Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1 Галактозидаза и источники ее получения 12
1.2 Механизм действия галактозидазы 15
1.3 Свойства галактозидаз из различных источников 21
1.4 Выделение и очистка галактозидаз 28
1.5 Применение препаратов галактозидазы 34
1.6 Анализ обзора литературы и задачи исследований 46
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 48
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 48
2.1 Методы выделения и очистки фермента 48
2.2 Методы определения ферментативной активности 52
2.3 Методы химических анализов 54
2.4 Методы определения степени чистоты препарата 55
2.5 Определение молекулярной массы 55
2.6 Определение изоэлектрической точки 56
2.7 Определение оптимальных условий действия и стабильности фермента 57
2.8 Определение влияния различных реагентов на активность Р-галактозидазы 57
2.9 Определение кинетических констант гидролиза субстратов 57
2.10 Определение специфической активности р-галактозидазы 58
2.11 Определение микробиологической чистоты препарата 59
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 60
3.1 Исследование ферментативного комплекса исходного препарата Лактоканесцин 60
3.2 Выделение и очистка Р-галактозидазы из исходного комплексного препарата 62
3.2.1 Изучение стабильности р-галактозидазы в водном растворе 63
3.2.2 Разработка способа очистки Р-галактозидазы методом ультра фильтрации 65
3.2.3 Очистка концентрата от микрофлоры методом микрофильтрации . 74
3.2.4 Разработка способа очистки Р-галактоидазы от протеиназы 75
3.3 Технологическая схема получения лекарственной субстанции (препарата Галактозим) и ее апробация 80
3.4 Разработка способа получения высокоочищенной Р-галактозидазы (фермент-стандарта) 88
3.4.1 Выбор условий предварительной очистки фермента 89
3.4.2 Выбор оптимальных условий хроматографического процесса 91
3.4.3 Обессоливание и концентрирование элюата 93
3.4.4 Исследование способов разделения а- и Р-галактозидаз 94
3.5 Определение степени чистоты препаратов Р-галактозидазы 97
3.6 Изучение физико-химических и каталитических свойств Р-галактозидазы 97
3.6.1 Влияние рН среды на активность фермента 99
3.6.2 Влияние температуры на активность р-галактозидазы ЮЗ
3.6.3 Влияние ионов металлов и специфичесих реагентов на активность Р-галактозидазы 103
3.6.4 Оределение молекулярной массы 108
3.6.5 Определение изоэлектрической точки 110
3.6.6 Определение кинетических характеристик Р-галактозидазы 111
3.6.6.1 Определение константы Михаэлиса 111
3.6.6.2 Определение характера ингибирования и константы ингибиро-вания (3-галактозидазы продуктами гидролиза 112
3.7 Изучение специфического действия Р-галактозидазы 119
3.7.1 Изучение динамики гидролиза лактозы в молочных продуктах препаратом Галактозим 119
3.7.2 Разработка готовой лекарственной формы препарата Галактозим и
изучение его эффективности в условиях, имитирующих среду организма 125
3.7.2.1 Изучение некоторых фармакологических свойств готовой лекарственной формы препарата Галактозим 126
3.7.2.2 Сравнение эффективности действия препаратов Галактозим и Лактраза на лактозу молочных продуктов 127
ВЫВОДЫ 130
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 132
ПРИЛОЖЕНИЯ 156
- Галактозидаза и источники ее получения
- Методы выделения и очистки фермента
- Изучение стабильности р-галактозидазы в водном растворе
Введение к работе
Актуальность темы. Согласно статистическим данным в последние годы в мире значительно сократились темпы роста производства ферментных препаратов для традиционных отраслей применения (пищевая промышленность, бытовая химия, переработка отходов, сельское хозяйство и пр.) ввиду насыщения рынка, в то время как объем производства ферментов для медицинских целей непрерывно растет. По оценкам американской консалтинговой фирмы «Business Communications», среднегодовой прирост объема продаж ферментов медицинского назначения составляет 25,4%. На сегодняшний день в мировой практике до 50% ферментов, используемых в медицине, получают из микробного сырья.
Препараты на основе ферментов используются для профилактики и лечения нарушений пищеварительных процессов, заболеваний сердечно-сосудистой системы, при системной терапии воспалительных процессов, для лечения онкологических заболеваний, ожоговых ран, заболеваний полости рта и др.
