Введение к работе
Актуальность работы
Процессы порчи пищевых продуктов во многом обусловлены наличием общего типа контаминаитов - присутствием спор бактерий
Молоко, поступающее на завод, изначально заражено вегетативными клетками и спорами Инактивация спор происходит при температуре свыше 120С, но обработка при повышенной температуре негативно сказывается на технологических свойствах молока и качестве получаемых из него продуктов. Альтернативой жестким режимам тепловой обработки может быть обработка в более мягких условиях (пастеризация), но она не обеспечивает необходимой защиты.
Следующая проблема - проблема безопасности хлебобулочных изделии, связанная с повышенной зараженностью муки спорами бактерий рода Bacillus, вызывающих картофельную болезнь хлеба (КБХ) Известно, что бактерии рода Bacillus могут вызывать у ослабленных людей заболевания желчного пузыря, менингиты, артриты, перитониты, эндокардиты
Проблема качества муки является актуальной, с одной стороны, для производства здорового хлеба потребителю, с другой стороны Россия после вступления в В Ю становится потенциальным экспортером муки Товары, представляемые с граной-экспортером, должны соответствовать международным стандартам по показателям безопасности.
Несмотря на множество разработанных методик оценки зараженности муки бактериями-возбудителями КБХ, до сих пор единственным способом проверки муки является метод пробной лабораторной выпечки
В связи с этим разработка методики по оценке качества муки в отношении возбудителей КБХ является актуальной
Цель работы - изучение контаминаитов и разработка методов деконта-минации продуктов повседневного потребления - молока и хлеба
Основные задачи: провес га экспериментальное изучение влияния низина на кинетику гибели споровых микроорганизмов в диапазоне температур пастеризации на примере контаминаптов из молока,
разработать математическое описание кинетики гибели споровых контаминаптов в присутствии низина,
исследовать влияние низина на газообразующие контаминанты кисломолочных продуктов,
исследовать развитие споровых контаминантов в опытных образцах хлеба в процессе хранения,
исследовать динамику развития спор бактерий-возбудителей картофельной болезни хлеба в модельной среде,
исследовать амилолитическую и протеолитическую активности бактерий-возбудителей картофельной болезни хлеба,
- исследовать термоустойчивость спор бактерий-возбудителей карто
фельной болезни хлеба,
- разработать методы оценки картофельной болезни в муке и хлебе
Научная новизна: изучено влияние добавок низина на кинетику терми
ческой деконтаминации споровых контаминантов, вызывающих порчу молоч
ных продуктов, и установлены значения стерического коэффициента А и энер
гии активации Е,
предложен способ расчета режимов тепловой обработки, обеспечивающий сохранность продуктов в условиях жаркого климата,
установлено ингибирующее действие низина на неспоровые газообразующие кошаминанты Lactobacillus fermentum, выделенные из молочнокислых десертов,
изучена динамика развития споровых бактерий-возбудителей картофельной болезни хлеба в опытных образцах хлеба и на модельной среде,
разработаны экспресс-методы сравнительной оценки протеолитической и амилолитической активностей бактерий-возбудителей картофельной болезни
хлеба в образцах муки и показана корреляция этих параметров с заболеваемостью хлеба
Практическая иіачнмость; исследована чувствительность газообразующих контаминантов к низину и молочной кислоїе, определена доза низина -40 мг/кг, обеспечивающая деконтаминацию творожных десертов,
- установлена рациональная доза внесения препарата низина в молоко - 10
мг/л для снижения уровня теплового воздействия на компоненты молока, обес
печивающая микробиологическую безопасность готовых продуктов в сезон по
вышенного микробного фона молока,
-изучено влияние остаточного низина на развитие заквасочной микрофлоры молочных продуктов и установлено, что низин не влияет на общее время сквашивания молока с массовой долей жира 0,5 % и 3,5 %,
разработаны методики оценки микробиологического качества муки и хлеба по содержанию споровых бактерий-возбудителей КБХ,
предложены показатели сравнительной оценки протсолитической и амилолитической активности бактерий-возбудителей КБХ
Апробация работы Результаты диссертационной работы докладывались на 2-й Международной конференции Наука-Бизнес-Образование Биотехнология-Бизнес-Окружающая среда в Пушино, ИБФМ, 2005 г, на 10-й и 11-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых в Пущино, ИБФМ, 2006, 2007 п , на Научной конференции студентов и молодых ученых МГУИЭ, 2008 г, на Всероссийской выставке научно-технического гворчества молодежи НТТМ, Москва, 2008 г
Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 работ
Структура и объем работы Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты экспериментов и их обсуждение, выводы, список литературы
Обоснована актуальность темы, сформулированы положения, выносимые на защиту, научная новизна, сведения о личном вкладе соискателя Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Рассмотрены причины и источники микробиологической порчи пищевых продуктов, контаминанты молока и хлеба Изложены методы предотвращения порчи пищевых продуктов, особенно термические, а также имеющиеся в настоящее время данные о кинетике термической деконтаминации продуктов Представлена сравнительная характеристика методов борьбы и определения зараженности муки и хлеба возбудителями КБХ Проанализированы работы Барановой И П, Мазохиной-Поршняковой Н Н, Матвеева В Е , Богатыревой Т Г, Поландовой Р Д, Поляковой С П , Delves-Broughton J , J С , Hurst A, Mansour М, Peskera ТI и др Анализ литературы позволил сформулировать цель и задачи исследования.
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Работу проводили на кафедре «Экологическая и промышленная биотехнология» МГУИЭ, исследование молока и молочных продуктов на базе ОАО Лианозовский молочный комбинат и на кафедре «Стандартизация, сертификация и управление качеством пищевых продуктов» МГУПБ, исследования муки и хлеба совместно с ГНУ ГОСНИИХП Россельхозакадемией Объекты исследований - молоко, молочные продукты и пшеничная мука
Исследования проводили по двум основным направлениям
изучение кинетики деконтаминации молочных продуктов с низином,
диагностика возбудителей КБХ в муке и хлебе
По первому направлению использовали методы выделения термостойких споровых контаминантов из молока и неспоровых контаминантов из молочных продуктов, методы идентификации споровых контаминантов с использованием определителя Берги и неспоровых с помощью системы АРІ произ-
водства «BioMeneux», метод определения термоустойчивое ги контамиканюв, ориіинальньїи метод определения чувствительности лактобацилл к низину, метод определения КМАФАнМ по ГОСТ 9225-84, определение низина в пробах молочных продуктов методом диффузии в аі ар с тест-культурой Bacillus coaqu-lans ВСЕ 15-204 В молоко и молочные продукты вносиш российский препарат низина «БИЗИН 1000» В качестве стандарта использовали импортные препараты «Низаплин» и «Кризин»
По второму направлению - метод определения общего количества бактерий КБХ в хлебе, метод определения амилолитической активности согласно ГОСТ 20264 4-89, методы определения протеолитической активности согласно ГОСТ 20264 2-89 и оригинальный метод, основанный на гидролизе казеината натрия, методы определения желатиназной активности бактерий КБХ в пробирках и тонком слое, метод определения кинематической вязкости с помощью вискозиметра
Все экспериментальные исследования проведены не менее чем в трех по-вторностях Для сташетической оценки результатов использовали расчет дисперсии воспроизводимости относительного отклонения величины, усредненный по большому массиву экспериментов, расчет доверительных интервалов средних значений и разницы двух значений
Глава 3. ВЛИЯНИЕ НИЗИНА НА КИНЕТИКУ ИНАКТИВАЦИИ СПОРОВЫХ КОНТАМИНАНТОВ ПРИ ТЕПЛОВОЙ ОБРАБОТКЕ
Изучали действие низина на споровые формы в условиях пастеризации Споровый контаминант выделяли из сырого молока, получешюго с приемного пункта Лианозовского молочного комбината В результате идентификации установлено, что культура относится к р Bacillus подвид lentus Была принята исходная концентрация споровою контаминанта не менее 10 спор/мл Прогрев проводили в фосфатном буфере с рГГ=6,8 при температурах 75±0,5, 85±0,5, 97+0,5 С в термостатированной водяной бане Время выдержки проб составля-
ло 5, 7, 10, 20, 30, 45 и 60 мин В работе исследовали концентрации низина 25, 50,75, 100 и 125МЕ/мл
Данные по кинетике гибели клеток контаминанта представлены на ри-
сунках 1, 2, 3, соответственно
Для описания гибели микроорганизмов при нагревании использовали
принягую в биотехнологии модель, в которой исходное уравнение
dN/dt = - К х N, (1)
где К - удельная скорость гибели микроорганизмов, т - время температурной обработки, N - количество жизнеспособных микроорганизмов
В соответствии с уравнением (1) ожидаемой является линейная зависимость IgN от времени Однако при всех концентрациях низина можно выделить
участок от 0 до 10 минут с высокой скоростью гибели контаминанта. Это связано с наличием нескольких форм контаминанта, из которых одна более лабильная. Поэтому в дальнейшем при обработке результатов учитывали участок кривой от 10 минут и более, что позволяет оценить условия выживаемости наиболее термоустойчивых контаминантов.
