Содержание к диссертации
Введение
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1 Природа патологий опорно-двигательной системы животных 8
2.Биохимические механизмы патологий опорно-двигательной системы животных 13
3 Роль минеральных элементов в обменных процессах, связанных с болезнями опорно-двигательной системы (ОДС) 20
4.Современные методы и средства борьбы с болезнями ОДС животных 29
5.Роль пробиотиков в нормализации обмена веществ и оздоровлении животных 38
II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 42
1. Материалы и методы 42
2.Технология получения препарата Биокан 46
2.1. Разработка оптимальной рецептуры препарата 46
3. Оптимизация последовательности операций при изготовлении препарата 56
4. Изучение основных характеристик препарата Биокан 57
4.1 .Сохранность и стабильность препарата 57
4.2.Токсикологические параметры препарата 61
5.Действие препарата на иммунобиологические показатели организма лабораторных животных 64
5.1. Показатели клеточного и гуморального иммунитета 64
5.2. Действие препарата Биокан на гематологические и биохимические показатели крови лабораторных животных 68
6. Изучение эффективности и безвредности препарата Биокан при лечении патологий опорно-двигательной системы собак 76
III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 89
IV. ВЫВОДЫ 98
V. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 99
ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ
VI. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ 99
ВЫВОДОВ
VII. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 100
VIII. ПРИЛОЖЕНИЯ 125
Введение к работе
Актуальность проблемы. Заболевания опорно-двигательной системы животных встречаются достаточно часто и являются одной из важнейших проблем ветеринарии [23, 42, 58, 59, 153, 162, 167, 207, 209, 243, 257]. Какой-то одной причины, приводящей к развитию этих заболеваний, по-видимому, не существует. Имеет значение ряд факторов, так или иначе ослабляющих хрящ, вредное воздействие которых суммируется и в итоге это приводит к развитию патологического процесса.
Профилактикой заболеваний опорно-двигательной системы с точки зрения питания является обеспечение нормального развития скелета и обеспечение достаточного количества питательных веществ для костей и суставов, прежде всего у собак крупных пород, с помощью препаратов на основе комбинированных пищевых добавок [1, 2, 6, 38, 50, 52, 66, 67, 69, 95, 99, 100, 106, 118, 131, 141, 142, 143, 146, 147, 149, 157, 160, 175, 182,213,260].
Применением коллагенного (желатинового) гидролизата можно препятствовать или, по крайней мере, существенно замедлить дегенеративные процессы в соединительной ткани. Коллагенный гидролизат питает и регенерирует хрящ суставов, сухожилия, связки и кости и, таким образом, облегчает или даже устраняет последствия предыдущего недостаточного питания или повреждения суставов, их деформирования, препятствует дальнейшему разрушению хряща. При этом улучшается подвижность суставов и уменьшается боль. Среди широкого круга лекарственных средств, применяемых при заболеваниях опорно-двигательной системы собак в последнее время, ведущее место занимают препараты на основе гликозамингликана [39, 238, 206, 218], коллагенного, или желатинового гидролизата, а также хондроитин-сульфата (Хондроитин сульфат натрия), рекомедуемого при дегенеративно-дистрофических заболеваниях суставов и позвоночника: первичный артроз, межпозвонковый остеохондроз, остеоартроз, остеопороз, и др.
Прием препаратов - хондропротекторов улучшающих структуру хряща не направлен на снятие воспаления в суставе, но способствует замедлению прогрессирования артроза, укреплению хрящевой ткани. Хондропротекторы могут применяться внутрь, внутримышечно, внутрисуставно. К первым относятся препараты «Дона», «Структум» или пищевые добавки, содержащие ххондротин сульфат или гликозамингликаны, которые являются строительным материалом хряща
Известны и другие препараты, используемые для профилактики заболеваний ОДС животных - румалон, хионат, альфлутоп, альфлутоп, траумель и др.