Наиболее емким является рынок пищеварительных ферментов. Это связано с тем, что с ухудшением экологической обстановки и повышением психоэмоциональных нагрузок число людей, страдающих нарушениями пищеварения, связанными с недостаточным образованием ферментов, растет из года в год.
Одной из серьезных ферментных патологий является дефицит в организме человека лактазы (гиполактазия). Лактаза (Р-галактозидаза) - фермент, вырабатываемый в верхнем отделе тонкого кишечника и катализирющий расщепление лактозы (молочного сахара) на глюкозу и галактозу, которые затем легко всасываются в кровь. Отсутствие или недостаток лактазы приводят к тому, что больные не могут использовать в своем рационе молоко и молочные продукты [Валенкевич, 1989; Turck, 2004]. Это заболевание особенно опасно для детей грудничкового возраста, т. к. молоко является для них основным
продуктом питания, и найти молоку полноценную замену для грудных детей чрезвычайно сложно [Корниенко и др., 2006]. По данным ряда авторов, из-за отсутствия или недостатка в слизистой оболочке тонкой кишки лактазы непереносимость молока встречается у 15-30% и более населения нашей страны [Валенкевич, Яхонтова; 1991, Жвавый и др., 1991; Козлов, 1992].
Лицам, страдающим гиполактазией, ранее рекомендовалось исключать из пищи молоко и молочные продукты. Однако необходимо помнить, что молоко занимает особое место среди продуктов питания человека, являясь источником белка, кальция, рибофлавина [Лоранская и др., 1997]. Исключение из рациона молока и молочных продуктов при гиполактазии, особенно у детей, приводит к неоптимальности регулирующих систем организма [Котлукова, 1994].
Лактозная непереносимость может быть преодолена двумя путями: использованием молочных продуктов с частично гидролизованной лактозой, либо приемом биологически активных добавок или лекарственных препаратов, содержащих лактазу.
В настоящее время за рубежом рядом фирм внедрена в производство технология получения низколактозного молока путем предварительного расщепления в нем лактозы с помощью ферментных препаратов микробного происхождения. Низколактозные продукты выпускаются в большинстве стран Западной Европы, Аргентине, Канаде, Японии, Новой Зеландии, США и др.
Новым шагом в лечении гиполактазии стало появление лекарственных препаратов на основе р-галактозидаз микробного происхождения. Первый из подобных ферментных препаратов в таблетированной и жидкой формах был получен фирмой «Sugar Lo Со» (США) из дрожжей Kluyveromyces lactis («Lact-Aid») и применялся для обработки молока перед употреблением в домашних условиях. Затем фирма «Fermentation Industries Kingstree» (США) выпустила в продажу порошок для приема внутрь («Lactrase-N»), содержащий лактазу из
микроскопического гриба Aspergillus niger. Известен японский препарат «Га-лантаза» из Aspergillus sp. (фирма «Amano Pharmaceutical»), который применяется для лечения диареи у новорожденных. В настоящее время в США лактаза как средство, помогающее пищеварению, занимает 40% от всего количества производимых пищеварительных ферментов.
В нашей стране производство низколактозного молока и молочных продуктов отсутствует. Не производятся и лекарственные средства для коррекции дефицита лактазы. Импортные препараты, присутствующие на российском фармацевтическом рынке, не удовлетворяют спрос в полном объеме и, кроме того, имеют высокую стоимость. В связи с этим проблема создания конкурентоспособного отечественного высокоэффективного ферментного препарата Р-галактозидазы, который может быть использован как для предварительного гидролиза лактозы в молоке и молочных продуктах, так и для приема внутрь, отличающегося от зарубежных аналогов существенно более низкой ценой, является весьма актуальной, как с позиции социального эффекта, так и с позиции развития биотехнологии - одной из стратегически важных отраслей экономики.
В НТЦ «Лекбиотех» на основе глубинного культивирования микроскопического гриба Penicillium canescens F-l 78 - продуцента Р-галактозидазы - разработана технология получения ферментного препарата Лактоканесцин, предназначенного для гидролиза лактозы в молочной сыворотке. Наличие препарата, содержащего Р-галактозидазу и разрешенного к применению в пищевой промышленности, а также значительная потребность отечественного здравоохранения в пищеварительных средствах с лактазнои активностью, явились основой для исследований по получению из препарата Лактоканесцин препарата Р-галактозидазы медицинского назначения.
