Содержание к диссертации
Введение
1. Лигноцеллюлозосодержащее сырье и методы его конверсии 7
1.1 Ресурсы лигноцеллюлозосодержащей биомассы и характеристика её химического состава 7
1.2 Предварительная обработка лигноцеллюлозосодержащего сырья 11
1.2.1 Механическая предобработка лигноцеллюлозосодержащего сырья 13
1.2.2 Химическая предварительная обработка лигноцеллюлозо-содержащего сырья 15
1.2.3 Биологическая предварительная обработка лигноцеллюлозосодержащего сырья 18
1.2.4 Физико-химическая предварительная обработка лигноцеллюлозосодержащего сырья 19
1.3 Микробиологическая конверсия продуктов гидролиза
лигноцеллюлозсодержащего сырья в анаэробных условиях 22
1.3.1 Продуценты масляной кислоты 22
1.3.2 Метаболический путь синтеза масляной кислоты кислоты бактериями рода Clostridium 25
1.3.3 Биосинтез масляной кислоты с применением питательных сред, содержащих гидролизаты растительного сырья 26
1.3.4 Оптимизация процессов биосинтеза масляной кислоты 28
1.3.5 Влияние рН среды на биосинтез масляной кислоты 29
1.3.6 Удаление продуктов брожения из реакционной среды 30
1.3.7 Применение различных способов культивирования 31
1.3.8 Пути создания и оптимизации высокоэффективных штаммов-продуцентов масляной кислоты 32
1.4 Математическое моделирование кинетики предварительной обработки лигноцеллюлозосодержащего сырья минеральными кислотами 34
2. Материалы и методы 37
2.1 Характеристика объектов исследования 37
2.2 Проведение предварительной обработки объектов исследования 37
2.3 Проведение ферментативного гидролиза 40
2.4 Применяемые штаммы 40
2.5 Восстановление коллекционных культур из лиофилизированного материала 42
2.6 Условия культивирования 43
2.7 Общие методы анализа 44
2.7.1 Определение содержания редуцирующих веществ 44
2.7.2 Газохроматографический анализ 45
2.7.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография 45
2.7.4 Методы определения активности ферментного комплекса 46
3. Исследование процессов гидролиза лигноцеллюлоз-содержащего сырья и микробиологическая конверсия продуктов в анаэробных условиях 51
3.1 Предварительная обработка березового опила разбавленной сернистой кислотой 51
3.2 Исследование процессов ферментативного гидролиза березового опила 61
3.3 Изучение кинетики предобработки свекловичного жома раствором сернистой кислоты в диапазоне температур 200-230 С 72
3.4 Математическое моделирование кинетики выхода моносахаридов в процессе предобработки свекловичного жома сернистой кислотой 80
3.5 Микробиологическая конверсия гидролизатов растительного сырья в анаэробных условиях 90
3.6 Технологическая линия гидролиза лигноцеллюлозсодержащего сырья и микробиологической конверсии продуктов в анаэробных условиях 101
Заключение 103
Список использованной литературы 105
- Механическая предобработка лигноцеллюлозосодержащего сырья
- Биосинтез масляной кислоты с применением питательных сред, содержащих гидролизаты растительного сырья
- Проведение ферментативного гидролиза
- Изучение кинетики предобработки свекловичного жома раствором сернистой кислоты в диапазоне температур 200-230 С
Механическая предобработка лигноцеллюлозосодержащего сырья
Грубое измельчение, расщепление, резка, дробление и размалывание представляют собой различные методы уменьшения размера частиц лигноцеллюлозной биомассы [34]. В результате увеличивается удельная поверхность, снижаются степень полимеризации и кристалличность целлюлозы [35]. В ходе сбора и подготовки лигноцеллюлозной биомассы древесные стволы перерабатываются до фрагментов грубого измельчения с размером 10-50 мм. На стадии расщепления размер частиц биомассы уменьшается до 10-30 мм, после дробления и размалывания – до 0,2-2 мм. Установлено, что дальнейшее измельчение биомассы до частиц размером менее 0,4 мм не оказывает значительного влияния на скорость и эффективность гидролиза [36]. Целью расщепления сырья является снижение барьеров тепло- и массопередачи. Дробление и размалывание более эффективно уменьшают размер частиц и степень кристалличности целлюлозы, что может быть обусловлено сдвиговыми усилиями, которые создаются в ходе данных процессов [34]. Способ и продолжительность размалывания в сочетании с типом биомассы определяют степень увеличения удельной поверхности, конечную степень полимеризации и кристалличность целлюлозы. В работе [35] показано, что вибрационная шаровая мельница более эффективна, чем обычная мельница для снижения степени кристалличности целлюлозы в щепе осины или древесины хвойных пород. Дисковое размалывание до волокон более эффективно для интенсификации гидролиза целлюлозы, чем измельчение в молотковой дробилке, несмотря на получение в последней более мелких частиц [37].
