Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 15
2.1. Введение 15
2.2. Эпидемиология сибирской язвы 16
2.3. Клинические проявления сибирской язвы улюдей 19
2.4. Морфология возбудителя сибирской язвы 20
2.5. Биохимические свойства 22
2.6. Антигенная структура 22
2.7. Патогенность возбудителя сибирской язвы 24
2.8. Токсин 25
2.8.1. Отечный фактор 27
2.8.2. Летальный фактор 28
2.8.3. Протективный антиген 31
2.8.4. Механизм действия сибиреязвенного токсина 32
2.9. Лечение сибиреязвенной инфекции 41
2.10. Противосибиреязвенные вакцины 42
2.10. 1. Живые сибиреязвенные вакцины 42
2.10.2. Химические вакцины 45
2.10.3. Комбинированные вакцины 47
2.10.4. Проблемы совершенствования сибиреязвенных вакцин 48
2.11. Моноклональные антитела- инструменты исследования и препараты медицинского назначения 52
2.11.1. Получение моноклональных антител 55
2.11.2. Свойства моноклональных антител 57
2.11.3. Области применения моноклональных антител 57
3. Материалы и методы 61
3.1. Бактериальные штаммы и генно-инжинерные конструкции 61
3.2. Экспрессия и продукция рекомбинантных ПА и ЛФ в Е. coli 67
3.3. Получение отдельных доменов ПА и ЛФ 67
3.4. Выделение нативных ПА и ЛФ 69
3.5. Получение нетоксичного комплекса (ПА63)7:ЛФн и комплекса (ПА63)7:ЛФ... 71
3.6. Получение антисывороток к олигомеру ПАбЗЛФн 71
3.7. Определение уровня специфичности антител у иммунизированных мышей 72
3.8. Получение гибридом 72
3.8.1. Культивирование миеломной клеточной линии 72
3.8.2. Подготовка макрофагального фидерного слоя 72
3.8.3. Выделение спленоцитов гипериммунных мышей 73
3.8.4. Гибридизация 73
3.8.5. Селекция гибридных клеток 73
3.8.6. Скрининг гибридных клеток - продуцентов mAb 74
3.8.7. Клонирование гибридных клеток 75
3.8.8. Масштабирование гибридом 75
3.8.9. Культивирование гибридом in vivo 75
3.8.10. Криоконсервация 75
3.9. Выделение и очистка моноклональных антител из асцитов 76
3.10.. Определение специфичности МАТ 76
3.11. Определение индекса аддитивности 77
3.12. Оценкатоксин-нейтрализующейактивности invitro 78
3.13. Анализ нейтрализующей активности антител in vivo 79
3.14. Анализ протективной активности отдельных доменов ПА in vivo 79
4. Результаты исследований 80
4.1. Клонирование генов ПА и ЛФ и приготовление конструкций 80
4.2. Экспрессия и продукция рекомбинантных ПА и ЛФ в Е. coli 83
4.3. Продукция и характеристика антигенов возбудителя сибирской язвы 87
4.4. Получение олигомерного комплекса 88
4.5. Иммунизация мышей и получение mAb 89
4.6. Получение и характеристика моноклональных антител к летальному токсину В. anthracis 90
4.6.1. Анализ специфичности моноклональных антител к компонентам сибиреязвенного токсина 91
4.6.2. Определение подклассовой принадлежности 94
4.7. Оценка токсин-нейтрализующей активности на клетках линии J 774 АЛ in vitro 95
4.7.1. Исследования нейтрализации токсина моноклональными антителами против компонента токсического комплекса возбудителя сибирской язвы 97
4.8. Определение доменной специфичности моноклональных антител к сибиреязвенному токсину 102
4.8.1. Идентификация доменов протективного антигена взаимодействующих с моноклональными антителами 102
4.8.2, Идентификация доменов летального фактора взаимодействующих с моноклональными антителами 108
4.9. Исследование роли Fc-фрагмента mAb в усилении токсического эффекта летального токсина на макрофагоп одо бную клеточную линию 112
4.10. Определение сайтов связывания моноклональных антител к протективному антигену В. anthracis 113
4.11. Нейтрализующая активность mAb к протективному антигену in vivo 117
4.12. Исследование протективной активности отдельных доменов ПА .120
4.13. Изучение структуры иммунного ответа у животных,
иммунизированных вакцинным штаммом сибирской язвы СТИ-1 121
5. Обсуждение результатов 122
6. Выводы 130
7. Список литературы 132
- Антигенная структура
- Проблемы совершенствования сибиреязвенных вакцин
- Анализ специфичности моноклональных антител к компонентам сибиреязвенного токсина
- Идентификация доменов летального фактора взаимодействующих с моноклональными антителами
Введение к работе
Актуальность темы