В то же время нельзя не отметить наличие определенных недостатков у известных препаратов отечественных и зарубежных производителей - они имеют узконаправленный характер и малоэффективны в тех случаях, когда у животных одновременно с заболеваниями опорно-двигательной системы имеет место нарушение нормального микробиоценоза кишечника. В связи с ухудшением условий среды, низким качеством кормов и антибиотикотера-пией в последнее время это явление встречается очень часто. При этом наблюдается снижение всасывания кальция и др. минеральных компонентов из кишечника, что, естественно, не может не сказаться на реакциях регенерации хрящевой и костной ткани. Поэтому не вызывает сомнений актуальность исследований, направленных на создание новых форм и композиций препаратов, содержащих в своем составе вещества стимулирующие как процессы регенерации в тканях, так и размножение полезной микрофлоры кишечника животных.
Цель и задачи работы Целью работы является разработка технологии получения нового препарата Биокан для профилактики и лечения заболеваний опорно-двигательной системы собак, содержащего в своем составе источники белка, минеральных элементов, глюкозамин и изучение основных параметров безопасности и эффективности его.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: -оптимизация компонентного состава препарата, содержащего гидро-лизат желатина, глюкозамин, и другие ингредиенты; -изучение острой и хронической токсичности препарата; -изучение действия препарата на основные иммунобиологические по казатели организма животных; ф -изучение действия препарата на кишечную микрофлору животных; -установление эффективности препарата при остеоартрозе и остеохон- ) дрозе собак -разработка проектов нормативно-технической документации на препарат;
Научная новизна. Впервые разработана технология получения новой композиции препарата, содержащего глюкозамин, желатин, лакто - и бифи-добактерии и используемого при заболеваниях опорно-двигательной системы собак. Изучены основные параметры безопасности и эффективности препарата, установлено, что препарат не оказывает отрицательного воздействия на иммунобиологический статус животных, не угнетает метаболизм почек и печени. Показана высокая эффективность препарата при остеохондрозе и ос-теоартрите собак.
Практическая ценность работы. Для профилактики и лечения заболеваний ОДС собак предложена новая форма препарата, содержащего в своем составе вещества, стимулирующие регенерацию поврежденных хряще-вых тканей и стимулирующих развитие симбиотической микрофлоры ЖКТ собак (желатин, глюкозмин, лакто- и бифидобактерии и др.). Результаты работы вошли в разработанный стандарт организации СТО и Инструкцию по применению препарата.
Положения, выносимые на защиту:
Технология получения новой формы препарата- хондропротектора, содержащего в своем составе гидролизат желатина, глюкозамин, минеральные компоненты и симбиотические микроорганизмы кишечника (лакто - и бифидобактерии).
Данные по изучению токсикологической и иммунобиологической характеристики препарата на лабораторных животных.
Результаты апробации препарата в лабораторных и производственных условиях.
Апробация.
Результаты диссертационной работы представлены на XII Международном конгрессе по болезням мелких домашних животных, Москва, 2004 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 135 страницах и включает следующие разделы: введение, литературный обзор, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы, который включает источников, в том числе иностранных, и приложение. Иллюстрационный материал диссертации включает 6 рисунков и 26 таблиц.
Природа патологий опорно-двигательной системы животных
Дегенеративно-дистрофические заболевания суставов и позвоночника: первичный артроз, межпозвонковый остеохондроз, остеоартроз, остеопороз и др. являются широко распространенными заболеваниями суставов, при которых в первую очередь поражается суставный хрящ [3, 18, 42, 45, 58, 59, 77, 78, 84, 85, 129, 132, 162, 167, 206, 209, 216, 234, 256]. Как известно, сустав образован суставными поверхностями костей, покрытыми хрящевой тканью. При различных движениях хрящ выполняет роль амортизатора, уменьшая давление на сочленяющие поверхности костей и обеспечивая их плавное скольжение друг относительно друга. Хрящ состоит из волокон соединительной ткани, рыхло расположенных в матрице. Матрица — это желеподоб-ная субстанция, образованная специальными соединениями - гликозаминг-ликанами. За счет матрицы осуществляется питание хряща и восстановление поврежденных волокон. Подобное строение делает хрящ похожим на губку — в спокойном состоянии он впитывает жидкость, а при нагрузке выдавливает ее в суставную полость, обеспечивая как бы «смазку» сустава.