По экспериментальным данным рассчитаны значения удельной скорости гибели контаминантов К. Для определения кинетических характеристик контаминантов А и Е (табл. !) использовали уравнение Лррениуса:
E/(RT)
К=А*е
или lnK=lnA-E/(RT).
(2)
Таблица 1 Значения кинетических характеристик A, IiiA и Е при разных концентрациях низина
Рис.4 Зависимость энергии активации Е и In А от концентрации низина
1пА=39.2-0.22С
0 25 50 75 100 125 концентрация пизина, МЕ/мл
~ Экспоненциальный (1пА) Линейный (1пА)
— Экспоненциальный ( Е) Линейный ( Е)
На рисунке 4 представлены зависимости кинетических параметров А и Е от концентрации низина, которые можно описать уравнениями в экспоненциальной форме:
1пА=40.9е-00085С (3)
Е=133.6г00075С (4)
Более простое описание получается, при аппроксимации зависимости линейными уравнениями (рис.4):
(5)
Е=129.2-0.66С (6)
С - концентрация низина, МЕ/мл.
При аппроксимации экспериментальных данных экспоненциальной зависимостью величина достоверности составляет 0,98, а линейной зависимостью -0,95 Так как эти величины имеют высокие значения, то целесообразней принять для расчетов более простые - линейные уравнения (5) и (6) Преобразовывая уравнение (2) с учетом уравнений (5) и (6), получили уравнение зависимости удельной скорости гибели от концентрации низина
1пК = 39 2-0 22С -(129 2-0 66C)/(RT) (7)
К=Р*39 2"-22С " (129 2" 66С) ^RT^ (Q\
Задавая критерий стерилизации V для конкретного случая по уравнению (9) с учетом уравнения (8) можно подобрать разные режимы тепловой обработки пищевых продуктов в зависимости от концентрации низина
V = lnN0/NK=TxK, (9)
где N0 и NK - количество контаминантов до и после прогрева
Принятый ранее подход расчета тепловых режимов по наиболее термостойкому контаминанту В stearothermophilus 1518 дает жесткую обработку, позволяющий получить стерильный продукт, но его качество не удовлетворяет покупателей Введение низина снижает температуру и время обработки продукта, приближая его по качеству к натуральным
Были проведены исследования условий применения низина с целью снижения режимов тепловой обработки молока, так как сезонные изменения микробного фона молока, особенно в весенне-летний период, приводят к необходимости ужесточения режимов обработки
Изучали влияние низина на сохранность молока при различной температурной обработке В термизированное молоко вносили 10 МЕ/мл (мг/л) низина, молоко пастеризовали Полученные образцы хранили при температурах, представляющих интерес в производственных условиях, 10+2С и 24±2С в течение 24 ч Общее количество микроорганизмов в образцах с низином на порядок меньше, чем в образцах без низина Применение низина позволяет снизить
температуру пастеризации с 95±2 С до 84+2 С (табл. 2).
