Содержание к диссертации
Введение
1.1. Микрофлора кожи животных и ее функциональное значение для макроорганизма 13
1.2. Инфекционные и травматические поражения пограничных покровов тела 19
1.3. Механизмы лечебно-профилактического действия пробиотиков 22
1.4. Применение пробиотиков для лечения гнойно-воспалительных и травматических поражений кожных покровов тела человека и животных 25
1.5. Создание гидрогеля на основе спорового пробиотика 30
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 35
2.2. Обоснование компонентного состава препарата Биогель Б 43
2.2.1. Обоснование состава биокомпонента Биогеля Б 44
2.2.2. Выбор гелеобразователя 47
2.2.3. Выбор пластификатора мягкой лекарственной формы 49
2.2.4. Обоснование консерванта для мягкой лекарственной формы 50
2.3. Технология приготовления препарата Биогель Б 52
2.4. Изучение биологических свойств бацилл в составе Биогеля Б 54
2.4.1. Культурально-морфологические свойства 55
2.4.2. Биохимические свойства 56
2.4.3. Антагонистическая активность 57
2.5. Физико-химические свойства Биогеля Б 59
2.6. Сохраняемость свойств Биогеля Б 60
2.7. Экспериментальная оценка эффективности Биогеля Б 63
2.7.1. Оценка безопасности Биогеля Б для лабораторных животных 63
2.7.2. Терапевтическая эффективность Биогеля Б на модели инфекционного процесса пограничных покровов тела лабораторных животных 75
2.7.3. Оценка факторов неспецифической резистентности эксперимен
тальных животных при местном применении Биогеля Б 89
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 99
4. ВЫВОДЫ 106
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ
НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 107
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 108
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 109
ПРИЛОЖЕНИЯ 133
- Микрофлора кожи животных и ее функциональное значение для макроорганизма 13
- Механизмы лечебно-профилактического действия пробиотиков
- Создание гидрогеля на основе спорового пробиотика
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время значительное место в патологии животных занимают гнойно-воспалительные заболевания кожных покровов. Среди них особое значение имеют травматические поражения кожи и связанные с ними гнойные инфекции, которые обуславливают снижение продуктивности и племенных качеств животных, осложнения родов, падеж молодняка и др. [Караваев Ю.Д. и соавт., 1999; Лопатин СВ., Самоловов А.А., 2006 и др].
В ветеринарной практике для лечения животных с ожоговыми ранами и раневой инфекцией кожи используют, как правило, антибиотики и мази, которые, при имеющихся достоинствах, обладают рядом недостатков: необходимость точного расчета доз, длительный курс лечения, высокий процент осложнений, развитие резистентности у микроорганизмов к лекарственным препаратам, что снижает эффективность их использования [Ковалев В.Ф. 1989; Тимофеев СВ., 2005].
Повышение эффективности лечения раневых инфекций может быть достигнуто применением препаратов на основе живых бактерий, обладающих широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Для аэробных спорообразующих бацилл, входящих в состав таких препаратов как биоспорин, Биод-5, споробактерин, бактисубтил и др. наряду с выраженной антагонистической активностью характерны иммуномодули-рующие, антиаллергические, антирадиационные и антитоксические свойства [Поберий И.А.,1996; Бакулина Л.Ф.,2001; Грязнева Т.Н., 2005]. Среди них наибольший интерес представляют B.subtilis и B.licheniformis, входящие в состав пробиотиков биоспорин и Биод-5.
Учитывая отмеченное, разработка новых лекарственных препаратов для наружного применения на основе споровых форм B.subtilis и В. licheniformis является актуальной задачей.
Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработка технологии приготовления препарата Биогель Б для лечения кожных поражений животных.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи.
-
Обосновать возможность создания на основе B.subtilis и B.licheniformis препарата для лечения животных с различными поражениями кожи.
-
Разработать компонентный состав препарата Биогель Б и технологию его приготовления.
*ОС. НАЦИОНАЛЫ!/*|
БИБЛИОТЕКА !
-
Оценить свбйств'а разработанного образца препарата Биогель Б по физико-химическим и биологическим показателям.
-
Провести экспериментальные испытания препарата Биогель Б при травматических и гнойно-некротических поражениях кожи у экспериментальных животных.
5. Оценить стабильность биологических и физико-химических показателей препарата Биогель Б в процессе хранения.
Научная новизна. Впервые на основе спорообразующих бактерий B.subtilis ВКПМ В-2335(3) и B.licheniformis ВКПМ В-2336(31) сконструирован новый препарат Биогель Б для наружного применения при травматических и гнойно-некротических поражениях кожи у животных.
Создана промышленная технология производства препарата Биогель Б в мягкой (гелевой) лекарственной форме, с использованием отечественного технологического оборудования и материалов.
Разработанная лекарственная форма препарата Биогель Б сохраняет биологическую активность не менее 24 месяцев.
