Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. На территории Российской Федерации имеется значительное количество стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов (Черкасский Б.Л., 1999; Жуков А.Н. с соавт., 2000; Еременко Е.И. с соавт., 2001). В стране ежегодно регистрируются случаи заболевания людей и животных сибирской язвой (Монисов А.А. с соавт., 1997; Черкасский Б.Л., 2002; Онищенко Г.Г., 2003). При этом, отличительной особенностью сибиреязвенного микроба является чрезвычайная устойчивость и длительная сохраняемость его спор в почве, что создает реальную угрозу заражения животных и людей, тем самым может способствовать осложнению эпизоотологической и эпидемиологической ситуации (Соркин Ю.И., Родзиковский А.В., 1997; Ипатенко Н.Г., Выдрин В.Н., 1998; Черкасский Б.Л., 1999; Бакулов И.А. с соавт., 2001; Ріпі Р., 1996; Hauwaert Th., 2002). Возбудитель данного заболевания еще со времен II мировой войны считается одним из вероятных агентов бактериологического оружия. События в США с появлением писем со спорами сибирской язвы подтвердили факт, что Bacillus anthracis может использоваться для локальных биотеррактов (Тихонов Н.Г., Липницкий А.В., 2000; Черкасский Б.Л., 2002; Berche Р., 1998; Lamb А., 2001; Deroin Ph., 2001; Perkin В., 2003).
Важным противоэпидемическим звеном в борьбе с этим особо опасным инфекционным заболеванием принадлежит иммунопрофилактике, в частности вакцинам (Бакулов И.А. с соавт., 2001; Пименов Е.В. с соавт., 2002; Ivins Е.В. et al., 1994; Turnbull P. et al., 2001).
Анализ данных литературы отечественных и зарубежных авторов свидетельствует о разноплановом изучении средств специфической профилактики сибирской язвы: усовершенствование существующих видов живых вакцин путем получения их антибиотикоустойчивых вариантов (Буравцева Н.П., 1991; Pomerantsev А.Р., 1995; Пименов Е.В с соавт., 2002), сочетанное применение живых вакцин с неспецифическими иммуномодуляторами (Шляхов Э.Н., Кику В.Ф., 1984; Коготкова О.И., 1989; 2000; 2004), экспериментальное изучение химических вакцин (Fellows P.F. et al., 1998; 2001; Friedlander A., 2002), а также получение вакцин методами генной инженерии (Tang D. et al., 1992; Price В. et al. 2001; Hahn U.K. et al., 2003; Galloway D. et al., 2003).
Живые вакцины, в отличие от других видов вакцин, имеют ряд преимуществ: рентабельность их промышленного производства (Буравцева Н.П., 1991), индукция более продолжительного иммунитета (Ivins В.Е., Welkos S.L., 1988). Несмотря на то, что по безопасности живые вакцины уступают химическим, они легко контролируются применением информативных методов оценки их остаточной вирулентности, генетической стабильности и однородности производственных штаммов микроорганизмов (Бектимиров Т. А., 1997). Данный вид вакцин характеризуется сохранением основных фенотипических и генетических свойств их клеточной популяции, в том числе иммунологической активности (Буравцева Н.П., 1991).
Однако живые сибиреязвенные вакцины, в частности вакцина СТИ, невозможно использовать ппнпиремдн'нп t с. рнт^блг7тикні"її, fff средствами
л*ятайг»
CJ S
экстренной профилактики. Это явилось основанием к проведению многолетних исследований, в результате которых в СтавНИПЧИ была создана живая антибиотикоустойчивая сибиреязвенная вакцина СТИ-ПР (Буравцева Н.П., 1987).
Приоритетность проведения сочетанной специфической и экстренной профилактики в системе противоэпидемических мероприятий определяется необходимостью купирования инфекционного процесса у потенциально инфицированных и скорейшего создания иммунной прослойки, прежде всего среди групп с наибольшим риском заражения (Рыжко И.В. с соавт., 2003; Молдаван И.А., 2005).
В СтавНИПЧИ имеется целый ряд серий вакцины СТИ-ПР, лиофильно высушенных на различных средах в различные годы, изучение которых представляет не только научный интерес, но имеет и практическое значение, так как одной из важных проблем современной вакцинологии является периодический контроль за стабильностью сохранения основных фенотипических, генетических, в т.ч. иммуногенных свойств живых вакцин (Маринин Л.И. с соавт , 1999; 2003).