Таблица 2
Общее количество микроорганизмов (КМАФАнМ) и концентрация низина в
молоке после термической обработки и в процессе хранения
Время хранения молока при температуре 10"С, ч
Время хранения молока при
температуре 24С, ч
'О Т 18 Г 24"
После термюащш при 68С в течение 15 минут без низина:
4.0x10-
"5,5x10-' | 2Д)х1о4
Носле термизации при 68С в течение 15 минут с низииом 10 МЕ/мл:
.5x10'
2.0х104
4,0х104
После пастеризации при 84С в течение 5 минут без низина:
2,6х10г
3,2x104
4,9х105
После пастеризации при 84С в течение 5 минут с низином 10 МЕ/мл:
1,0x10"
2,6х102
После пастеризации при 95С в течение 5 минут без низина:
6,0x101
3,0x10"
'6x10-
2,0x104
Влияние остаточного низина на развитие заквасок. Изучали влияние остаточного количества низина на развитие микрофлоры заквасок, используемых при производстве творога (L.lactis, L.cremoris) (рис.5). Температура пастеризации молока для контрольных образцов 95±2С. В пастеризованное молоко с массовой долей жира 0,5 и 3,5% вносили закваску из мезо-фильных культур. В процессе сквашивания определяли активную кислотность. В молоке с
0,5% жира скорость нарастания кислотности - о - 30С,ж =0,5% (контроль)
*~30С, ж = 0,5% сниїином происходит быстрее в низинсодержащем об-
—— 30С ж =3,5% с низииом s г
-Д--30С, ж = 3,5% (контроль] разце в сравнении с контролем, а при 3,5%
Рис.5.Влияние низина на скорость
сквашивания молока с различной жирности скорости в образце с низином и в
массовой долей жира творожной
.. „„,, * F контрольном практически одинаковы,
закваской - 30x1 С
Таким образом, предварительная пастеризация молока с низином не ухудшает качества кисломолочных продуктов.
Экономическая оценка: при применении низина стоимостью 7000 руб./кг в рекомендованных дозах 10 мг/л затраты для молока составят 70 руб./т молока.
Глава 4. ПРОВЕРКА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ГАЗООБРАЗУЮЩИХ КОИТАМИНАНТОВ К НИЗИНУ, МОЛОЧНОЙ КИСЛО ГЕ И ЛАКТАТУ КАЛЬЦИЯ
Очевидно, что при производстве молочных продуктов из пастеризованного молока, даже подвергшихся термизированию, существует опасность попадания в готовый продукт остаточной микрофлоры
Были выделены контаминанты, вызывающие порчу герметически упакованных молочных продуктов, и идентифицированы как Lactobacillus fermentum Для исследований выбраны три штамма, распределившиеся по степени газообразования в следующем порядке Lfermentum 2 (Lb2) (наибольшая) -L fermentum 1 (Lbl) - L fermentum 8 (Lb8) (наименьшая)
Наиболее газообразующий штамм Lb 2, был проверен на термоустойчивость Культура выдерживала прогрев при 80 С в течение 9 минут и только при 90 С - 7 минут рост культуры не наблюдался Результаты подтверждают возможность контаминирования кисломолочных продуктов лактобациллами, выжившими после пастеризации молока
Проверка чувствительности L. fermentum к молочной кислоте и лактату кальция
Была изучена чувствительность выделенных контаминантов к молочной кислоте на модельных средах в опыте m vitro Молочная кислота в испытанном диапазоне концентраций при рН 4,00±0,02 подавляла развитие лактобацилл (табл 3) Штамм Lb2 полностью подавлялся при стартовых нагрузках 102 и 105 КОЕ/мл, а штамм Lbl и Lb8 только при 102КОЕ/мл
Содержание молочной кислоты, образуемой естественным путем в твороге 9 г/кг, а концентрация 11 г/кг может придавать кислый вкус продукту Была изучена возможность замены молочной кислоты лактатом кальция Суммарная концентрация лактат-иона в опыте составляла 11-12,6 г/л Значение рН на уровне 4,84±0,02