Энергозатраты на механическое измельчение лигноцеллюлозной биомассы зависят от ее характеристик и требуемого конечного размера частиц. Для древесины требуются большие энергозатраты, чем для отходов сельского хозяйства [38]. Операция измельчения используется в большинстве исследовательских работ по гидролизу, но мало сведений дается о характеристиках сырья и энергозатратности данного процесса [39, 40].
Принимая во внимание высокие энергозатраты на осуществление измельчения сырья в промышленном масштабе [41] и рост спроса на энергию, маловероятно, что данная операция экономически обоснована (таблица 2).
Однако, поскольку измельчение сырья может проводиться как до химической предобработки, так и после нее, было показано, что измельчение после выполнения данной операции значительно снижает энергозатраты на измельчение, уменьшает стоимость разделения твердой и жидкой фаз, поскольку легко отделить щепу, прошедшую предобработку, позволяет исключить из процесса энергозатратное смешение предобработанной биомассы, снижает соотношение жидкой фазы к твердой, не приводит к образованию ингибиторов [44, 45].
Среди других форм физической предобработки следует отметить использование гамма-излучения [46], приводящего к увеличению удельной поверхности частиц биомассы и снижению степени кристалличности. Данный метод, несомненно, крайне дорог в промышленном масштабе и представляет огромный риск с позиции производственной безопасности и охраны окружающей среды.
По литературным данным, химические соединения, такие как кислоты, щелочи, органические растворители и ионные жидкости, оказывают значительное воздействие на исходную структуру лигноцеллюлозной биомассы [47, 48].
Предобработка такими основаниями как NaOH, KOH, Ca(OH)2, гидразин и безводный аммиак, приводит к набуханию биомассы, увеличению ее внутренней поверхности и снижению степени полимеризации и кристалличности целлюлозы. Щелочная предобработка приводит к разрушению структуры лигнина и разрыву связей между лигнином и другими углеводными фракциями лигноцеллюлозной биомассы, увеличивая, таким образом, доступность углеводов в матрице биомассы. Реакционная способность остаточных полисахаридов повышается с извлечением лигнина. В ходе щелочной предобработки также удаляются ацетил и другие заместители уроновой кислоты, снижающие доступность поверхности целлюлозы для ферментов [49, 50]. Большая часть щелочи, однако, расходуется в процессе предобработки. Щелочная предобработка наиболее эффективна для биомассы с малым содержанием лигнина, такой как отходы сельского хозяйства, с ростом содержания лигнина в биомассе ее эффективность снижается [47-50].
Предварительная обработка слабыми кислотами облегчает доступность целлюлазных ферментов для максимизации выхода сахаров [5]. Слабокислотный гидролиз является простым и быстрым способом получения гемицеллюлозных гидролизатов. Эти гидролизаты содержат, главным образом, ксилозу (80% от содержания сахара в гемицеллюлозной фракции), арабинозу, глюкозу, галактозу и маннозу в сочетании с побочными продуктами – ингибиторами, получающимися из клеточной стенки, такими как фураны, фенолы, слабые кислоты и др. [8], [9], [10].
Кислоты используются для гидролиза биомассы уже более 100 лет. Использование двухстадийного гидролиза серной кислотой для анализа лигнина датируется началом 20-го века, хотя использование концентрированной кислоты для получения сахаров было изобретено ещё в начале 19 века. Первым, кто использовал серную кислоту для гидролиза древесины и выделения лигнина, был Класон в 1906 году [21].
