Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Физиологические особенности углеводородокисляющих актинобактерий 10
1.2. Влияние условий среды на потребление углеводородов актино бактериями 15
1.3. Использование углеводородокисляющих актинобактерий для очистки нефтезагрязнённых экосистем 23
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 34
2.1. Объект исследования 34
2.2. Питательные среды, используемые для культивирования микроорганизмов 35
2.3. Культивирование и количественный учёт микроорганизмов 37
2.4. Определение содержания биогенных элементов в среде 38
2.4.1. Определение содержания фосфора в среде 38
2.4.2. Определение содержания аммонийного азота 40
2.4.3. Определение содержания нитратного азота 41
2.5. Определение нефтепродуктов 43
2.6. Определение устойчивости актинобактерий к тяжёлым металлам на минеральной среде с различными источниками углерода 45
2.7. Статистическая обработка результатов 46
Глава 3 ОСОБЕННОСТИ РОСТА ИССЛЕДУЕМЫХ ШТАММОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ УГЛЕРОДА 47
Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИХ АКТИНОБАКТЕРИЙ 54
4.1. Определение оптимального источника углерода для выращивания накопительных культур штаммов - интродуцентов 54
4.2. Определение спектра потребляемых углеводородов 58
4.3. Определение оптимальных температур и величин рН 65
4.4. Определение потребления углерода, азота и фосфора в модельных системах 77
4.5. Определение оптимального источника азота 87
4.6. Влияние источника углерода на устойчивость штаммов актино бактерий к тяжёлым металлам 92
Глава 5 ДЕГРАДАЦИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ 100
Глава 6 ПРОВЕДЕНИЕ ПОЛЕВЫХ ИСПЫТАНИЙ 104
ВЫВОДЫ 111
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 112
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 114
ПРИЛОЖЕНИЯ 131
- Физиологические особенности углеводородокисляющих актинобактерий
- Культивирование и количественный учёт микроорганизмов
- ОСОБЕННОСТИ РОСТА ИССЛЕДУЕМЫХ ШТАММОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ УГЛЕРОДА
Введение к работе
Актуальность проблемы. Развитие нефтяной промышленности приводит к росту нагрузок на окружающую среду посредством различного рода аварийных ситуаций, возникающих при добыче, хранении и транспортировке нефтепродуктов. Единственным экологически безопасным способом очистки загрязнённых земель является биоремедиация - применение нефтеокисляю-щих микроорганизмов, использующих углеводороды в качестве источника углерода. Биоремедиация уже длительное время с успехом используется на практике, однако её теоретические подходы слабо разработаны. Нефтеокис-ляющие актинобактерии широко используются в процессах биоремедиации. Это обусловлено их высокой углеводородокисляющей активность и устойчивостью к изменению факторов внешней среды. К этому следует добавить, что согласно официальным данным, в настоящее время в России нуждается в рекультивации 1,2 млн. га земель, пострадавших от различного рода загрязнений (Барышникова Л.М. с соавт., 2001), что определяет значительную потребность в использовании таких микроорганизмов и необходимости выявления их физиологических свойств. Однако, несмотря на очевидные преимущества использования биоремедиации при реабилитации нефтезагряз-нённых экосистем, этот способ имеет один серьёзный недостаток - полный цикл работ при массированном нефтяном загрязнении может составлять 12 и более месяцев. Поэтому основным требованием к современному биореме-диационному процессу является сокращение сроков работ, что принесёт как экологическую, так и экономическую выгоду.
Углеводородокисляющие актинобактерии применяются также для создания комплексных биопрепаратов, с целью интенсификации процессов биоремедиации и изучения взаимоотношений между различными группами мик- роорганизмов, входящих в состав этих препаратов (Korda A. et al., 1997; Va-radaraj R. et al., 1997). Это даёт возможность моделировать процессы биоре-медиации в лабораторных условиях для исследования их влияния на экологическую обстановку нефтезагрязнённых территорий.
Изучение свойств нефтеокисляющих микроорганизмов представляет значительный интерес для задач микробиологии и биотехнологии, поскольку углеводородокисляющие актиномицеты, такие как Rhodococcus, Nocardia, Gordonia, в значительной степени определяют как характер взаимоотношений между микроорганизмами внутри микробиоценоза, так и вносят решающий вклад в процессы биоремедиации и восстановление природного биоразнообразия (Hanson et al., 1997; Oliveira et al., 1997; MacNaughton S.J. et al., 1999). Понятно, что физиологические свойства нефтеокисляющих актиноми-цетов зависят от целого ряда биотических и абиотических факторов, таких как температура, водный и газовый режимы, содержание в среде биогенных элементов, ингибиторов, факторов роста и, наконец, от источника углерода и энергии.