Таблица З Интенсивность роста шгаммов L fermentum in vitro в зависимости от концентрации молочной кислоты в питательной среде
+
«4 + +» - хорошо выраженный рост
Примечание
«-» — нет роста,
«+» - едва заметный рост,
Среду Рогоза инокулировали штаммами Lbl, Lb2 и Lb8 так, что концентрация в среде составляла 102 и 105 КОЕ/мл Подавления роста не наблюдалось ни в одном из вариантов
Проверка чувствительности коптаминантоп L.fermentum к низину
Следующим этапом было определение чувствительности ллкюбацилл к
низину в опыте in vitro на модельной среде (табл 4)
Таблица 4 Чувствительность газообразующих штаммов L fermentum к. низину при начальной концентрации лактобацилл 10 КОЕ/мл и 10 КОЕ/мл
Примечание (ОП-оптическая плотность)
«+++» максимум по ОП на 20 ч <<+» максимум по ОП на 40 ч
«++» максимум по ОП на 30 ч «-» роста нет
Среду MRS-бульон инокулировали штаммами Lbl, Lb2, Lb8 так, чтобы стартовая нагрузка сосгавляла 104 и 10б КОЕ/мл Чувствительность проверяли в присутствии низина 20,40, 60, 80, 100 и 140 МЕ/мл, пробы термостатировали
при 30±0,5 С Контролем служила среда без низина
Развитие Lbl и Lb2 полностью подавлялось при концентрации низина 40 МЕ/мл, а штамм Lb 8 оказался устойчивым к действию низина и выдерживал концентрацию 100 МЕ/мл без задержки роста при 10б КОЕ/мл
Проверка чувствительности L.fermentum к низину и молочной кислоте в творожных десертах
Были приготовлены опытные образцы («Чудо-творог» с черносливом -
175 г, жирность 4 %), в которые вносили низин и контаминировали штаммами
Lb2 и Lb8 Образцы инкубировали при температурах 25+1 С и определяли в
них концентрацию тестовых штаммов (табл 5)
Таблица 5 Прирост численности1 (AlgKOE/r) лактобацилл в творожных десертах в процессе хранения
Примечание Стартовая нагрузка (подчеркнуто) это абсолютная численность, а прирост - увеличение относительно стартовой нагрузки, т е численность к концу инкубирования равна стартовая нагрузка плюс прирост и составляет около 8,0-9,0
Закономерности поведения штаммов, отмеченные в опытах in vitro, справедливы и для экспериментов с десертами Низин в концентрациях 40 и 60 мг/кг задерживал развитие Lb2 с эффективностью даже большей, чем молочная кислота, и не задерживал рост Lb8 по сравнению с контролем
Действие лактата из молочной кислоты, вводимого в продукт в количестве 2,0 г/кг, подавляло развитие обоих штаммов лактобацилл Lb2 и Lb8 Однако,
при введении такого количества молочной кислоты изменяется активная кислотность продукта до рН 3,99+0,01.
В образцах измеряли концентрацию низина в начале эксперимента, а также на 1-е и 5-е сутки (рис. 6). На 5-е сутки в пробах творога с контаминан-том Lb 2 количество низина в продукте не уменьшалось їж в одном варианте.
-я—Lb2,H-40,10(2' —A— Lb 2, Н-60,10(2)
Рис. 6. Содержание низина в процессе хра- Рис. 7. Содержание низина в процессе
нения в образцах «Чудо-творога», контами- хранения в образцах «Чудо-творога»,
нированных L. fermentum 2 контаминированных L. fermentum 8
При контаминировании Lb8 концентрация низина в пробах падала с большой скоростью в образцах со стартовой нагрузкой 10 КОЕ/г (рис.7), что обусловлено разрушением низина культурой L. fermentum.8.
Была выработана опытная партия творожных изделий с низином в количестве 40 мг/кг, хранение десерта при температуре 6±0,5 С в течение 21 дня не выявило никаких отклонений в органолептических показателях.
Таким образом, применение низина позволит получать безопасные молочные продукты с сохранением большей пищевой ценности.