Кроме того, слабыми кислотами можно растворить гемицеллюлозу. Преимуществами данного вида предварительной обработки являются повышение ферментативной доступности целлюлозы и значительно увеличенная добавленная стоимость конечной продукции [23].
Серная и соляная кислоты широко используются для слабокислотного гидролиза. В работе [24] была исследована предобработка кукурузной кочерыжки слабой серной кислотой H2SO4. Оптимальными условиями предобработки являлись: концентрация серной кислоты 0,5 % масс, температура 122 С, продолжительность обработки 20 мин. При этих условиях структурная целостность кукурузной кочерыжки изменилась, микрофибриллы целлюлозы стали более доступными для ферментов. Выход сахаров составил 80 % масс, при низкой дозировке фермента (0,024 г фермента на 1 г предварительно обработанных кукурузных початков).
Биосинтез масляной кислоты с применением питательных сред, содержащих гидролизаты растительного сырья
К данной группе относится большинство используемых технологий предобработки, таких как предобработка паром, горячей водой, окисление в атмосфере паров воды, обработка жидким аммиаком и органическими растворителями [54, 55]. Данные методы предобработки основаны на совместном варьировании параметров процесса и использовании химических соединений для воздействия одновременно на физические и химические свойства биомассы.
Предобработка паром – наиболее интенсивно изучаемый и используемый физико-химический метод предобработки биомассы. Термин «автогидролиз» является синонимом предобработки паром и отражает изменения, происходящие с биомассой в ходе данного процесса [56-58].
В процессе предобработки паром биомасса обрабатывается насыщенным паром высокого давления при температуре 160-240 C и давлении 0,7 – 4,8 МПа [54-58]. Время выдержки под давлением с целью интенсификации гидролиза гемицеллюлозы составляет от нескольких секунд до нескольких минут. В результате данного вида предварительной обработки повышается доступность целлюлозы, что обусловлено гидролиом гемицеллюлоз. Считается, что гидролиз гемицеллюлозы в ходе предобработки паром сопровождается образованием уксусной кислоты из связанных с гемицеллюлозой ацетильных групп, а также других кислот. Данные соединения могут далее катализировать гидролиз гемицеллюлозы с образованием мономеров глюкозы и ксилозы. Поэтому данный процесс также называют автогидролизом [59]. В жестких условиях паровой предобработки (270 C, 1 мин) гидролиз гемицеллюлозы достигает оптимальных значений. В то же время, более низкие температуры и меньшая выдержка (190 C, 10 мин) более предпочтительны, так как позволяют избежать образования продуктов разложения сахаров, которые подавляют последующую микробиологическую конверсию продуктов предобработки сырья [60].
Эффективность паровой предобработки можно значительно повысить введением H2SO4, CO2 или SO2 в качестве катализаторов. Введение кислотных катализаторов значительно повышает выход гемицеллюлозных сахаров [20-23].
Преимущества паровой предобработки заключается в малом количестве применяемых реагентов, малых энергозатратах, отсутствии необходимости регенерации и нейтрализации реагентов. К недостаткам предобработки паром можно отнести неполное удаление лигнина, возможность конденсации и осаждения растворимых компонентов лигнина, частичное разложение ксилана и гемицеллюлозы с возможным образованием фурфурола и гидроксиметилфурфурола в условиях повышенной температуры.
Предобработка горячей водой (сольволиз, гидротермолиз, водное фракционирование) сходна с паровой предобработкой, но в ней используется жидкая вода при повышенных температурах, а не пар. Предобработка горячей водой приводит к гидролизу гемицеллюлозы и частичному удалению лигнина, увеличивает доступность целлюлозы и не сопровождается образованием продуктов деструкции сахаров, протекающим при более высоких температурах [61].
Для предобработки горячей водой используются реакторы трех основных конфигураций, различающиеся направлением потоков воды и биомассе в реакторе: реактор параллельного тока, реактор противотока и проточный реактор. Контакт воды и биомассы осуществляется в течение 15 минут при температурах 160-230 C. Под действием горячей воды происходит разрыв гемиацетальных связей, что приводит к образованию кислот в ходе гидролиза и, соответственно, способствует разрыву прочих химических связей в биомассе [61]. Авторы работы [62] установили, что образование моносахаридов и последующих продуктов разложения, которые являются катализаторами гидролиза целлюлозы в ходе предобработки горячей водой, можно свести к минимуму путем поддержания pH на уровне 4-7.