В связи с тем, что углеводородокисляющие актинобактерии практически не изучены, в настоящее время в России и за рубежом создана сеть лабораторий, занимающихся изучением их физиологических свойств и возможностей их использования в процессах биоремедиации.
В настоящее время в виду возросшего интереса к очистке нефтешла-мов, всесторонне изучается влияние тяжёлых металлов на физиологические свойства углеводородокисляющих актинобактерии (Baath Е., 1989; Chander P., Brookes P.S., 1991; Hattori Н., 1992; Doelman P. et al., 1994; Wuertz S., Mer-geay M., 1997; Giller K.E. et al., 1998;). Для уменьшения их токсического воз-действия разрабатываются специальные методы биоремедиации (Tan H.et al., 1994; Malakul P. et al., 1998; Torrens J.L. et al., 1998; Todd R.S., Cheh, 2000). Они сводятся обычно к удалению или связыванию металлов в среде, и лишь после этого начинается процесс биоремедиации (Volesky В., Holan Z.S., 1995; Lovley D.R., Coates J.D., 1997; Veglio F. et al., 1997). Поэтому особо важным является изучение нефтеокисляющих штаммов актинобактерий, устойчивых к солям тяжёлых металлов для ускорения процесса биоремедиации.
Для сокращения сроков накопления биомассы и повышения углеводо-родокисляющей активности применяются методы оптимизации условий жизнедеятельности микроорганизмов (Carberry J.B., Benzing Т.М., 1991; Rainwater К. et al., 1993; Sugiura К. et al., 1997; Xu R., Obbard J.P, 2003). Увеличения выхода биомассы нефтеокисляющих актинобактерий удается достигнуть при использовании углеводов в качестве единственного источника углерода.
Накопление биомассы актинобактерий в среде культивирования возможно также за счет пента- и гексадекана (Бердичевская М.В. с соавт., 1989), однако в первом случае значительно снижается углеводородокисляющая активность, а во втором случае, из-за дороговизны гексадекана, снижается экономическая эффективность (Morgan P., Watkinson R.J., 1989). В связи с этим приобретает актуальность поиск альтернативных источников углерода, обладающих невысокой стоимостью и не снижающих нефтеокисляющую активность актинобактерий в процессе культивирования.
Вопросам оптимизации условий среды посвящены многочисленные исследования отечественных и зарубежных авторов в самых различных направлениях. Так, большое внимание уделяется изучению влияния качественного и количественного состава вносимого источника углерода на рост актинобактерий (Atlas R.M., 1975; Bartha R., 1986; Atlas R.M., Bartha R, 1992; Loser C. et al., 1998; Eriksson M. et al., 1999). Работы ряда авторов (Wright A.L.et al., 1997; Graham D.W. et al., 1999; Johnson C.R., Scow K.M., 1999) посвящены определению оптимальных количеств азота и фосфора в среде. Но потребление актинобактериями источников азотно-фосфорного питания в зависимости от условий среды и типа углеводородного субстрата практически не изучено.
Знание оптимальных количеств биогенных элементов позволит производить корректировку условий существования интродуцированных штаммов актинобактерий в процессе биоремедиации in situ, что предотвратит внесение избытка удобрений, особенно нитратов и сократит сроки работ.
Цель исследования. Изучение основных параметров роста культур нефтеокисляющих актинобактерий в зависимости от условий культивирования и углеводородного загрязнения, с целью разработки системного подхода к биологической очистке нефтезагрязнённых почв и нефтешламов в производственных условиях и отбора штаммов нефтедеструкторов для создания на их основе биопрепарата для очистки углеводородзагрязнённых экосистем.
Диссертационная работа направлена на отбор штаммов актинобактерий служащих основой биопрепарата, а также на повышение эффективности процессов биоремедиации, за счет использования дифференцированных подходов к различным типам нефтяных загрязнений.