Сибирская язва является особо опасным острым инфекционным заболеванием, поражающим животных и людей. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире ежегодно регистрируется от 2000 до 20000 случаев заболеваний сибирской язвой. Высокая заболеваемость обусловлена тем, что возбудитель сибирской язвы способен больше 100 лет сохраняться в почве в виде спор и образовывать стойкие очаги инфекции. Существование таких очагов в разных регионах мира создает постоянную угрозу эпизоотии и эпидемических вспышек среди людей и животных. В России известно около 72 тысяч пунктов, в которых регистрировались случаи сибирской язвы [16]. В настоящее время отмечается активизация многих очагов и Государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора оценивает эпидемическую обстановку по сибирской язве как напряженную [15]. Bacillus anthracis является одним из вероятных патогенов, используемых для создания высокоэффективного бактериологического оружия. Особую актуальность эта инфекция приобрела после применения спор этого микроорганизма в качестве бактериологического оружия в США осенью 2001 года. По оценкам экспертов, на сегодняшний день как минимум 17 стран или уже располагают готовым биологическим оружием, или завершают разработки в этой области [44]. Применение спор сибирской язвы в качестве биологического оружия обусловлено относительной легкостью получения большого количества биологического материала, возможностью его скрытного применения, высокой эффективностью [67]. Наиболее вероятный способ применения сибирской язвы в виде бактериологического оружия - распыление аэрозоля, содержащего жизнеспособные споры возбудителя. В связи с этим среди пораженных будут преобладать пациенты с легочной формой болезни, сопровождающейся высокой летальностью [53]. Кроме того, в последние годы в природных условиях обнаружены штаммы возбудителя сибирской язвы с признаками, не свойственными типичным штаммам, способные преодолевать специфический иммунитет и вызывающие заболевание у привитых людей и животных, а также штаммы Bacillus anthracis, устойчивые к применяемым в настоящее время антибиотикам.
Доступные в настоящий момент сибиреязвенные вакцины, одобренные для использования в России и странах Запада, были разработаны десятилетия назад. Кроме того, вакцины могут быть неприменимы в определенных случаях, например для детей, для пожилых и некоторых других категорий населения, в силу их реактогенности и побочных эффектов [90] Стандартизация защиты, обеспечиваемой этими вакцинами, затруднена. В частности, уровень протек-тивного антигена (ПА) в этих вакцинах не определяется и стандартный анализ на нейтрализующую активность антител, вырабатываемых после вакцинации, отсутствует [113]. Следовательно, разработка новых эффективных средств профилактики, диагностики и терапии сибирской язвы, основанных на тщательных исследованиях молекулярных характеристик и механизмов действия антигенов возбудителя, крайне важна для защиты населения.
Клетки Bacillus anthracis в вегетативном состоянии вырабатывают тройной комплекс токсина, который состоит из рецептор-связывающего компонента, также известного как протективный антиген (ПА) и двух эффекторов, летального фактора (ЛФ) и эдема-фактора [44]. Летальный фактор является единственным токсическим компонентом, который напрямую отвечает за летальный исход сибирской язвы. Поэтому ранняя детекция и или нейтрализация активного ЛФ либо в образцах, полученных от пораженных людей или в бактериальных образцах, выращенных для анализа, имеет первостепенное значение для успешного предотвращения и лечения сибирской язвы. Единственный известный компонент токсина, защитный эффект которого доказан - это ПА. Таким образом, логично использовать ПА в качестве принципиального компонента новых вакцин. Несовершенство используемых на данный момент вакцин и возросшая потребность в быстром и мощном терапевтическом средстве, способном нейтрализовать сибиреязвенное поражение, выводят на первый план значение эффективной пассивной иммунотерапии. Пассивная терапия антиген-специфическими антителами и сейчас является значимым дополнением к вакцинации и терапии антибиотиками.
Цель исследования
Изучить особенности гуморального иммунного ответа на сибиреязвенную инфекцию на модели животных и провести картирование моноклональных антител на летальный токсин В. anthracis, обладающих защитным действием как in vitro так и in vivo, для конструирования иммунологически эффективных препаратов протективного антигена и летального фактора для создания химической вакцины нового поколения.
Задачи исследования
1. Сконструировать рекомбинантные штаммы Е. coli - продуценты полноразмерных белков и отдельных доменов протективного антигена и летального фактора В. anthracis.
2. Получить и охарактеризовать панель моноклональных мышиных антител к протективному антигену В. anthracis.
3. Получить и охарактеризовать панель моноклональных мышиных антител к летальному фактору В. anthracis.