К настоящему времени накопилось значительное количество современных, в
основном, нетрудоемких и легко воспроизводимых экспериментальных методов
изучения различных фенотипических и генетических свойств сибиреязвенного
микроба, использование которых, на наш взгляд, является весьма перспективным и '
может быть существенным дополнением к ныне действующим Методическим
указаниям «Основные требования оценки вакцинных штаммов сибиреязвенного
микроба для иммунизации людей» (Саратов, 2002). Так, разработана питательная
среда для определения продукции экзотоксина и капсул ообразования
сибиреязвенного микроба (Еременко Е.И., 1997). Предложен штамм В. cmthracis 81/1 ^
в качестве типичного вирулентного тест-заражающего штамма для определения иммуногенности живых сибиреязвенных вакцин (Буравцева Н.П. с соавт, 1999). Экспериментально апробирован метод определения иммуногенности живых сибиреязвенных вакцин по двум дозам заражения данным штаммом вакцинированных морских свинок (Буравцева Н.П., 1991).
В качестве информативного метода определения уровня специфического антителообразования предложен непрямой метод реакции иммунофлуоресценции (Буравцева Н.П. с соавт., 1998). Показано, что при поствакцинальном противосибиреязвенном иммунитете наиболее информативным параметром клеточных факторов неспецифической резистентности является кислородзависимая функция нейтрофилов крови, регистрируемая в тесте восстановления нитросинего тетразолия, гуморальных факторов - лизоцим (Коготкова О.И., Буравцева Н.П., 1993) В последнее десятилетие существенным дополнением к характеристике возбудителя сибирской язвы служат данные полимеразной цепной реакции (Ramisse V. et al., 1996; Keim et al., 2000).
Сказанное выше убедительно свидетельствует о широком диапазоне экспериментально-методических подходов к изучению возбудителя сибирской язвы и живых вакцин против данного.заболевания. Однако анализ данных литературы показал, что сведения по изучению стабильности сохранения основных свойств вакцин после их длительного хранения носят единичный и разобщенный характер (Гинсбург Н.Н. с соавт., 1964; Салтыков А.А. с соавт., 1976; Шенцев И.В. с соавт.,
1981; Шереметьева Ю.В с соавт., 2004), что побудило нас к систематизации и разработке алгоритма изучения и получения живых сибиреязвенных вакцин как в условиях in vitro, так и в условиях in vivo. Исследования решено было выполнить на примере различных серий антибиотикорезистентной живой сибиреязвенной вакцины СТИ-ПР, так как в доступной литературе имеются единичные сообщения о свойствах данной вакцины (Буравцева Н.П., 1991; 2002; Pomerantsev А.P. et al., 1995).
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: изучить основные биологические свойства различных серий, усовершенствовать методы оценки и повышения иммуногенности живой сибиреязвенной антибиотикоустойчивой вакцины СТИ-ПР
-
Изучить стабильность сохранения основных биологических свойств различных серий вакцины СТИ-ПР после длительного хранения.
-
Разработать алгоритм исследования живых сибиреязвенных вакцин в эксперименте.
-
Получить новые экспериментально-производственные серии вакцины СТИ-ПР.
-
Определить протективное действие сочетанного применения вакцины СТИ-ПР с иммуномодулятором ликопидом.
-
Определить иммунологическую эффективность вакцины СТИ-ПР при ее сочетанном применении с антибиотиками и ликопидом.
В результате впервые проведенного комплексного анализа дана сравнительная характеристика биологических свойств различных серий вакцины СТИ-ПР после их длительного хранения, а также изученных клеточных популяций, выделенных из них и вновь полученных экспериментально-производственных серий данной вакцины- установлена однородность клеточных популяций по фенотипическому, биохимическому, генетическому признаку, а также антибиотикоустойчивости.
Доказана стабильность сохранения основных фенотипических, генетических и иммунологических свойств вакцины СТИ-ПР на протяжении 25 лет хранения (срок наблюдения), что иллюстрирует и подтверждает значительное преимущество живых вакцин над другими видами.
В результате впервые проведенного анализа плазмидного и генного профиля различных серий вакцины СТИ-ПР после длительного хранения и сравнительного анализа их генетической вариабельности по разным локусам, установлено, что генетическая однородность на уровне отдельных серий вакцины СТИ-ПР подтверждена принадлежностью к 4 VNTR-катеі ории культур, выделенных ил различных серий данной вакцины, по локусу vrrA.
