нуклеиновых кислот хризантем представляет собой весьма длительный и сложный процесс. Полученные препараты РНК хризантем могут быть загрязнены различными примесями, характеризоваться значительной степенью деградации, и как следствие, невозможностью их дальнейшего применения для проведения анализа.
С целью подбора наиболее оптимального метода выделения РНК из тканей хризантем проводили сравнение различных методов (Хомчинский, Тризольный метод и на основе LiCl).
Для получения достоверных результатов по сравнению различных методов выделение РНК осуществляли из образцов ткани тепличных растений одинаковой массы (100 мг листьев) и соблюдали пропорциональные соотношения при использовании реактивов. Эффективность различных методов оценивали по качеству полученных препаратов. Эти характеристики определялись с помощью электрофореза в агарозном геле.