4. Изучить молекулярный механизм, детерминирующий потенцирующее действие мышиных моноклональных антител к протективному антигену В. anthracis in vitro. 5. Определить антигенные детерминанты потенцирующих и блокирующих мо-ноклональных мышиных антител к компонентам сибиреязвенного токсина.
6. Провести изучение действия полученных антител in vivo при экспериментальной сибиреязвенной инфекции.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Мышиные моноклональные антитела к протективному антигену могут как блокировать, так и потенцировать действие летального токсина В, anthracis in vitro в культуре мышиных макрофагов линии J774.
2. Моноклональные антитела к протективному антигену, блокирующие действие летального токсина В. anthracis in vitro, специфичны к IV домену ПА.
3. Моноклональные антитела к протективному антигену, потенцирующие действие летального токсина В. anthracis in vitro, специфичны к III домену ПА.
4. Механизм потенцирования действия состоит в Fc-рецепторном усилении эн-доцитоза комплекса летального токсина в чувствительную клетку-мишень.
5. Моноклональные антитела к летальному фактору, блокирующие действие летального токсина В. anthracis in vitro, специфичны к I домену ЛФ.
6. Пассивная иммунизация мышей блокирующими антителами спасает животных при экспериментальной сибиреязвенной инфекции.
Научная новизна
• Показан механизм потенцирования действия летального токсина В. anthracis in vitro мышиными моноклинальными антителами к протективному антигену.
• Впервые установлено, что блокирующие и потенцирующие действия летального токсина В. anthracis моноклональные антитела к ПА имеют разную эпитопную специфичность.
• Впервые установлена тонкая структура антигенных детерминант полученных моноклональных антител к 3 домену протективного антигена. • Выявлено, что механизм потенцирования действия состоит в Fc-рецепторном усилении эндоцитоза комплекса летального токсина в чувствительную клетку-мишень.
Теоретическая значимость Основные теоретические итоги проделанной работы заключаются в определении особенностей иммунного ответа на протективный антиген и летальный фактор В. anthracis на модели животных и биологического действия, полученных моноклональных антител совместно с летальным токсином in vitro. Полученные данные свидетельствуют о том, что моноклональные антитела к про-тективному антигену могут, как блокировать, так и потенцировать действие летального токсина В. anthracis in vitro в культуре мышиных макрофагов линии J774. Установлен механизм потенцирования действия летального токсина В. anthracis.
Практическая значимость работы Полученные данные о тонкой антигенной специфичности моноклональных антител, обладающих протективным действием как in vitro, так и in vivo, являются базой для разработки вакцин нового поколения против сибирской язвы в плане создания современных иммунологически эффективных препаратов рекомбинантных компонентов протективного антигена и летального фактора. Структура антиген-связывающих фрагментов (CDR1-CDR3) полученных блокирующих антител может быть использована для создания гуманизированных антител для пассивной иммунизации определенных групп населения против сибирской язвы.
Апробация материалов диссертации
Основные результаты исследований доложены и обсуждены на международных научных конференциях: 1 llh European Conference on Bacterial Protein Toxins, June 28-July 2003, Celacovice, Czech Republic; IX European MulticoUoquium of Parasitology, Valencia, Spain, July 18-23, 2004; 7th JOHN HUMPHREY AD 13 VANCED SUMMER PROGRAMME IN IMMUNOLOGY, September 5-9, 2005; II Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 20-21 октября 2005г.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Shemyakin I.G., Belova E.V., Kravtchenko Т.В. Study of inhibitory antitoxin activity of monoclonal antibodies obtained against nonoxic PA63+LFn antrax toxin complex using in vitro and in vivo models. 11th European Conference on Bacterial Protein Toxins, June 28-July 2003, Celacovice, Czech Republic, Poster Abstract-number: P84.
2. E.B. Белова, С.А. Дубилей, Т.Б. Кравченко, А.В. Колесников, И.Г. Шемякин. Антитела к разным эпитопам протективного антигена способны как нейтрализовать, так и потенцировать действие сибиреязвенного токсина in vitro. //Журнал молекулярной генетики, микробиологии, вирусологии. - 2004. - №3. -С. 21-26.
3. Belova E.V., Smolkina А.Е., Kravchenko Т.В., Zakharova M. Yu., Shemyakin I.G. Monoclonal Antibodies against Protective Antigen of Bacillus anthracis Toxin. 7th JOHN HUMPHREY ADVANCED SUMMER PROGRAMME IN IMMUNOLOGY. September 5-9,2005. Moscow. Abstract number: P5.