При применении низина стоимостью 7000 руб/кг в рекомендованных дозах 40 мг/кг затраты для творожных десертов составят 280 руб/т продукции.
ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ КОНТАМИНАН ГОВ МУКИ -ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КАРТОФЕЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ХЛЕБА (КБХ)
Исследование динамики развития картофельной болезни в опытных образцах хлеба в процессе хранения
Из исследуемых образцов муки выпекали хлеб по методу пробной лабораторной выпечки, образцы помещали в провоцирующие условия. В образцах в процессе хранения на 18, 24, 40 и 48 ч определяли наступление КБХ по органо-лептическим и микробиологическим показателям (рис. 8).
Ч 55
И 45
s
s 40 +
I 30
а 20
«L 10
В 5
Время хранениям
Рис.8 Динамика развития КБХ по микробиологическому показателю Вид столбцов соответствует степени нарастания заболевания, сверху над столбцами указаны номера образцов муки.
Первые признаки заболевания появлялись при содержании бактерий 106 КОЕ/г - легкий фруктовый запах, при увеличении их до 10 КОЕ/г - добавлялся слабый запах КБХ, свыше 107 КОЕ/г - сильный запах КБХ.
Таким образом, показано, что хлеб по органолептическим признакам может не вызывать опасности, а содержание бактерий в нем превышает нормы, допустимые для пищевых продуктов, то есть больше 103 КОЕ/г по показателю КМАФАнМ согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 (п. 1.4.7.1-1.4.7.4).
Был проведен сравнительный анализ по оценке количества бактерий выросших на агаризованной среде при глубинном и поверхностном способах посева При глубинном способе количество бактерии занижено более чем в 10 раз Для дальнейших исследований был выбран способ поверхностного посева для количественной оценки бактерий КБХ в муке и хлебе
Содержание бактерий в хлебе определяли следующим образом 10±0 1 і исследуемого образца измельчали и суспендировали Из надосадочнон жидкости делали высевы на идентификационную среду
Для определения в муке количества бактерии-возбуди гелей КБХ разработана идентификационная агаризованная среда, позволяющая определять визуально амилолитически активные колонии по реакции с йодом После засева и термостатирования чашек Петри на поверхность агара наносили раствор йода, происходило окрашивание среды в синий цвет, а зоны гидролиза крахмала вокруг амилолитически активных колоний не окрашивались, что является характерным признаком бактерий КБХ
В результате разработана методика оценки микробиологического качества хлеба по содержанию споровых бактерии-возбудителей КБХ
Исследование развития бактерий-возбудителей КБХ в муке
Для выделения споровых бактерий образцы муки обычно ресуспендиру-ют, прогревают и затем делают высевы на питательные среды
В литературе описаны различные режимы прогрева для получения спор возбудителей КБХ 70-75С - 5 мин, 80С - 30 мин, 90-95С - 10 мин Споры Bacillus могут выживать в процессе выпечки хлеба в центре мякиша, где температура 9б-100С Для уточнения условий термической обработки суспензии муки проведена оптимизация по четырем параметрам концентрация муки в суспензии, температура, время, состав жидкой среды для прорастания спор
Подбор концентрации суспензии по сухим веществам В вышеуказанных режимах предлагается 10%-ная суспензия муки, при заваривании которой получается сгусток, что приводит к увеличению ошибки опыта Были исследова-
ны концентрации муки - 1% и 5% Содержание спор в муке около 100 КОЕ/г невозможно определить в 1%-ной суспензии Для работы была выбрана 5%-ная концентрация суспензии муки
Подбор режима прогрева суспензии муки Исследовали три режима прогрева суспензии муки, указанные выше В результате высевов наблюдали неоднородность культуры и не все колонии обладали амилолитической активностью Однако, при анализе заболевшего хлеба, выпеченного из этих образцов муки, все колонии были амилолитически активны Это наблюдение заставило более детально исследовать условия прогрева муки
Исследование динамики нагрева 5%-ной суспензии муки в количестве 100 мл в водяной бане показало, что нагрев до 96 С продолжался в течение 23±1 минут, далее рост температуры не происходил После прогрева и охлаждения пробу термостатировали при 37±ГС в течение 18±1 ч Высевы показали, что все колонии были амилолитически активны