Задачи исследования: изучить особенности роста штаммов актинобактерий при использовании различных углеводородов; определить спектр потребления углеводородов штаммами актинобактерий; выяснить оптимальные температуры и величины рН, позволяющие добиться максимальной деструкции различных углеводородов исследуемыми штаммами актинобактерий; выбрать источник углерода, позволяющий получать наибольшее количество биомассы с высокой нефтеокисляющей активностью; определить количественное потребление фосфора и различных источников азота при деструкции углеводородов в модельных системах; - определить эффективность процессов биоремедиации с использованием оптимизации условий среды in situ в модельном эксперименте и полевых ис пытаниях; - разработать системный подход к очистке нефтешламов от углеводородов; изучить устойчивость к тяжелым металлам штаммов микроорганизмов при культивировании их на среде с различным источником углерода; определить штаммы нефтеокисляющих актинобактерий, на основе которых возможно создание биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефтепродуктов;
Научная новизна. На основании анализа роста исследуемых культур на различных источниках углерода впервые предлагается использовать в качестве источника углерода для получения большого количества высокоактивной биомассы актинобактерий растительное масло. Впервые показана взаимосвязь между источником углерода и устойчивостью к тяжелым металлам используемых штаммов микроорганизмов. Установлено, что утилизация различных углеводородов требует различных источников азотно-фосфорного питания. Определено количественное потребление азота и фосфора при деструкции углеводородов исследуемыми штаммами актинобактерий в модельных системах. Намечены пути корректировки физико-химических характеристик нефтешлама в полевых условиях, что позволит сократить сроки очистки. Часть исследований проведена в рамках работы по гранту INTAS 01-2150. Основные положения диссертации, выносимые на защиту. исследование штаммов актинобактерий коллекции КубГУ на способность к ассимиляции нефтепродуктов в различных условиях; исследование интенсивности биодеструкции углеводородов в зависимости от их качественного и количественного состава; оптимальные параметры для биодеструкции нефтепродуктов в полевых условиях; использование системного подхода к очистке нефтешламов от углеводородов, позволяет сократить сроки проведения работ.
Практическая значимость. В результате научных исследований разработан системный подход к очистке нефтешламов, установлены индивидуальные особенности нефтеокисляющих штаммов актинобактерий, определе- ны оптимальные источники азотного питания и их минимально необходимы количества, что позволило отобрать наиболее активный штамм-деструктор нефтепродуктов Nocardia sp. J2, подходящий в качестве основы для создания биопрепарата. Предлагаемые новые подходы к очистке нефтешлама применялись сотрудниками центра "Биотехнология" Кубанского госуниверситета при проведении работ по микробиологической очистке нефтешламов на территориях ЦДЫГ-2 площадь Смоленская и площадь Зыбза ОАО "НК"Роснефть-Краснодарнефтегаз". В процессе работ на площади Смоленская срок очистки нефтешлама от углеводородов был сокращен с 9 до 4 месяцев, эффективность очистки превысила 90%. На площади Зыбза удалось сократить сроки очистки нефтешламов длительного хранения, содержащих тяжёлые металлы с 9 до 6 месяцев. Концентрация углеводородов была снижена с 454 до 8 г/кг. Благодаря дозированному внесению азотно-фосфорных удобрений содержание нитратов в получившемся после очистки шлама грунте не превысило фоновых значений, характерных для данной местности.
Апробация работы. Основные положения и результаты работы докладывались и обсуждались на конференциях "Экология 2000: эстафета поколений" (Москва), "Биология" (Одесса) "Экологические проблемы Кубани" (Краснодар), "Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды" (Пущино), "Биоповреждения - 2002. Современные проблемы биологических повреждений материалов" (Пенза), международная конференция РАН "Проблемы рекультивации нарушенных земель промышленностью на рубеже 21 века" (Санкт-Петербург), "Биология - наука XXI века" (Пущино), 1-ый съезд биотехнологов России (Москва), первый конгресс Европейского общества микробиологов (Любляна), 2-ой международный конгресс "Биотехнология состояние и перспективы развития" (Москва).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ.
Физиологические особенности углеводородокисляющих актинобактерий
Микроорганизмы способные потреблять углеводороды, являются обычными представителями биоценозов почв и водных экосистем. Основными компонентами углеводородокисляющих бактериоценозов являются актинобактерии, такие, как родококки, нокардии, гордонии, артробактерии (Коронелли Т.В. с соавт., 1987; Коронелли Т.В. с соавт., 1994; Гирич И.Е. с соавт., 2001). Рост за счёт углеводородов у актинобактерии связан с формированием некоторых специфических особенностей, которые отсутствуют у других бактерий. К таким особенностям можно отнести возросшую роль пассивной диффузии в поглощении субстрата, накапливание внутри клеток резерва из липидов или внутреннего пула углеводородов, у нефтеокисляющих бактерий отсутствует лимитирование роста субстратом, так как их развитие происходит при непосредственном контактировании с углеводородами (Ив-шина И.Б., 1987; Hanson K.G. et al., 1991; Bouchez M. et al., 1997).