4. Smolkina A.E., Belova E.V., Kravchenko T.B., Shemyakin I.G. Monoclonal Antibodies against Lethal Factor of Bacillus anthracis Toxin. 7th JOHN HUMPHREY ADVANCED SUMMER PROGRAMME IN IMMUNOLOGY. September 5-9, 2005. Moscow. Abstract number: P44. 5. Белова Е.В., Смолкина А.Е., Кравченко Т.Б., Захарова М.Ю., Шемякин И.Г. Изучение роли отдельных доменов протективного антигена Bacillus anthracis в формировании защитного иммунитета. II Международная конференция Молекулярная медицина и биобезопасность. 20-21 октября 2005г. Тезисы, с.76.
6. Смолкина А.Е., Белова Е.В., Кравченко Т.Б., Шемякин И.Г. Различная степень нейтрализующего действия моноклональных антител к летальному фактору сибиреязвенного токсина. II Международная конференция Молекулярная медицина и биобезопасность. 20-21 октября 2005г. Тезисы, с.254.
Антигенная структура
До настоящего времени антигенный состав возбудителя сибирской язвы изучен недостаточно [6]. Выделяют две группы антигенов В. anthracis. Первая группа - это клеточные антигены, вторая - продукты метаболизма микробной клетки.
Соматический антиген относится к клеточным антигенам бескапсульной формы сибиреязвенного микроба и представлен полисахаридами клеточной стенки. Полисахаридный антиген обладает термоустойчивостью. Соматический антиген носит видоспецифический характер, встречается у других близкородственных видов и дает перекрестные серологические реакции с пневмококками и антигеном эритроцитов человека группы А [15].
К клеточным антигенам относят и капсульный комплекс. По химическому составу это протеиноподобныЙ полипептид D-глутаминовой кислоты. В составе оболочки и капсулы В. anthracis обнаружены три антигенных комплекса: - поверхностные антигены капсулы, являющиеся пептидами; - собственно капсульные антигены, расположенные в основном слое капсулы, содержат вещества белково-полисахаридной природы; - антигены оболочки клетки, содержащие вещества полисахаридной и белковой природы [15]. Экзотоксин представляет собой белковую молекулу, состоящую из трех субъединиц: протективного антигена (ПА), отечного (ОФ) и летального (ЛФ) факторов [46]. В молекуле токсина протективный антиген играет транспортную роль: сначала соединяется со специфическим клеточным рецептором, потом активируется за счет гидролиза и в результате обретает способность образовывать мембранные каналы, чем и обеспечивает перенос двух других субъединиц — отечного и летального факторов — в клетку организма-хозяина [102, 113, 119]. Там эти, по сути самостоятельные, токсины и осуществляют свое цитотоксическое действие: вместе с экзопротеазами вызывают резкие нарушения клеточного обмена, приводя к деградации и гибели клетки. В организме больного протективный антиген выполняет защитную функцию, так как в ответ на его введение образуются антитела, которые предотвращают последующее заражение высоковирулентными штаммами бактерии.
Генетический аппарат сибиреязвенного микроба состоит из хромосомы и двух плазмид (pXOl и рХ02), очень важных для вирулентности и иммуногенности внехромосомных элементов, открытых в начале 80-х годов (рис.2). Плазмида pXOl содержит три токсиновых гена — pag, lef и суа. Первый из них кодирует синтез протективного антигена, второй — летального фактора, третий — отечного фактора [117, 132, 142]. Имеются также гены регуляторов синтеза этих продуктов. В плазмиде рХ02 наиболее значимы гены, определяющие синтез капсулы [61]. К настоящему времени полностью расшифрована нуклеотидная последовательность первой плазмиды и значительная часть второй. Благодаря этому существенно расширились возможности генетических манипуляций с бациллой.
Гены первой плазмиды в основном ответственны за синтез субъединиц экзотоксина: отечного фактора (ген суа), протективного антигена (pag) и летального фактора (lef) [123]. Во второй плазмиде содержится целый кластер генов (сарА, сарС и сарВ), обеспечивающих образование капсулы, т.е. полимеризацию D-глутаминовой кислоты [99]. Из других плазмидных генов на схеме показано положение только тех, которые управляют синтезом. BpXOl — это положительный регулятор синтеза экзотоксина (atxA), отрицательный регулятор синтеза протективного антигена (pagR) и группа генов, обеспечивающих прорастание спор (ger); врХ02 — положительный регулятор синтеза D-глутаминовой кислоты (асрА) и дублированный (atxA), а также ген, ограничивающий полимеризацию капсульной субстанции (dep). На рисунке 2 соблюдена размерная пропорция генов и их расположение в кольцевой структуре каждой плазмиды.