Показано, что препарат Биогель Б обладает биологическими свойствами, отличающими его от других пробиотиков, что позволяет использовать его в качестве терапевтического средства при лечении травматических поражений кожных покровов (раны, ожоги) и связанных с ними гнойных осложнений, вызванных антибиотикоустойчивыми стафилококками, стрептококками, синегнойной палочкой, грибами рода Candida, энтеропатогенньгми штаммами эшерихий, а также ассоциациями бактерий.
Методы контроля качества Биогеля Б позволяют дать объективную оценку биологической активности бактерий-компонентов препарата и охарактеризовать качество мягкой (гелевой) лекарственной формы.
Показана высокая терапевтическая эффективность Биогеля Б при травматических поражениях кожных покровов и связанных с ними гнойных осложнениях у экспериментальных животных.
Практическая значимость работы. На базе ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ создана аппаратурно-технологическая линия промышленного производства препарата Биогель Б для лечения кожных поражений животных.
Разработан и утвержден 29.12.2005 г. регламент производства препарата Биогель Б.
Разработаны проект технических условий «Мягкая лекарственная форма препарата Биогель Б» и проект инструкции по применению препарата Биогель Б в ветеринарии.
Разработан и утвержден 29.12.2005 г. сборник методик по контролю качества препарата Биогель Б.
Получены 3 серии препарата Биогель Б, которые прошли предрегистра-ционные испытания на разных видах экспериментальных животных и подтвердили соответствие показателей качества препарата требованиям ТУ.
Результаты исследований по созданию технологии производства препарата Биогель Б используются в учебном процессе в МГАВМиБ имени К.И. Скрябина при подготовке студентов по дисциплине «Биотехнология».
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на
научно-практической конференции «Перспективы использования эубиотика
биоспорин в практике здравоохранения и в'оенно-медицйнской службы»
(Екатеринбург, 1997); на III съезде итало-российского общества По инфек
ционным болезням «Инфекционные болезни: новое в диагностике и тера
пии» (Санкт-Петербург, 1998); на юбилейной научной конференции «Диаг
ностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний.
Биотехнология. Ветеринария" (Киров, 1998); юбилейной научной'Конфе
ренции «Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний.
Биотехнология. Ветеринария» (Екатеринбург, 1999); научно-практической
конференции «Актуальные вопросы" современной медицины» (Самара,
2001); на IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство»
(Москва, 2002); на научной конференции "Иммунология Урала'' (Екатерин
бург, 2003); на научной конференции Центра ВТП БЗ НИИ микробиологии
МО РФ (Екатеринбург, 2003); на международной конференции «Пробиоти-
ки, пребиотики, симбиотики и функциональные продукты питания. Совре
менное состояние и перспективы» (Москва, 2004); на юбилейной научно-
практической конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных
инфекционных заболеваний. Эпидемиология и эпизоотология. Микробиоло
гия. Биотехнология. Экология» (Екатеринбург, 2004). ' і
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Теоретическое и экспериментальное обоснование состава и формы выпуска препарата Биогель Б для наружного применения на основе штаммов B.subtilis 3 и B.licneniformis 31.
-
Технология приготовления препарата Биогель Б в мягкой гидрофильной (гелевой) форме.
-
Результаты изучения терапевтической эффективности препарата Биогель Б при травматических и гнойно-некротических поражениях кожи животных. і' і
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 13 статей в
сборниках научных конференций. "і п
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 139 страницах и включают-введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практиче-
Микрофлора кожи животных и ее функциональное значение для макроорганизма
Особенности строения наружных покровов животных, большое число внешних и внутренних факторов, воздействующих на них, обуславливают многообразие кожных болезней. Среди гнойно-воспалительных заболеваний кожи наиболее типичными и частыми заболеваниями являются пиодермии, основным возбудителем которых чаще бывают стафилококки, реже - стрептококки. Пиококковые процессы, вызванные другими микроорганизмами, составляют менее 1 % [34].
В настоящее время для профилактики и лечения местной гнойной инфекции используют самые различные лекарственные препараты, основными из которых являются гелевые или мазевые формы антибиотиков [13, 35]. Вопросы местного лечения гнойных ран становятся все более актуальными в условиях прогрессирующей антибиотикоустойчивости раневой микрофлоры. Снижение терапевтической эффективности многих противомикробных средств, используемых для лечения инфекционных поражений кожи, объясняется рядом причин, основными из которых являются: изменчивость свойств возбудителей; вредное воздействие антропогенных экофакторов; развитие дисбиотических состояний, вызываемых противомикробными средствами, и сочетание указанных факторов [10, 12].
На сегодняшний день ведущее место в этиологии гнойных заболеваний занимает патогенный стафилококк, характеризующийся быстрой адаптацией к антибиотикам и другим химиотерапевтическим средствам. Многие штаммы стафилококка нечувствительны не только к классическому пенициллину, но и к антибиотикам последних поколений [36, 37]. При местном лечении многие возбудители приобретают толерантность к большинству применяемых антибиотиков. Кроме того, при антибиотикотерапии наблюдаются многочисленные осложнения в виде аллергических и анафилактических реакций, развитии дисбактериоза [10, 38, 39].