Подбор жидкой питательной среды дчя прорастания спор бактерий КБХ Муку суспендировали в МПБ и 2,5% растворе NaCl в воде (такое соотношение соли и муки в тесте), прогревали, термостатировали и высевали на идентификационную среду Развитие спор в мучной суспензии с МПБ происходило быстрее, чем в мучной суспензии с 2,5% соли Оіличие в качесівенньїх показателях разных образцов муки на среде МПБ была менее заметна, поэтому для дальнейшей работы была выбрана мучная суспензия с солью
Были определены следующие условия обработки муки 5%-ная суспензия муки в воде с добавлением 2,5% NaCl, объем суспензии 100 мл, прогрев при 96±ГС в течение 10 минут
В итоге разработана методика оценки микробиологического качества муки по содержанию споровых бактерий-возбудителей КБХ
Исследование протеолитической активности бактерий КБХ в муке Характерные признаки бактерий КБХ - протеолитическая и, в частности, желатиназная активности Был проведен сравнительный анализ методов опре-
деления протеолитической активности но Г'ОСГ 20264.2-89, определения жела-тиназной активности в тонком слое желатина и в пробирках с желатиновой средой. Однако, эти методьі не позволили получить четких значений протеолитической активности по ряду причин: низкая чувствительность, нет количественной оценки.
Учитывая небольшой уровень протеолитической активности в муке исследовали метод, основанный на гидролизе казеината Na.
Провели подбор условий, при которых протеолитическая активность бактерий КБХ проявляется наиболее отчетливо. Активность определяли в суспензии муки после прогрева и термостатирования. Подбор времени гидролиза. Показания фиксировали через 3 и 5 часов. Величина зон при гидролизе 5 ч значительно больше, чем при 3 ч гидролиза (рис. 9).
I ИМ
I 14""
—'
I 12 -10
12 3 4 время, ч
рН, температура, С
Лг — Мука № I " * * " Мука №3
Мука №2 -Мука №4_"
——№3 - рН=5,85 - -я- №3-рН=6,5 —А— №3-рН=6,8
Рис.9 Зависимость диамефа зон преципитации Рис.10 Зависимость диаметра зон преципи-
от времени гидролиза на казеинатной среде тации от температуры и рН среды для раз-
личных образцов муки при гидролизе 5 ч
Подбор рН казеинатной среды. Исследовали рН 6,8; 6.5; и 5,85, последнее значение соответствует кислотности теста после выбраживания. Для всех образцов муки при рН = 5,85 зоны преципитации наибольшие (рис. 10).
Подбор температуры. Рассматривали температуру 37, 45 и 50 С. Установлено, что протеолитическая активность возрастает с увеличением температуры и достигает наибольшего уровня при 50 С, (рис.10).
Подбор концентрации казеината натрия Исследовали влияние концентрации казеината Na 0,5% и 1% на величину зон преципитации Уменьшение концентрации казеината Na приводит к увеличению зон В варианте с 0,5% картина более четкая
Подбор толщины агарового слоя Толщина агарового слоя влияет на размер зон и на погрешность Так как при толщине 2 мм в лунку необходимо вносить 50 мг пробы, а при 4 мм - 100 мг, в последнем случае воспроизводимость результатов увеличивается
Таким образом, были выбраны условия время гидролиза -5 ч, рН среды-5,85, температура - 50С, концентрация казеината Na - 0,5%, толщина агарового слоя - 4 мм, проба - 0,1 г
В результате проведенных исследований была разработана методика сравнительной оценки протеолитической активности бактерий КБХ в образцах суспензии муки
Изучение амилолигической активности бактерий КБХ в муке
При прогреве муки суспензия становится вязкой, но по мере нарастания амилолитической активности бактерий КБХ при термостатировании происходит снижение вязкости Изменение ее качества можно оценить вискозиметром
Подбор вискозиметра Оценивали кинематическую вязкость до и после термостатирования вискозиметрами ВПЖ-2 с диаметром капилляра 0,56, 1,31 и 1,77 Готовили 5%-ую суспензию, прогревали и через 18 часов термостатирования определяли вязкость Для работы выбран вискозиметр ВПЖ-2 с диаметром капилляра 1,31 мм, который позволяет определить вязкость суспензии до и после прогрева
Изучение доступности кислорода Возбудители КБХ - факультативные анаэробы и кислород оказывает влияние на их развитие Исследовали вязкость в зависимости от площади поверхности суспензии, контактирующей с воздухом Суспензию по 50 мл вносили в колбы вместимостью 250, 100 и 50 мл Поверхность контакта с воздухом составила при этом 55,9, 28,3 и 12,9 см2 Были
рассчитаны соотношения поверхность контакта к объему суспензии - S/V. Из рисунка 11 видно, что вязкость значительно зависит от площади контакта с
воздухом, то есть доступность кислорода является определяющей.