Существует несколько ключевых критериев эффективной предобработки. Процесс предобработки должен иметь низкие капитальные и эксплуатационные затраты. Он должен быть эффективным в широком диапазоне параметров и должен привести к выделению большинства компонентов сырья в виде отдельных фракций. Должна быть минимизирована необходимость подготовки сырья, например уменьшение размера частиц. Предобработка не должна вести к получению продуктов распада сахаров и лигнина, которые ингибируют действие гидролитических ферментов и рост микроорганизмов, а также процесс не должен требовать много энергии или затраченная энергия должна использоваться далее в процессе [17-22]. Стоимость применяемого катализатора и возможность его регенерации, возможность производства продуктов с более высокой стоимостью, получения гемицеллюлозных сахаров в жидкой форме для снижения использования ферментов гемицеллюлаз в последующем ферментативном гидролизе также составляет основу сравнения различных вариантов предварительной обработки [18]. Процесс предобработки того или иного сырья должен выбираться с учетом указанных особенностей, с расчетом их влияния на последующие стадии обработки в соответствии с капитальными и эксплуатационными затратами и стоимостью биомассы.
Проведение ферментативного гидролиза
За единицу ксиланазной активности принимают начальную скорость гидролиза березового ксилана, равную 1 микромолю восстанавливающих сахаров (в глюкозном эквиваленте), образующихся за 1 минут при 50 oC и pH 5,0 (0,05M Na-ацетатный буфер). Ксиланазную активность определяют, проводя реакцию гидролиза ксилана в течение 10 минут в термостатируемой (при 50 оС) градуированной пробирке (1,5 см х 1,5 см) при рН 5,0. Для этого 0,25 мл запасного раствора 1 % ксилана помещают в градуированную пробирку, добавляют туда 0,15 мл 0,05М Na-ацетатного буфера, рН 5,0, прогревают эту смесь при 50 оС в течение 5 минут. Вносят туда (фиксируя при этом начало времени реакции по секундомеру) 0,1 мл раствора анализируемого ферментного препарата, предварительного разбавленного должным образом ацетатным буфером и прогретого в течение 5 минут при 50 оС. Реакционную смесь быстро перемешивают и инкубируют 10 минут при 50 oC (в течение этих 10 минут осуществляется реакция гидролиза ксилана ксиланазой). После 10 минут реакции (по секундомеру) в пробирку добавляют 0,5 мл реактива Шомоди, перемешивают и помещают пробирку в кипящую баню на 40 минут. После этого пробирку охлаждают холодной водой (или во льду), добавляют 0,5 мл реактива Нельсона, перемешивают и инкубируют 10 минут при комнатной температуре. Доводят объем раствора в пробирке дистиллированной водой до 5 мл. Переносят раствор из пробирки в кювету спектрофотометра и измеряют оптическую плотность раствора при 610 нм против кюветы со стандартным раствором [133]. 3. Исследование процессов гидролиза лигноцеллюлозо-содержащего сырья и микробиологическая конверсия продуктов в анаэробных условиях 3.1 Предварительная обработка березового опила разбавленной сернистой кислотой
Во время предобработки растительной биомассы слабыми кислотами такие параметры, как температура, время, концентрация кислоты и гидромодуль играют решающую роль в получении оптимального количества восстановленных сахаров и минимального количества ингибиторов [75]. Процесс предобработки сырья должен быть недорогим для обеспечения конкурентоспособности технологии и эффективного использования лигноцеллюлозного сырья.
В большинстве кинетических исследований [75, 134, 135, 139] показано, что энергия активации для реакции гидролиза растительного сырья больше, чем реакции разложения моносахаридов. Высокая температура реакции, таким образом, способствует гидролизу больше, чем разложению. Выход моносахаридов, следовательно, будет увеличиваться вместе с температурой реакции. Это означает, что на практике должны быть применены максимально возможные температуры. Верхний предел температуры ограничен только практическими факторами такими, как давление в реакторе и возможность контролировать короткое время реакции.