Патогенность СЯ микроба многие авторы связывают с наличием капсулы и продуцированием токсина [7, 87, 127]. Некоторые авторы к факторам патогенности возбудителя СЯ относят способность образовывать протеазу [20], разлагать казеин и желатин. До настоящего времени продолжаются исследования, направленные на выяснение механизмов взаимодействия СЯ микроба с макроорганизмом и определение ключевых звеньев развития заболевания.
Капсулу у возбудителя СЯ в 1888г. обнаружил Serafmi в свежих трупах животных погибших, от СЯ. Капсула защищает бациллы от бактерицидного воздействия неспецифических и специфических факторов макро организма, ингибирует фагоцитоз, способствует фиксации бацилл на эукариотических клетках, что ведет к нарушению обменных процессов, деградации и гибели клеток.
В 1905 г. Bail показал, что сибиреязвенная палочка вырабатывает термостабильное вещество, устойчивое при нагревании до 96С, которое локализуется в капсуле. В дальнейшем было установлено, что основное вещество капсулы состоит из поли- Д- глутаминовои кислоты и не содержит L-изомера [15]. Механизм образования Д-глутаминовой кислоты состоит из серии реакций переаминирования с участием трансаминазы, катализирующей синтез глутаминовои кислоты из аспарагиновой и L-кетоглутаровой кислот. Молекула капсульного полипептида имеет форму нити, молекулярный вес составляет 33500 Д. Иммуногенность капсульного пептида очень слабая.
Способность клеток СЯ продуцировать капсулу определяет плазмида рХ02 [61, 73, 137]. Молекулярная масса плазмиды рХ02 составляет 60 мегадальтон (90-95 т.н.п.) В случае утери способности образовывать капсулу штамм становится авирулентным и может использоваться в качестве живой аттенуированной вакцины. [61, 137, 138].
Проблемы совершенствования сибиреязвенных вакцин
Большинство широко известных сибиреязвенных вакцинных штаммов получены исследователями в конце 30-х и в начале 40-х годов классическими способами аттенуации вирулентных штаммов, включающими многократные и длительные пассажи микроба на питательных средах с селекцией клонов, наследственно утративших капсулу.
Несмотря на несомненные достоинства предложенных в разные годы различными лабораториями мира сибиреязвенных вакцинных штаммов, многие из них нуждаются в улучшении характеристик, связанных с иммуногенностью или реактогенностью. Недостаточная длительность напряженного иммунитета, создаваемого сибиреязвенными вакцинами, требует их неоднократного введения, что зачастую вызывает выраженные побочные реакции у прививаемых.
Перспективы получения новых сибиреязвенных штаммов будут связаны с решением ряда фундаментальных проблем, касающихся исследований структуры, регуляции и экспрессии генов спорообразующих бактерий. К числу сложных и недостаточно изученных следует отнести проблемы генетического картирования эпитопов иммуногенности и особенности регуляции их экспрессии [92, 95, 115].
Несмотря на эффективность существующих сибиреязвенных вакцин, специалисты ищут способы усовершенствования этих профилактических средств. Цель поисков — увеличить длительность иммунитета, повысить уровень продукции протективного антигена, обеспечить менее выраженные общие (например, повышение температуры) и местные реакции, возникающие в ответ на действие летального и отечного факторов. Достичь таких результатов можно методами генетической инженерии, т.е. манипулируя генами плазмиды ШУ (pag, lefu суа). Исследования ведутся в ряде лабораторий мира в нескольких направлениях. Одно из них — конструирование рекомбинантных штаммов, продуцирующих протективный антиген. Для этого ген pag внедряют в геном других микроорганизмов — Bacillus subtilis или В. brevis, часто используемых в биотехнологии бактерий, и те синтезируют защитный антиген, причем больше, чем сама сибиреязвенная бацилла. Судя по результатам экспериментов, иммунизация полученными таким способом рекомбинантными вакцинами защищает морских свинок от заражения вирулентными штаммами В .anthracis [23]. Однако исследователям пока не удалось добиться устойчивого результата, так как чужеродная для этих бацилл ДНК сибиреязвенной бактерии далеко не всегда сохраняет свою устойчивость.
По мнению некоторых исследователей, предпочтительнее конструировать штаммы-продуценты, которые синтезировали бы не полную субъединицу протективного антигена, а только его небольшие гидрофильные фрагменты — эпитопы иммуногенности (участки молекулы, которые взаимодействуют с антителом и обеспечивают клеточный иммунитет). Чтобы создать такие штаммы, в геном бактерии-вектора необходимо вставить лишь ту часть гена pag, которая кодирует эти эпитопы. Но именно она-то и считается наиболее изменчивой у разных вакцинных штаммов В .anthracis.