В течение жизни хрящ гибко реагирует на стереотипные, много раз повторяющиеся толчки при различных физических нагрузках. Эти постоянные нагрузки приводят к старению и разрушению части волокон, что в здоровом суставе восполняется синтезом такого же количества новых волокон [150, 191,193, 197,209,216, 220,243, 236].
Остеоартроз развивается при нарушении равновесия между образованием нового строительного материала для восстановления ткани хряща и разрушением. Возникает своего рода, менее ценная структура хряща, способная впитывать меньшие объемы воды. Хрящ становится более сухим, ломким, и в ответ на нагрузку его волокна легко расщепляются. По мере про-грессирования артроза, слой хряща, покрывающий суставные поверхности, становится все тоньше, вплоть до стадии полного разрушения. Вместе с хрящом изменяется и костная ткань под ним.
Одним из наиболее серьезных заболеваний, связанных с нарушением функции хрящей и костей (боли в спине). В подавляющем большинстве случаев причиной этих болей является остеохондроз позвоночника.
Чтобы понять сущность остеохондроза, можно рассмотреть следующие простые схемы. На схеме 1 изображены 2 соседних позвонка - образования из кости. Между костными поверхностями позвонков лежит хрящевая прокладка - межпозвоночный диск или хрящ, который более эластичен и упруг по сравнению с костью. В позвоночнике проходит один из центральных органов нервной системы - спинной мозг, а от него отходят через отверстия в позвоночном столбе периферические нервы.
На схеме 2 те же позвонки, но уже у больного остеохондрозом. В силу разных причин начинает страдать межпозвоночный хрящ, он является более тонким, менее эластичным и упругим, костные поверхности тел позвонков начинают соприкасаться друг с другом, это приводит к их травмированию, воспалению, уменьшению подвижности в позвоночном столбе. Поскольку тела позвонков сближаются, отверстия в позвоночном столбе становятся уже и нервы, выходящие через эти отверстия могут ущемляться. Измененные межпозвоночные диски также могут выпадать через отверстия в позвоночном столбе и также могут ущемляться. Все эти процессы и приводят к появлению болей по ходу позвоночника, а также к другим очень серьезным последствиям, вплоть до параличей мускулатуры [3, 18, 21, 42]. Причины остеохондроза позвоночника многообразны: микротравмы, перегрузки позвоночного столба, дефекты развития позвоночника.
Что касается артрозов, также можно отметить отсутствие какой-то одной причины, приводящей к развитию заболевания. Имеет значение ряд факторов, так или иначе ослабляющих хрящ, вредное воздействие которых на протяжении жизни суммируется и в итоге приводит к развитию артроза [37, 77, 78, 206, 234, 236].
Существуют генетически обусловленные заболевания опорно-двигательной системы, например, идиотипические остеоартрозы [21, 23, 81, 93, 166, 209] Характерной особенностью этих заболеваний является то, что они трудно поддаются лекарственной терапии. Нарушения иннервации и снижение мышечного тонуса и некоторые отклонения от нормы в функционировании иммунной системы также провоцируют остеоартроз и другие заболевания суставов [93,129,166,209].
Таким образом, анализ выше изложенного свидетельствует об отсутствии какой-либо конкретной причины, вызывающей заболевания суставов.
Тем не менее, можно выделить ряд факторов, наличие которых повышает риск развития артроза.
Материалы и методы
Работа выполнена в Научно-исследовательской лаборатории инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина в период 1999-2005 г.г. Опыты по изучению эффективности препарата при лечении животных проводили в ветеринарной клинике «Артемида» г. Йошкар-Ола и питомнике «Тимантти Солид» г. Москва.