С целью определения оптимальных условий обработки березового опила гидролиз проводили в диапазоне температур 190-250 С при варьировании концентрации сернистой кислоты от 0,6 до 2,5 % масс и гидромодуле 1:3,5 (рисунки 3-5) [136-138].
Как видно из представленных графиков, низкие концентрации кислоты компенсируется высокой температурой в соответствии со временем реакции.
Рисунок 3 - Изменение концентрации редуцирующих веществ в процессе предобработки березового опила в диапазоне температур 190-250 С (гидромодуль 1:3,5, концентрация сернистой кислоты 0,6 % масс.)
При обработке березового опила сернистой кислотой концентрацией 0,6 % масс при температуре 190 С максимальное содержание редуцирующих веществ в гидролизате детектировали через 20 минут. Рисунок 4 - Изменение концентрации редуцирующих веществ в процессе предобработки березового опила в диапазоне температур 190-250 С (гидромодуль 1:3,5, концентрация сернистой кислоты от 1,18 % масс.)
Повышение концентрации сернистой кислоты до 1,8 и 2,5 % масс способствовало сокращению продолжительности обработки, необходимой для достижения максимального выхода редуцирующих веществ и составило 10 минут (рис. 4, 5). Такая же закономерность была характерна и для температуры 200 С. Как видно из графиков (рисунки 3-5), характер кинетических зависимостей определяется концентрацией сернистой кислоты тем значительнее, чем меньше температура гидролиза.
Повышение температуры в большей степени, по сравнению с повышением концентрации гидролизующего агента, способствовало сокращению продолжительности обработки, необходимой для достижения максимального выхода редуцирующих веществ. Наибольшая скорость предобработки березового опила сернистой кислотой (накопления продуктов реакции) была достигнута при температуре 250 С. Продолжительность предобработки, необходимой для достижения максимальной концентрации редуцирующих веществ в гидролизате составила 4 минуты. Как видно из графиков с повышением концентрации сернистой кислоты также наблюдается увеличение скорости распада сахаров.
С целью определения оптимальной дозировки сернистой кислоты, обеспечивающей максимальную концентрацию редуцирующих веществ в гидролизате проведены исследования кинетики гидролиза березового опила 1,77 и 2,0 % масс сернистой кислотой в диапазоне температур 240-250 С при гидромодуле 1:3,5 (таблица 8). Показано, что с повышением концентрации сернистой кислоты наблюдается увеличение скорости распада сахаров. Максимальная концентрация редуцирующих веществ в гидролизатах при применении сернистой кислоты 1,18-2,0 % масс. в диапазоне температур 240-250 С составляла 5 и 4 минуты соответственно. Увеличение концентрации сернистой кислоты до 2,0 % масс. приводит к незначительному повышению концентрации редуцирующих веществ в гидролизате по сравнению с применением 1,77 % масс. Наиболее целесообразным и достаточным является применение сернистой кислоты концентрацией 1,77 % масс.
Важным при гидролизе является снижение гидромодуля с целью повышения концентрации редуцирующих веществ и уменьшения объема сточных вод. Имеющиеся в литературе сведения о влиянии гидромодуля на эффективность и скорость гидролиза неоднозначны. Отмечается, что уменьшение величины гидромодуля приводит к снижению константы скорости гидролиза. Это связывают с влиянием зольных элементов и концентрации углеводов внутри частиц сырья на каталитическую активность кислот [75]. Однако исследование гидролиза целлолигнина 0.5% серной кислотой при 200 С показало, что снижение гидромодуля до 2 не влияет на выход редуцирующих веществ и скорость гидролиза [134]. Приведенные данные подтверждают необходимость исследования влияния гидромодуля на скорость гидролиза и выход редуцирующих веществ при обработке березового опила сернистой кислотой.