Изучение условий термостатирования. Учитывая влияние кислорода на контаминанты. был поставлен опыт в стационарных условиях и
0.0
0.5 1.0 l.Si ПРИ перемешивании. В колбы вместимостью 250
Соотношение S/V
—: мл вносили по 100 мл и по 50 мл прогретой сус-Рис. 11 Зависимость вязкости от
условий роста споровых конта- пензии и культивировали в стационарном тер-
минантов в стационарных усло
виях на 18 часов мостате и в термостатированной качалке со
скоростью перемешивания 180 об/мин. В эксисрименте контролировали количество бактерий КБХ, протеолитическую активность и вязкость на 18 часов роста (рис. 12, 13, 14).
г 25 ро
1 15 Л
я Ю
Ьг
ill
50 мл 100 мл 50 мл 100 мл стац стац перем перем
Рис.12 Зависимость количества бактерий от условий роста
I К 50 мл 100 мл 50 мл 100 мл
і ц стац стад перем перем
Рис. і 3 Зависимость протеолитической активности бактерий от условий роста
Большая доступность кислорода стимулирует прирост бактерий, протеолитиче-ская активность достигает наибольшего значения при перемешивании на качалке с объемом суспензии 50 мл. В наибольшей степени аэрация оказывает влияние на амилолитическую активность, что видно по низкому уровню вязкости в пробах при перемешивании. При объеме суспензии 50 ми при перемеши-
вании наблюдали самые низкие значения вязкости, которые для разных образцов муки были примерно одинаковы. Таким образом, чтобы зафиксировать
отличия в образцах с большей точностью были выбраны условия: перемешивание суспензии с объемом 100 мл.
Для проверки зависимостей выявленных на одном образце исследовали 5 различных образцов муки. Количество бактерий КБХ в этих суспензиях муки находились в пределах одного порядка и не давали четкой картины о степени заражения муки.
100 і
„ 80 і
«g 70
г 60
| 40
50 мл 100 мл 50 мл 100 мл стан стац перем перем
Рис. 14 Занисимость вязкости от условий роста споровых бактерий
Урозень протеолитической активности бактерий в этих образцах показывал значения, которые согласовывались со степенью заболевания хлебцев выпеченных из той же муки, но различия находились в низких пределах определения. В наибольшей степени отличия были выявлены в уровнях амилолитической активности, которые и отражали заболеваемость хлебных образцов. Таким образом, было показано, что заболеваемость хлеба в большей степени определяется
амилолитической активностью споровых контаминантов муки. Образцы № 1, 3, 7 относятся к слабозараженной муке по результатам выпечки (рис.8) и вязкость у этих образцов имеет наибольшие значения (рис.15). Хлеб из образцов муки № 8, 14 заболел на 24 часа хранения и суспензии муки показали
наименьшую вязкость. Рис. 15 Вязкость для разных образцов муки при перемешивании
В результате проведенных исследований была разработана методика
сравнительной оценки амилолитической активности бактерий КБХ в образцах
суспензии муки.
Диссертация изложена па 139 страницах, содержит 31 таблицу и 28 рисунков, список литературы включает 110 наименований