Цель настоящего исследования состояла в разработке эффективной технологии получения высокоочищенного ферментного препарата грибной р-галактозидазы
для коррекции лактазной недостаточности, а также в изучении физико-химических и каталитических свойств фермента.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
исследовать ферментный состав препарата Лактоканесцин Г20Х;
разработать рациональную схему выделения и очистки из комплексного ферментного препарата субстанции Р-галактозидазы с активностью не менее 10000 ед/г для коррекции энзимодефицита;
разработать способ и получить высокоочищенную Р-галактозидазу для использования ее в качестве стандартного образца при определении активности (подлинности) лекарственного средства;
изучить основные физико-химические и каталитические свойства выделенного фермента в лекарственной субстанции и в фермент-стандарте;
исследовать процесс гидролиза лактозы в молоке и молочных продуктах, катализируемый препаратом р-галактозидазы, и разработать оптимальные режимы их ферментативной обработки;
разработать готовую лекарственную форму препарата р-галактозидазы и сравнить его эффективность с действием зарубежного препарата «Лактраза» (США) на лактозу молочных продуктов, в условиях, имитирующих среду организма.
Научная новизна работы заключается в следующем:
впервые по оригинальной технологии получена лекарственная субстанция (препарат Галактозим) и готовое лекарственное средство (капсулы Галакто-зим) для коррекции лактазной недостаточности на основе Р-галактозидазы из Penicillium canescens;
на основе хроматографического разделения ферментного комплекса получена высокоочищенная Р-галактозидаза для использования в качестве стандарта при определении лактазной активности (подлинности) лекарственного средства;
проведено комплексное изучение физико-химических и каталитических свойств выделенного фермента;
исследовано специфическое действие препарата Галактозим на лактозу молочных продуктов и определены оптимальные условия их ферментативной обработки с целью достижения требуемой степени гидролиза молочного сахара.
Научная новизна подтверждена получением положительного решения на Заявку № 2006110265 от 31.03.2006 г. о выдаче патента на изобретение «Средство для коррекции дефицита лактазы».
Практическая ценность работы состоит в разработке технологии получения из комплексного ферментного препарата Лактоканесцин лекарственной субстанции, содержащей грибную Р-галактозидазу, с применением современных методов выделения и очистки. Разработанная технология апробирована в опытных условиях и обеспечивает выход фермента не менее 75%. Анализ свойств очищенного препарата (3-галактозидазы показал целесообразность его использования для коррекции лактазной недостаточности. Препарат универсален для применения: он может быть использован как для получения низколак-тозных молочных продуктов, так и в качестве лекарственного средства для заместительной терапии. Разработана готовая лекарственная форма препарата в виде капсул. По эффективности действия полученный препарат не уступает зарубежному аналогу «Лактразе» (США), предназначенному для перорального применения при непереносимости молочного сахара.
На основе проведенных испытаний разработана нормативно-техническая документация, включающая технологические регламенты и Фармакопейные статьи предприятия (ФСП) на субстанцию Галактозим, готовое лекарственное средство в виде капсул и фермент-стандарт. Наработаны опытные образцы препарата и проведены их доклинические испытания. Фармакопейный комитет Министерства здравоохранения и социального развития Российской
Федерации после рассмотрения комплекта представленной документации рекомендовал препарат для клинических испытаний.
Работа выполнена в рамках Государственного контракта № 15.802.1.1.0002 от 15 марта 2002 г. «Организация производства ферментных субстанций и импортозамещающих лекарственных средств для заместительной терапии, лечения дерматомикозов и коррекции энзимодефицита» и является вкладом в реализацию приоритетного национального проекта «Здоровье», поскольку создание отечественного препарата лактазы расширит ассортимент лекарственных средств, предназначенных для лечения желудочно-кишечных заболеваний, позволит избежать закупок аналогичных препаратов за рубежом, а его использование качественно улучшит питание значительной части населения.