Изучение кинетики предобработки свекловичного жома раствором сернистой кислоты в диапазоне температур 200-230 С
Сравнительно низкие значения температурного коэффициента для глюкозы и галактозы свекловичного жома позволяют предположить, что явления диффузии могут оказывать заметное влияние на динамику выхода этих моносахаридов. Однако дополнительные исследования показали, что скорость гидролиза полисахаридов свекловичного жома практически не зависит от гидродинамических параметров. Известно также, что для реакций в жидкостях с ростом температуры понижается вязкость, степень ассоциации, гидратации, что приводит к росту коэффициентов диффузии и соответственно переходу из диффузионной в кинетическую область.
С помощью модели исследовано влияние температуры процесса и концентрации кислоты на эффективность гидролиза полисахаридов различной природы. Температурная зависимость выхода моносахаридов определяется соотношением констант скоростей их образования (к1) и распада (к2). С ростом температуры кинетическая модель предсказывает уменьшение оптимального времени протекания процесса гидролиза, а также увеличение максимальной концентрации для всех моносахаридов (рис. 27-32).
Влияние температуры процесса на скорость гидролиза глюканов свекловичного жома раствором 1,66 % масс сернистой кислоты:1800С модель Кинетическая модель дает возможность не только рассчитать концентрации продуктов реакции, но и определить условия, позволяющие увеличить конверсию полисахаридов растительного сырья. При коротком времени проведения гидролиза она предсказывает существенный относительный рост выхода моносахаридов при увеличении температуры (таблица 20).
Таким образом, в результате проведенного исследования были установлены кинетические параметры процесса деполимеризации лекгогидролизуемых полисахаридов свекловичного жома разбавленной сернистой кислотой. Показано, что процесс протекает в кинетической области и весь массив измерений выхода моносахаридов удовлетворительно описывается схемой с минимальным числом элементарных стадий. Проведен вычислительный эксперимент, на основе которого определены оптимальные области параметров процесса. Установлено существенное влияние температуры реакции на содержание моносахаридов в гидролизатах растительного сырья и продолжительность процесса. Разработанная математическая модель процесса предобработки свекловичного жома может быть применима при моделировании и описании закономерностей предобработки березового опила сернистой кислотой.
Штаммы-продуценты масляной кислоты: Clostridium butyricum ВКПМ В-9617, В-9619 и Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406, В-9615 были восстановлены из лиофилизированного материала, полученного в коллекции ВКПМ, согласно п. 2.5. Выживаемость и микробиологическую чистоту клеток проверяли по методу, представленному в п. 2.5. Было показано, что восстановленные культуры имеют высокий уровень выживаемости клеток после длительного хранения в лиофилизированном состоянии (свыше 90%), являются однородными, не содержат контаминации и по совокупности морфологических признаков принадлежат к видам Clostridium butyricum и Clostridium tyrobutyricum. В составе питательных сред для культивирования бактерий применяли гидролизаты, полученные при режимах обработки свекловичного жома и березового опила, представленных в таблице 21.
Высокотемпературная обработка сырья сернистой кислотой в течение 10 минут позволяет получить гидролизаты с более высокой концентрацией редуцирующих веществ по сравнению с ферментативными гидролизатами.
Преимуществом применения ферментативных гидролизатов в качестве питательных сред является отсутствие ингибиторов роста микроорганизмов. Кроме того, ферментативный гидролиз обладает большей селективностью в деградации биомассы до целевого продукта по сравнению с химическими методами гидролиза [10, 20, 23].
Углеводный состав кислотных и ферментативных гидролизатов растительного сырья, использованных в качестве субстратов в данном исследовании, представлен в таблице 22. Высокое содержание арабинозы, галактозы и низкое содержание
Моносахаридный состав кислотных гидролизатов березового опила преимущественно представлен ксилозой и глюкозой. В ферментативных гидролизатах обоих видов сырья преобладала глюкоза, образующаяся при деполимеризации трудногидролизуемых полисахаридов.
Согласно литературным данным [64], не все углеводы, входящие в состав полученных растительных гидролизатов, утилизируются бактериями C. butyricum и C. tyrobutyricum. C. tyrobutyricum из углеводов, содержащихся в исследуемых растительных гидролизатах, способны утилизировать лишь глюкозу и ксилозу. C. butyricum могут утилизировать также галактозу и сахарозу, а некоторые и арабинозу, содержание которой преобладает в кислотных гидролизатах свекловичного жома.