Некоторые исследователи предлагают повысить иммуногенность сибиреязвенных вакцинных штаммов введением в них дополнительных, чужеродных генетических фрагментов, например гена стафилококкового белка А. Однако экспериментаторы столкнулись с двумя весьма существенными недостатками: подобные варианты вызывают аллергические реакции, а сами штаммы-продуценты генетически нестабильны.
Известно, что химические вакцины обеспечивают защиту не от всех штаммов В. anthracis, а перенесенная инфекция дает стойкий иммунитет, практически против вех штаммов. Исходя из этого, некоторые специалисты предлагают создавать более иммуногенные рекомбинантные вакцины на основе В. subtilis с детерминантами, кодирующими капсульные полипептиды.
Второе направление в совершенствовании вакцин против сибирской язвы предусматривает создание рекомбинантных штаммов, которые вызывали бы длительный иммунитет. Для этого пригодны вакцинные штаммы возбудителей особо опасных инфекций, способные долго сохраняться в организме и тем самым поддерживать стойкий иммунитет. Если в такие штаммы ввести ген протективного антигена, цель будет достигнута. Это перспективное направление позволит создать поливалентные вакцины, т.е. профилактические средства сразу против нескольких особо опасных инфекций. В последние годы удалось внедрить ген pag в разные штаммы лактобацилл, обладающих адъювантными (усиливающими иммунный ответ) свойствами, а значит, появилась возможность создавать вакцины для перорального применения [16].
Третье направление в повышении эффективности сибиреязвенных вакцин основывается на применении новых адъювантных технологий, белковой инженерии и иммуномодуляции. Для этого пригодны вакцинные препараты, лишенные балластных веществ (т.е. всего того, что не имеет отношения к выработке иммунитета). Повышение иммуногенности достигается традиционными путями, без генетической инженерии: за счет укрупнения, полимеризации молекул антигена, закрепления его на минеральном сорбенте (например, гидроксиде алюминия) или синтетическом полимерном. Известно, что сорбенты повышают иммуногенность белковых антигенов в десятки и сотни раз. Иными словами, речь идет об адъювантных, сорбированных препаратах, или, как их иногда называют, полусинтетических вакцинах. Роль протективного антигена в них — вызывать иммунный ответ, функция носителя — усиливать иммунитет. Очень эффективную вакцину создали В. Ivins с коллегами для пероральной профилактики свиней, заразившихся спорами В .anthracis [70]. Она состоит из протективного антигена и адыовантов — сапонина QS-21 и монофосфорилипида А в эмульсии поверхностно-активного вещества твина-80. В экспериментах этот препарат проявил себя много лучше, чем используемые в таких случаях английская или американская вакцины. Надо сказать, что получение протективного антигена в процессе культивирования производящих его бактерий связано с одной неприятностью. Будучи белковой молекулой, антиген разрушается ферментами протеазами, и, следовательно, выработка его бактериями снижается. Этого можно избежать, если модифицировать антиген методами белковой инженерии — удалить из молекулы те участки, по которым его расщепляют протеазы.
Анализ специфичности моноклональных антител к компонентам сибиреязвенного токсина
Можно заметить, что клетки эффективно экспрессируют белки ПА и ЛФ, хотя оба белка обнаруживают небольшую протеолитическую деградацию. ЛФ в нерастворимой фракции обнаружен не был. Количество рекомбинантного ЛФ составило 1 -2 мг с литра культуры, что находится в соответствии с ранее опубликованными данными об уровне экспрессии ЛФ в Е. coli. Очистка ЛФ была проведена на GST-сефарозе, очищенный белок был проанализирован SDS-PAGE и чистота полученного препарата была оценена как 95%. Однако, выход растворимого ПА, полученного с использованием всех экспрессионных конструкций, составил менее чем 100 мкг с литра культуры и оказался недостаточным для эффективной селекции фага. Наши эксперименты показали, что растворимость ПА в Е. coli при коэкспрессии с шаперонами приводит к масштабной деградации белка, даже в случае использования дефектного по протеазам штамма BL21 (DE3). Анализ изменения уровня экспрессии им-муноблотом показал быструю аккумуляцию полноразмерного нерастворимого ПА, который далее медленно растворялся и деградировал. Таким образом, мы ограничили время продукции белка после индукции IPTG до 1.5 часов. Это позволило нам получить хороший выход нерастворимого белка.
Поскольку последние данные показывают, что ПА может быть эффективно рефолдирован в функциональную форму, была использована схема, по которой ПА был экспрессирован в нерастворимой форме. Общая разработанная процедура выделения, рефолдинга и очистки ПА описана ниже.