Известно, что бактерии, в норме заселяющие кожу, оказывают антагонистическое действие в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры [40, 41]. Для гнойно-воспалительных заболеваний пограничных покровов тела характерна своеобразная локализация инфекционного процесса. Поэтому для эффективного лечения этих болезней необходим своеобразный подход - возможность местного (наружного) применения противомикробных лекарственных средств. Поражения пограничных покровов могут давать местные и общие проявления, в связи, с чем их лечение должно осуществляться комплексно. При этом местное лечение должно рассматриваться как один из способов комплексной терапии. Общие принципы лечения животных, страдающих кожными болезнями, должны базироваться на учете особенностей локализации инфекционного процесса, правильном выборе лекарственных средств и лекарственных форм их применения.
Механизмы лечебно-профилактического действия пробиотиков
Препараты с пробиотическим эффектом применяются для профилактики и лечения микроэкологических изменений макроорганизма, т.е. для стабилизации и оптимизации функции его нормальной микрофлоры. Детальное изучение биологических свойств основных представителей нормальной микрофлоры родов Bifidobacterium, Lactobacillus, Escherichia, Enterococcus и др, и механизмов их действия на макроорганизм, не только позволили установить значение этих микроорганизмов в поддержании здоровья человека и животных, но и наметили пути разработки новых препаратов с более эффективным пробиотическим механизмом действия [23, 60, 85-86].
Согласно современным представлениям, механизм положительного действия препаратов с пробиотической функцией является многокомпонентным: подавление патогенных и условнопатогенных микроорганизмов за счет про 23
дукции биологически активных веществ, конкуренция за лимитируемые нут-риенты и сайты адгезии на кишечной стенке; влияние на ферментативную активность ЖКТ, стимуляция иммунной системы организма хозяина [87, 88].
Механизм лечебно-профилактического действия пробиотиков можно рассмотреть на примере биоспорина. Данный пробиотик наиболее полно реализует потенциальные для данной группы МИБП лечебно-профилактические свойства за счет особенностей его компонентного состава и влияния на системы гомеостаза макроорганизма и на микроорганизмы-возбудители ОКИ и других заболеваний.
Биоспорин сконструирован из двух природных штаммов B.subtilis ВКПМ № В-2335 (3) и B.licheniformis ВКПМ № В-2336 (31) с высокими медико-биологическими свойствами.
Механизм действия биоспорина, как и других пробиотиков из бактерий рода Bacillus, имеет многоплановый и многофакторный характер, благодаря ассоциации в его составе двух природных штаммов бацилл с уникальными биологическими свойствами. При этом не менее 50% живых бацилл находится в споровой форме, а соотношение клеток B.subtilis 3 и B.licheniformis 31 выбрано равным 3:1 для обеспечения максимальной активности препарата. Особенности биоспорина обеспечивают его преимущества не только по сравнению с пробиотиками из представителей нормального микробиоценоза ЖКТ (типа бифидумбактерина или колибактерина), но и по отношению к препаратам на основе монопрописей спорообразующих бактерий (бактисуб-тил, споробактерин).
Создание гидрогеля на основе спорового пробиотика
Представленные в аналитическом обзоре литературы данные позволяют сделать вывод о том, что при инфекционных заболеваниях пограничных покровов целесообразно использование пробиотиков. При этом наиболее эффективными препаратами следует считать те, в состав которых входят штаммы микроорганизмов, обладающие комплексом антибактериальных свойств. В этом плане перспективным являются штаммы микроорганизмов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis. Однако для достижения максимальной эффективности требуется соответствующая лекарственная форма, в данном случае - мягкая лекарственная форма.
Мягкие лекарственные формы предназначены для нанесения на кожу, рану и слизистые оболочки. Из этих форм требуется выбрать такую, которая обеспечивала бы прорастание спор бацилл, поскольку споры лечебно инертны, размножение вегетативных клеток бацилл, действие ферментов, являющихся биокатализаторами, и других растворимых в воде биоактивных веществ лекарственной формы бацилл, и содержала бы субстраты питания для этих бацилл.
В настоящее время исследуются много подходов, чтобы преодолеть барьерные свойства кожи, увеличить ее проницаемость и улучшить возможности применения трансдермальной терапевтической системы (ТТС). Одним из таких подходов является химическое усовершенствование технологии ТТС, которое сводится к использованию внешних химических субстанций для улучшения проникновения лекарственных веществ через кожный барьер. Использование таких "внешних усилителей" является самым доступным способом усовершенствования ТТС [20].
В этом качестве могут быть использованы полимерные соединения (неорганические и органические). Из органических полимеров подходят такие, которые безвредны для животных и человека и не разрушаются ферментами бацилл. К числу таких веществ можно отнести производные полимеры целлюлозы и некоторых неорганических полимеров [128-130].