Объектами исследований служили подопытные животные - белые беспородные мыши, крысы, кролики, собаки.
Для определения действия препарата Биокан на гематологические, биохимические и иммунобиологические и токсикологические показатели организма животных в работе использованы клинические, иммунологические, биохимические, микробиологические, токсикологи-ческие и другие методы исследований.
Клинический осмотр животных проводили ежедневно, общее физиологическое состояние оценивали по данным личных наблюдений.
Для гематологических, иммунологических и биохимических исследований использовали гепаринизированную венозную кровь, а также сыворотку крови, полученную общепринятым методом.
В образцах крови определяли содержание эритроцитов и лейкоцитов, процентное соотношение отдельных видов лейкоцитов, а также фагоцитарную активность нейтрофилов.
В сыворотке исследовали такие показатели естественной резистентности, как содержание лизоцима, бактерицидную активность.
Количество эритроцитов и лейкоцитов подсчитывали в камере Горяева. Количественное соотношение отдельных видов лейкоцитов вычисляли из 100 подсчитанных клеток в мазке крови, фиксированном метиловым спиртом и окрашенным по Романовскому-Гимзе [15].
Уровень фагоцитоза определяли модифицированным методом Лейрира с использованием взвеси суточной культуры E.coli 0111. По результатам микроскопирования мазков крови, приготовленных после экспозиции в термостате, фагоцитарную активность нейтрофилов выражали следующими показателями: процент фагоцитоза - отношением числа фагоцитов, захвативших тест-микробы к общему числу подсчитанных; фагоцитарным индексом - средним количеством бактерий, захваченных одним нейтрофилом; процентом переваривания - отношением числа переваривающихся микробов к числу всех фагоцитарных.
При определении количества лизоцима в сыворотке крови предварительно готовили смесь 1%-ного раствора агара «Дифко» и ацетонового порошка Micrococcus lysodecticus в соотношении - 20 мг порошка на 10 см3 агара, который разливали слоем 4 мм на органическом стекле. После застывания агара в нем вырезали луночки диаметром 5 мм, куда вносили 5-кратное разведение исследуемой сыворотки в объеме 0,05 см3. Параллельно в лунки вносили растворы стандартного препарата кристаллического лизоцима в концентрации от 0,5 до 100 мкг/см3.
После 48-часовой инкубации во влажной камере при температуре 22-24С измеряли зоны лизиса вокруг лунок, вызванные сывороткой и различными концентрациями стандартного лизоцима.
Для определения бактерицидной активности сыворотки крови, в от- калиброванные по прозрачности пробирки вносили по 1,8 см мясопеп-тонного бульона (МПБ), куда доливали по 0,4 см исследуемой сыворотки. В контрольные пробирки вносили по 2,2 см МПБ. Далее во все пробирки добавляли суточную культуру E.coli 0111 в объеме 0,04 см3, содержащей 2,5 млрд. микробных клеток. На спектрофотометре при зеленой области спектра против дистиллированной воды определяли оптическую плотность содержимого опытных и контрольных пробирок (Ді). После чего все пробирки инкубировали в термостате в течение 2,5 ч при температуре 37С. После инкубации повторно определяли оптическую плотность (Дг) содержимого всех пробирок.
Бактерицидную активность исследуемых проб сыворотки крови выражали в процентах, вычисляя по формуле: 100-((Д2 опыт. - Ді опыт.) / (Д2 контр. - Ді контр.)) х 100
Для снижения колчества возможных технических ошибок, определение всех показателей сыворотки крови опытных и контрольных животных, взятых в различные сроки, проводили одновременно на одних и тех же ингредиентах и растворах, образцы сывороток хранили в пластиковых пробирках в низкотемпературном холодильнике Sanyo и размораживали перед исследованиями.