Галактозидаза и источники ее получения
Р-Галактозидаза (P-D-галактозидгалактогидролаза, 3.2.1.23) относится к классу гидролаз (карбогидраз) и является одним из самых распространенных ферментов, катализирующих гидролиз гликозидных связей. Она присутствует в животных, растительных тканях, в микроорганизмах. Этот фермент обнаружен в яблоках, томатах, грушах, авокадо и др. [Shi Yi-Min et al., 1994; Ross et al., 1994; Kitagava et al., 1995; Tateishi et al., 2001; Nakamura et al., 2003; Sumathi Balasubramanian et al., 2005]. Он содержится в тонком кишечнике млекопитающих, особенно в период молочного вскармливания, и в молоке в лактационный период [Антошина, Тельцов; 1998]. Однако с целью промышленного получения фермента чаще всего используются микроорганизмы: бактерии, дрожжи и грибы, синтезирующие (З-галактозидазы с необходимым для конкретных условий применения разнообразием свойств. Кроме того, существенным преимуществом микробных продуцентов, обладающих, как правило, индуцибельным механизмом синтеза (З-галактозидазы, является возможность их регулируемого культивирования в присутствии индуктора на дешевых субстратах, часто являющихся отходами производства.
Среди бактерий активными продуцентами Р-галактозидазы являются представители рода Bacillus: В. subtilis [Anema и др., 1964; Виха и др., 1987], В. megaterium [Pollard, Steers, 1973), В. stearothermophilus [Goodman, Pederson, 1976]. Внимание исследователей привлекли в качестве продуцентов фермента молочнокислые бактерии, широко используемые в производстве различных молочных продуктов. Самая высокая активность р-галактозидазы среди этой группы микроорганизмов была найдена у Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Lactobacilus helveticus, Lactobacilus bulgaricus [Feters и др., 1967; Jagota и др., 1981].
Наиболее полно и всесторонне изучена 3-галактозидаза Escherichia coli, ставшая классической моделью при изучении механизма регуляции синтеза ферментов, а также в молекулярно-биологических и генетических исследованиях [Higgins et al., 1987; Mandelstam, 1962; Steers et al., 1971]. р-Галактозидаза Escherichia coli, вьшускаемая рядом зарубежных фирм в высокоочищенном виде, предназначена для научных исследований. В пищевой промышленности ее использование запрещено, т.к. Escherichia coli является потенциально патогенным микроорганизмом.
В последние годы интенсифицировались работы по генной инженерии с целью увеличения биосинтеза фермента. Проведено клонирование гена, кодирующего высокостабильную Р-галактозидазу Bacillus stearothennophilys, в культуру Bacillus subtilis с увеличением выхода фермента в 50 раз [Hirata et al., 1985].
Высокая активность Р-галактозидазы обнаружена и во многих дрожжевых культурах, среди которых перспективными продуцентами являются Kluyveromyces (Saccharomyces) fragilis, Kluyveromyces lactis и ряд других микроорганизмов [Фе-никсова и др., 1973; Фениксова и др., 1975; Bardosa et al., 1985].
В качестве продуцентов Р-галактозидазы используются дрожжи родов Torulopsis, Candida ptoh et al., 1982; Pedrique et al., 1982] и др. Так, термотолерантный штамм дрожжей рода Candida, растущий на средах с высоким содержанием лактозы (до 15%), синтезирует Р-галактозидазу с активностью 22 ед/мл. Однако дрожжи этого рода в нашей стране применяются только для кормовых целей.
Бактерии и дрожжи образуют внутриклеточную Р-галактозидазу, для выделения которой требуется дополнительная стадия разрушения клеточной стенки и извлечения фермента, что усложняет технологический процесс и приводит к увеличению потерь конечного продукта.
Наиболеее интересны и перспективны для промышленного использования грибные продуценты Р-галактозидазы, которые синтезируют внеклеточный фермент, накапливающийся в значительном количестве в культуральной жидкости при их глубинном культивировании. Широко исследовались Р-галактозидазы из Neurospora crassa, однако этот продуцент признан неперспективным для практического использования вследствие необычайной легкости его спор [Jonson, DeBusk, 1970; Stephens et al., 1975]. Известны в качестве продуцентов микроскопические грибы рода Sclerotium (Corticium) [Sakaguchi, Yamaguchi, 1973; Sugira et al., 1976; Bhosale, Shevale, 1995]. Интересно, что продуцент целлюлолитического комплекса ферментов - гриб Trichoderma reesei при росте на лактозе в непрерывном режиме культивирования образует внеклеточную Р-галактозидазу [Castillo et al., 1984].