Продукция ПА проводилась ферментере объемом в 2 л при следующих условиях: оптическая плотность 0,8 (OD58o), индукция 0.5 мМ IPTG, время индукции — 3 часа. Клетки собирали после ферментации центрифугированием, обрабатывали лизоцимом и затем 2% Тритон Х-100 в буфере, содержащем 20 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, 20 mM Na2HP04 и 500 мМ NaCl рН 8 (буфер SE) на соленом льду (-5С). Эта процедура была выбрана предпочтительно к ультразвуковой обработке для предотвращения дополнительного протеолиза ПА, поскольку при ультразвуковой обработке трудно контролировать локальное повышение температуры. В то же время, было обнаружено, что такой мягкий лизис позволяет полностью отделить тельца включения от клеточного дебриса. Такой вариант лизиса особенно полезен при манипуляциях с большим количеством биомассы без всякой опасности перегреть раствор и активировать остаточные протеазы. Этот метод также обеспечивает очень эффективное (в один шаг) удаление большей части ДНК, которая в дальнейшем может помешать процессу очистки. Лизированные клетки были отцентрифугированы при 6000 g с целью удаления клеточного дебриса и большей части нуклеотида, а тельца включения были осаждены из очищенного лизата центрифугированием при 100 000 g. Тельца были отмыты SE буфером, содержащем 2% тритона и 2 М мочевины и растворены в SE буфере, содержащем такое же количество тритона и 6 М гуа-нидин-хлорида (GuCl). Растворенные тельца включения были нанесены на колонку, содержащую сорбент NTA, заряженный ионами Со2+ (Clonetch Talon Su-perflow), промыты несколькими объемами SE буфера при скорости 0.1 мл/мин. Затем белок, нанесенный на колонку, был промыт тем же буфером, но содержащим 6 М мочевины вместо GuCI. Колоночный рефолдинг проводился градиентом концентрации мочевины от 6 до 0 М в SE буфере при малой скорости потока (от 0.05 до 0.1 мл/мин) в течение одного часа. После рефолдинга колонка была промыта 10 объемами SE буфера. Элюция рефолдированного белка проводилась нанесением 500 мМ имидазола в том же буфере. Мы заметили, что элюция однократным нанесением высокой концентрации имидазола (500 мМ) была более эффективна, чем элюция низким рН или градиентом имидазола. Следующим шагом очистки была анионообменная хроматография с использо-ванием DEAE-сефарозы. Рефолдированный белок, снятый с колонки CoiT-NTA, был отдиализован против трис-HCl рН 8.9 в течение 8 часов с двумя сменами раствора. После диализа не было обнаружено белкового осадка, что говорит о высокой эффективности примененной процедуры рефолдинга. Диализованный белок был нанесен на DEAE-сефарозу и элюирован в течение 20 мин градиентом NaCl от 0 до 500 мМ в трис-HCl рН $.9. Белок сошел в виде острого пика при концентрации соли примерно 200 мМ. Электрофоретический анализ обнаружил значительную степень очистки белкового препарата от примесей среднего молекулярного веса, однако низкомолекулярные примеси отделились в меньшей степени. Дальнейшая оптимизация солевого градиента позволила достичь полной очистки ПА с использованием DEAE. Чистота полученного препа 87 рата была оценена как 90%. Рассчитанный выход ПА составил 4-7 мг с литра культуры.
Идентификация доменов летального фактора взаимодействующих с моноклональными антителами
В составе домена IV ПА охарактеризован конформационный эпитоп нейтрализующего антитела 14В7 [79, 96]. Данные, накопленные в ряде исследований, показывают, что рецептор-связывающий домен ПА является наиболее важным для индукции нейтрализующего иммунного ответа [37, 54]. Поскольку ранее было показано, что ПА может подвергаться процессингу, образовывать гептамер и связываться с ЛФ в сыворотке крови, т.е. в отсутствие клеточных рецепторов и клеточной мембраны, нами было высказано предположение, что в процессе образования комплекса (ПА63)7:ЛФ в организме хозяина может происходить быстрое экранирование части эпитопов для антител к ПА. В результате, наиболее эффективная нейтрализация должна достигаться антителами к функционально важным районам ПА, время жизни которых в неэкранированном состоянии достаточно велико. По-видимому, наиболее эффективными с точки зрения нейтрализации токсина являются антитела к рецептор-связывающему домену ПА. С одной стороны, этот домен, вероятно, остаётся экспонированным до взаимодействия с рецептором, а с другой стороны, взаимодействие домена IV с клеточным рецептором является критическим для обеспечения функциональной активности гептамера ПА63.