В хронически загрязненных нефтью почвах родококки составляют 90%. В почвах с низкой степенью нефтяного загрязнения количество родо-кокков снижается и составляет 60-80% (Коронелли Т.В. с соавт., 1994). Даже в незагрязненных почвах концентрация углеводородокисляющих актинобактерии 0,01—0,05%) (Oberbremer A., Muller-Hurtig , 1989). Актинобактерии способны усваивать широкий спектр углеводородов, включая и ароматические (Lai В., Khanna, 1996; Al-Hadhrami Н. et al., 1997; Barbeau С. et al., 1997; Calvo-Ortega J.J. et al., 1997), имеют высокую скорость роста (Стабникова Е.В. с соавт., 1995; Christel К. et al., 1999). Активность актинобактерии в 70 раз превосходит активность других нефтеокисляющих микроорганизмов. Это связано с более крупными размерами клеток, а так же с их способностью окислять большие количества н-алканов, чем это необходимо для удовлетворения своих энергетических и конструктивных потребностей. Избыток окисленного н-алкана родококки и артробактерии переводят в нейтральные липи-ды, тогда как другие нефтеокисляющие микроорганизмы (например, псевдомонады) внутреннего пула углеводородов не имеют и резервных липидов не образуют (Нестеренко О.А. с соавт.,1985). Представители рода Arthrobacter в заметном количестве присутствуют в углеводородокисляющем бактериоце-нозе пресных тропических вод, загрязненных бытовыми стоками, в то время как в почве их количество невелико (Коронелли Т.В. с соавт., 1994). Их характерной особенностью, помимо способности окислять широкий спектр углеводородов, является способность к росту при высоком содержании в среде тяжелых металлов и хлорида натрия (Veglio F. et al., 1997). Это является очень важным, так как воды, сопутствующие нефти, часто содержат высокие концентрации солей натрия. (Куличевская с соавт., 1991). Также для артробактерии характерно поступление углеводородного субстрата в клетку через особые ультрамикроскопические поры. Такие каналы, заполненные элек-тронноплотным веществом, были впервые обнаружены у дрожжей. Образование подобного гранулярного вещества было отмечено у Arthrobacter сего-formans. Они не имеют специфических стеночных липидов, но при росте на среде с н-алканами образуют большое количество нейтральных липидов -триглицеридов и восков, которые синтезируются одновременно с нарастанием клеточной массы и откладываются во внешних слоях клетки (Коронелли Т.В. с соавт., 1993).
Культивирование и количественный учёт микроорганизмов
Выращивание культуры вели на минеральных средах с различными источниками углерода. Среду засевали суспензией клеток со скошенного агара. Затем культуру выращивали в зависимости от цели эксперимента либо на аппарате культивирования АК210 объёмом 10000 см3, либо среда разливалась по 50 мл во флаконы на 200 мл. После инокуляции, производившейся через внесение аликвоты суспензии клеток известного титра с соблюдением засевной дозы 104 клеток/мл во флаконы, вносились стерильные субстраты. Эффективность деградации оценивалась к концу логарифмической фазы роста. При определении количеств потребленных элементов азотно-фосфорного питания культивирование проводили до снижения концентрации углеводородов до 50% от исходной.
При проведении модельных экспериментов для культивирования использовали стерильный песок (как модельная среда, имитирующая природный субстрат), помещенный в керамические горшки объёмом 3000 см3. Определение количества микроорганизмов производили подсчётом в счётной камере и по методу Коха.
Счётная камере представляет собой специальное предметное стекло, на поверхности которого имеется ячейка для жидкости строго определённого объёма. В нижней части камеры - сетка. Подсчёт числа клеток начинали через 3—5 минут после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микро-скопировании были видны в одной плоскости. Обычно подсчитывали количество микроорганизмов в 20 малых квадратах сетки. Количество клеток вычисляли по формуле (1):
Особенности роста исследуемых штаммов при использовании различных источников углерода
Процесс выращивания микроорганизмов до недавнего времени представлялся довольно простым, идущим через ряд принципиально общих стадий, приводящих к получению из ничтожного количества посевного материала значительного количества биомассы или биомассы и продуктов метаболизма. Кривая роста - это суммарная запись истории роста культуры. Фазы роста нефтеокисляющих актинобактерий при культивировании с использованием различных углеводородных субстратов до настоящего времени не изучены. Для того чтобы можно было предвидеть и изменить по желанию состояние исследуемых штаммов нефтеокисляющих актинобактерий нами проводилось изучение их особенностей при росте на средах с дизельным топливом, нефтью и мазутом в качестве единственных источников углерода и энергии. Знание закономерностей роста исследуемых штаммов актинобактерий позволит интродуцировать в нефтезагрязнённый объект, а также использовать в процессе биоремедиации микроорганизмы, находящиеся в ранней стационарной фазе роста, как оптимальной для наибольшей деградации углеводородного загрязнителя. Наблюдения за ростом вели не только для понимания смены условий и реакции на них клеток, но и в связи с деградацией того или иного углеводорода.
Культивирование вели в стационарном ферментёре АК 210, что позволило существенно усилить массообмен, ускорить рост и сделать его глубинным и гомогенным, а не поверхностным в виде пленки. В процессе культивирования поддерживали температуру 25С, рН 7,2.