Пастор и Парк [Pastor, Pare, 1979] обнаружили, что среди выделенных из почвы 1067 штаммов грибов 5 штаммов, относящихся к родам Scopularopsis, Spicaria и Aspergillus, способны продуцировать внеклеточную Р-галактозидазу на среде с пшеничными отрубями. Японскими исследователями детально изучены широко применяемые в промышленности Р-галактозидазы из Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori [заявки Японии, 1974,1974,1977].
Проводился поиск продуцентов р-галактозидазы среди термофильных микроорганизмов, способных расти при температуре 45-60 С на среде с единственным источником углерода - лактозой. Был выделен штамм Mucor pusillus [Sorensen, Crisan, 1974], продуцирующий термостабильную Р-галактозидазу, которая могла быть использована для обработки молока во время пастеризации.
Методы выделения и очистки фермента
Для разделения комплекса ферментов, белков и низкомолекулярных веществ применяли метод ионообменной хроматографии (ИОХ) на карбоксиме-тилцеллюлозе (КМ-целлюлозе) и ДЭАЭ-целлюлозе фирмы «Serva», использовали метод гель-фильтрации через сефадекс G-100 и G-200 фирмы «Pharmacia» (Швеция). Обработку сорбентов и заполнение колонок проводили по методу, рекомендованному фирмой. В работе применяли колонки различных размеров: для ИОХ использовали колонки размером 2,5x30; 3,5 40 см, для гель фильтрации - 1,5 х 100 см.
Для перевода раствора образца в нужную ионную форму использовали диализ. Диализ проводили через целлофан при температуре 5-7 С против буфера, которым уравновешена хроматографическая колонка, в течение 18-20 ч.
Хроматографическое разделение ферментативного комплекса на КМ-целлюлозе проводили в цитратно-фосфатном буфере при разной ионной силе (0,0015 М - 0,15 М) и рН 5,2-5,5. Процесс элюции исследовали при изменении рН раствора от 5,2 до 7,5, а также в градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 1 М в 0,015 М фосфатно-цитратном буфере рН 5,2-5,5.
На колонку (2,5x30 см) с КМ-целлюлозой наносили 15-20 мл диализо-ванного ферментного раствора, содержащего 500-700 мг белка. Скорость сорбции составляла 40 мл/ч, скорость элюции - 100 мл/ч. Фракции собирали по 5 мл.
Для обессоливания ферментного раствора использовали диализ, гель-фильтрацию на сефадексе G-25 и метод диафильтрации.
Гель-фильтрацию на сефадексе G-25 проводили с использованием колонок размером 2,5 30,0 см, 3,5x40,0 см, 1,5x90,0 см. Сефадекс уравновешивали 0,02 М ацетатным буфером рН 4,2. Скорость гельфильтрации составляла 20 мл/ч. Фракции собирали по 3-5 мл. Наличие солей в ферментном растворе проверяли качественными реакциями на ионы СГ с AgNC .
Обессоливание методом диафильтрации проводили на ультрафильтрационной установке периодического действия фирмы «Amicon» с объемом ячейки 350 мл при рабочем давлении 0,3 МПа. Использовали отечественные мембраны УПМ-10 и УПМ-20 (ЗАО «Владипор»). При обессоливании методом диафиль-рации применяли многократное разбавление ферментного раствора.
Ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе проводили на колонке (2,5x45 см), уравновешенной 0,01 М трис-НС1 буфером рН 7,5. Концентрированную фракцию фермента диализовали против того же буфера и наносили на колонку. Объем пробы 5-Ю мл, содержание белка 70-100 мг. Скорость сорбции - 45 мл/ч, скорость элюции 60 мл/ч. Элюцию осуществляли в градиенте концентрации NaCl (0-0,5 М). Объем фракций - 5 мл.
Гель-фильтрацию на сефадексе G-100 и G-200 проводили на колонке размером 1,5x100 см в 0,02 М ацетатном буфере рН 4,2. На колонку наносили концентрированную фракцию фермента (2-5 мл), содержащую 50-100 мг белка, диализованную против 0,02 М ацетатного буфера рН 4,2. Гель промывали исходным буфером. Скорость фильтрации на сефадексе - 20 мл/ч. Объем фракций - 4-5 мл.