Домен IV является рецептор-связывающим и проявляет наибольшую протективную активность в экспериментах по иммунизации животных против СЯ [54]. Следует отметить, что моноклон ал ьное ПА-специфическое нейтрализующее антитело 14В7 [96], эпитоп для которого частично охарактеризован на уровне связывания отдельных аминокислотных остатков [79], также связывается с доменом IV ПА.
Получение нейтрализующих антител к домену IV ПА путём случайного отбора из панели моноклон ал ьных антител, индуцированных в рамках эксперимента по маскированию эпитопов, подтверждает сделанные ранее предположения о том, что фрагменты этого домена являются наиболее перспективными кандидатами для разработки эпитопной сибиреязвенной вакцины. Ранее было показано, что иммунизация мышей фрагментами ПА, не содержащими домена IV, не приводит к полной защите от интоксикации, несмотря на высокие титры образующихся специфических антител, В то же время, иммунизация полноразмерным ПА приводит к эффективной индукции протективного ответа. Интересно отметить, что общий титр антител, индуцирующихся в ответ на иммунизацию мышей только доменом IV, относительно невысок по сравнению с титром антител, индуцируемых полноразмерным ПА63 или его фрагментом, не содержащим рецептор-связывающего домена [54]. В связи с этим можно предположить, что уникальный протективный эффект антител к домену IV связан с нейтрализацией действия как токсина, так и потенцирующего эффекта антител, подобных 1F2.
В отличие от антитела 14В7, распознающего конформационный эпитоп ПА [96], антитела 6G7 и 6G8 связываются с линейными антигенными детерминантами, что позволяет точно идентифицировать минимальные сайты связывания этих антител в составе ПА. Идентификация таких пептидных последовательностей позволит создать стандартизованную сибиреязвенную вакцину, индуцирующую высокие титры нейтрализующих антител. Используя, эпитопное картирование было показано, что антигенная детерминанта антител 6G7 и 6G8 находится на участке 635-735 и включает в себя порядка 100 аминокислотных остатков. У уже известного и охарактеризованного ранее 14В 7 антигенная детерминанта составляет 50 аминокислотных остатков и находится в области 671-621. По-видимому рецепторсвязывающий IV домен богат на нейтрализующие антигенные детеминанты.
Необычный эффект усиления действия летального токсина сибирской язвы при взаимодействии с антителами 1F2 и 1D6 заслуживает дальнейшего подробного изучения. Функция домена III ПА в механизме действия сибиреязвенного токсина определена не полностью. Основная функция, приписываемая этому домену - формирование гептамера ПА [37, 73].
Предположительно, этот домен также принимает определённое участие в транслокации эффекторных компонентов токсина, ЛФ и ОФ, в цитоплазму [37]. Известно, что процесс взаимодействия гептамера ПА с мембраной клетки, формирование поры и транслокация эффекторных компонентов токсина сопровождаются значительными конформационными перестройками. Возможно, что потенцирующий эффект антител 1F2 и 1D6 связан с процессами конформационных перестроек и транслокации эффекторных компонентов токсина. Однако истинный механизм потенцирования остаётся неизвестным. Можно предположить, что эффект усиления цитотоксической активности летального токсина в присутствии потенцирующих mAb связан с взаимодействием Fc-фрагмента данных антител с Fc-рецептором на поверхности макрофагоподобной клеточной линии. Это подтверждается нашими экспериментами по блокированию Fc-фрагмента антител белком А, а также экспериментами по блокированию Fc-рецепторов на поверхности клеток-мишеней [106]. Возможно, что посредством взаимодействия Fc-фрагмента антител с Fc-рецептором на поверхности макрофагоподобной клеточной линии может происходить альтернативный путь эндоцитоза летального фактора. Эксперименты с летальным токсином, включающим мутантный ПА, утративший способность к связыванию с ATX- (Anthrax toxin receptor) рецептором макрофагов, подтверждают это предположение. Нетоксичный сам по себе комплекс в присутствии потенцирующих mAb 1F2 и 1D6 начинает проявлять цитотоксические свойства, причем кривые выживаемости клеток демонстрируют четкую зависимость от количества внесенных антител. Был определен минимальный линейный эпитоп, узнаваемый антителом 1F2. Он находится на участке 520-594, дальнейшее обрезание приводило к уменьшению связывания. К настоящему моменту мы не определили более детально антигенные детерминанты для 1D6, но в предварительных экспериментах на конкурентное связывание 1F2 и 1D6 с 3 доменом ПА, установлено, что коэффицент аддитивности равен 35% , что косвенно свидетельствует о близких, но все же различающихся антигенных детерминантах этих антител. Мы думаем, что более детальное картирование для антитела 1D6 поможет прояснить механизм антитело-зависимого усиления токсичности летального токсина СЯ.