Впервые выявлена высокая устойчивость вакцины СТИ-ПР к карбенициллину (10 000мкг/мл).
Установлено, что ликопид, введенный в схему однократной подкожной иммунизации усиливает протективный эффект вакцины СТИ-ПР.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.
Экспериментально доказана возможность увеличения срока годности вакцины СТИ-ПР с 2-3 лет до 5-8 лет.
Результаты исследований свидетельствуют о необходимости усовершенствования существующих и поиска новых сред бактериологического контроля за специфической стерильностью препарата.
Хромосомная детерминация антибиотикорезистентности к
беизилпснициллину, ампициллину, оксациллину, метициллину, рифампиішну, а также стабильность сохранения основных биологических свойств вакцины СТИ-ПР на протяжении длительного времени характеризуют последнюю как перспективное средство иммунопрофилактики сибирской язвы.
Определены критерии для скрининга наиболее иммуногенных клеточных популяций живых сибиреязвенных вакцин.
Разработанный алгоритм изучения живых сибиреязвенных вакцин может служить научно-методической основой для дальнейшего усовершенствования существующих и разработки новых видов живых сибиреязвенных вакцин.
При изучении иммунологической эффективности вакцины СТИ-ПР на морских свинках экспериментально доказана возможность снижения иммунизирующей дозы с 5-Ю7 спор до 1-Ю6 спор при однократном подкожном методе введения.
В соавторстве разработаны методические рекомендации: «Определение иммуногенности живых сибиреязвенных вакцин по двум дозам тест-заражающего вирулентного штамма», утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором В.И. Ефременко, протокол заседания Ученого совета № 6 от 25 июня 2004 г. и методические рекомендации: «Изучение стабильности сохранения устойчивости к антибактериальным препаратам у антибиотикоустойчивых штаммов В anthracis в процессе хранения», утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором В И Ефременко, протокол заседания Ученого совета № 5 от 27 мая 2005 г.
Материалы диссертации вошли в заключительный отчет по научно-исследовательской работе «Изучение жизнеспособности спор, стабильности сохранения устойчивости к- антибиотикам и иммуногенных свойств вакцины СТИ-ПР после длительного хранения, совершенствование ее популяционного состава и определение эффективности сочетанного применения вакцины с табельными антибиотиками и иммуномодулятором ликопидом» (2002-2004 гг), являющейся составной частью по теме "Разработка и совершенствование средств и методов профилактики и лечения опасных и особо опасных инфекционных заболеваний" Федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники" на 2002-2006г.г., блок 2 "Поисково-прикладные исследования и разработки", раздел "Технология живых систем", подраздел "Защита от патогенов", где автор был исполнителем.
Раздел 4.1. выполнен совместно со старшим научным сотрудником лаборатории сибирской язвы СтавНИПЧИ, кандидатом медицинских наук, Цыганковой О.И.
Раздел 5.1. выполнен совместно с ведущим научным сотрудником лаборатории диагностических препаратов особо опасных и других инфекций, доктором биологических наук, Жарниковой И В., за что автор выражает им искреннюю благодарность.
1. Изученные серии вакцины СТИ-ПР стабильно сохранили свои основные
биологические свойства после их длительного хранения.
2. Алгоритм определения иммуногенности живых сибиреязвенных вакцин.
3. Ликопид, вводимый однократно подкожно одновременно с вакциной СТИ-ПР
оказывает иммуностимулирующий эффект при поствакцинальном
противосибиреязвенном иммунитете.
4 Иммунологическая эффективность вакцины СТИ-ПР повышается при сочетанном введении антибиотиков широкого спектра действия и ликопида.
Материалы диссертации были представлены на юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставрополь, 2002), на конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология -XXI век» (Саратов, 2004), на межлабораторных научных конференциях СтавНИПЧИ (2002-2005).
Основное содержание диссертации отражено в 11 опубликованных работах
Работа изложена на 145 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 197 работ, из них 112 отечественных и 85 зарубежных авторов. Материалы иллюстрированы 8 рисунками 29 таблицами
![Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]](/i/i/4503/199818.png "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс] Донин Михаил Васильевич")