Изучение стабильности р-галактозидазы в водном растворе
В процессе выделения и очистки ферменты подвергаются воздействию различных физических и химических факторов, которые могут приводить к потере энзиматической активности. Кроме того, выделение фермента в производственных условиях происходит в течение довольно длительного времени: от нескольких часов до нескольких суток. Поэтому следующая задача исследований заключалась в изучении стабильности Р-галактозидазы в водном растворе и влияния на ее активность отдельных факторов, от которых зависит эффективность используемых методов выделения.
Основными факторами, которые необходимо учитывать в процессе очистки и на которые можно влиять, являются температура, продолжительность процесса и рН среды.
Для изучения устойчивости Р-галактозидазы фугат ферментного раствора выдерживали различное время при температуре 4-6 С и 20 С, не принимая во внимание возможный рост микрофлоры (табл. 5).
Как видно из таблицы, через шесть суток даже при температуре 20 С остается больше 75 % исходной активности фермента. При выдерживании ферментного раствора в условиях пониженной до 4-6 С температуры активность Р-галактозидазы в течение 6 суток практически не снижается
Таким образом, фермент Р-галактозидаза устойчив в водных растворах в течение продолжительного времени, особенно при пониженной температуре, и может выдерживать длительные процедуры обработки.
Еще одним фактором, влияющим на активность Р-галактозидазы в процессе очистки, является рН среды. Для каждого фермента существует определенный диапазон рН, в котором он стабилен. При сдвиге рН от указанной зоны фермент теряет свою активность и легче подвергается денатурации.
Стабильность Р-галактозидазы опредяли в диапазоне рН от 2,0 до 8,0. Ферментный раствор подкисляли 0,5 Н раствором уксусной кислоты или подщелачивали разбавленным раствором щелочи (NaOH) и при заданном значении рН выдерживали в течение 24 ч при комнатной температуре, после чего определяли остаточную активность Р-галактозидазы (на рис.2).
Как видно, Р-галактозидаза из Penicillium canescens F-178 устойчива в широком диапазоне рН. Так, при рН 3,0-6,0, в течениие 24 ч инкубации при температуре 20 С фермент сохраняет 100% активности. При рН 2,0 и 2,5 после 24 ч инкубации фермент сохраняет 55 % и 80 % активности соответственно. При значении рН 7,0 и 8,0 активность фермента снижается до 95 и 90 % соответственно. рН среды
Таким образом, в результате проведенных экспериментов было установлено, что фермент (З-галактозидаза стабилен в водных растворах в течение длительного времени при температурах 4 С и 20 С и при различных значениях рН среды, и не требует создания специальных условий для сохранения активности.
Выбор метода очистки фермента зависит от множества факторов: от источника получения фермента, его свойств, области применения. Особое внимание также следует обращать на воспроизводимость выбранного метода в промышленных условиях.
Наиболее перспективным для разделения, очистки и концентрирования венные полиамидные мембраны типа УГОЛ (УПМ-20, УПМ-50, УПМ-67 и УПМ-100). Процесс вели при температуре 18-20 С и давлении 0,2-0,4 МПа. Результаты опытов представлены в таблице 6.
Из приведенных данных видно, что все виды мембран, кроме УПМ-100, обеспечивают концентрирование фермента с высоким выходом (92-97 %). Производительность процесса при их использовании варьирует от 15,8 до 34,5 л/м2 ч, а удельная активность - от 6,8 до 25,6 ед/мг белка. Максимальная удельная активность (25,6 ед/мг белка), степень очистки (5,1) и производительность (34,5 л/м2ч) получены на мембране УПМ-67, хотя ее селективность меньше (96,5%), чем УПМ-20 и УПМ-50 (99,4 и 98,3%) соответственно). Учитывая, что основная цель нашего исседования максимальное снижение содержания сопутствующих веществ белковой и небелковой природы, т.е. повышение истепени чистоты, выбираем мембрану УПМ-67, при использовании которой достигается оптимальное соотношение показателей селективности мембраны, производительности процесса и удельной активности 3-галактозидазы.