Обсуждение результатов
В результате проведенных нами исследований разработаны новая рецептура и технология изготовления лекарственной формы препарата Биокан, рекомендуемого для применения при заболеваниях опорно-двигательной системы собак.
Как было отмечено в обзоре опубликованной информации по обсуждаемой проблеме, в настоящее время имеется ряд препаратов, разработанных отечественными и зарубежными исследователями. Эти препараты пользуются относительно высоким спросом, обладают достаточно хорошим терапевтическим эффектом и имеются в ветеринарных аптеках. Однако нельзя не отметить, что они не оправданно дороги и обладают узконаправленным эффектом. Действительно, если проанализировать проблему заболеваний опорно-двигательной системы животных, видно, что эти заболевания в основном встречаются у животных с нарушенным (по разным причинам) обменом веществ, стареющих животных, у животных подвергшихся большим физическим нагрузкам и др.
У таких животных, как правило, наблюдается часто параллельная патология - нарушение нормального соотношения между количеством сим-биотической и патогенной (условно-патогенной) микрофлорой кишечника. А это, как известно, является одним из факторов, отрицательно влияющих на метаболизм в целом из-за нарушения хода абсорбции жизненно важных элементов и желудочно-кишечного тракта. Как следствие этого, естественно имеет место и дисбаланс биохимических процессов в тканях хрящей и костей животных.
Из изложенного ясно, что создаваемые для борьбы с болезнями опорно-двигательной системы животных средства должны содержать компоненты, как способствующие регенерации тканей суставов, так и нормализации метаболизма в целом. Исходя из этого и был разработан нами многокомпонентный препарат Биокан, включающий в свой состав не только традиционные гдроли-заты желатина или казеина, большое количество кальция, но и глюкозамин (пребиотик) и пробиотические микроорганизмы: лакто- и бифидобактерии.
Роль каждого из компонентов, входящих в препарат, и высокая целевая эффективность препарата можно объяснить на основе анализа биохимии метаболических процессов в отдельных функционально важных органах. Содержащиеся в препарате Биокан цинк, медь, марганец, кальций и др., выполняют свои физиологические функции как кофакторы многих энзиматических систем (протеазы, липазы, фосфатазы и др.) поддерживая метаболизм на соответствующем уровне.
Минеральные компоненты, как известно, являются активаторами различных биохимических реакций в клетках, в т.ч. в иммунокомпетентных клетках. Марганец и цинк увеличивают содержание витамина С в тканях, который участвует в синтезе белка, оказывает антитоксический, противовоспалительный и др. эффекты.
Медь и марганец регулируют обмен витамина А. Молибден активирует фермент ксантиноксидазу, который участвует в обмене пуриновых и пи-римидиновых оснований, являющихся компонентами при синтезе нуклеиновых кислот
Обмен практически всех микроэлементов напрямую зависит от работы печени, например, всасывание железа из кишечника, депонирование железа и обеспечение постоянства его концентрации в крови. Печень принимает участие в обмене марганца, молибдена кобальта и других микроэлементов, депонирует медь и цинк.
Роль вводимого в Биокан витамина С, также связана с работой печени животных. Как известно, билирубин образуется из гемоглобина разрушенных эритроцитов в селезенке и купферовских клетках печени. В отношении билирубина главной задачей печени является его выделение, а не образование, хотя значительная часть его образуется именно в печени. Важно отметить, что распад гемоглобина до билирубина через множество промежуточных этапов осуществляется при участии витамина С.
Кроме того, витамин С- сильный восстановитель, антиоксидант, участвует в углеводном обмене, участвует в заживлении ран, синтезе коллагена и др. Именно участие витамина С, содержащегося в препарате Биокан, в синтезе коллагена и обеспечивает высокую эффективность препарата при лечении заболеваний суставов собак.
Интенсивность реакций биосинтеза белков хрящей и костей обеспечивается гидролизатами желатина или казеина, вводимымих в состав препарата, а роль кальция в этих процессах общеизвестна.
