Содержание к диссертации
Введение
Глава І. Молекулярно-биологические подходы для идентификации, дифференциации и изучения генетического разнообразия природных и промышленных штаммов молочнокислых бактерий 18
1.1. Проблемы, возникающие при фенотипической идентификации молочнокислых бактерий 19
1.2. Особенности Г+Ц состава ДНК молочнокислых бактерий. Применение метода ДНК-ДНК-гибридизации для идентификации молочнокислых бактерий 25
1.3. Методы типирования ДНК 29
1.3.1. Методы, основанные на рестрикции ДНК 32
1.3.2. Применение метода геномной рестрикции для идентификации и паспортизации культур молочнокислых бактерий 34
1.3.3. Использование метода ДНК-типирования с помощью ПЦР для идентификации молочнокислых бактерий 37
1.4. Использование данных анализа последовательностей генов 16S рРНК для идентификации молочнокислых бактерий и установления их филогенетического родства 42
1.5. Сравнительная характеристика некоторых молекулярно-генетических методов типирования бактерий 48
Глава II. Частная биология молочнокислых бактерий, исследуемых в работе 51
2.1. Частная биология бактерий вида Streptococcus thermophilus 51
2.1.1. История становления современной классификации грамположительных каталазоотрицательных кокков 51
2.1.2. Фенотипическая характеристика 53
2.1.3. Генотипические особенности 55
2.2. Частная биология молочнокислых лактобацилл 58
2.2.1. Морфологические свойства 58
2.2.2. Культуральные свойства 59
2.2.3. Биохимические свойства 62
2.2.4. Систематика 67
Глава III. Практическая значимость молочнокислых бактерий и производственно-ценные свойства молочнокислых стрептококков и молочнокислых лактобацилл 67
3.1. Использование молочнокислых бактерий в пищевой промышленности в качестве заквасочных культур при производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов. Основные производственно-ценные свойства . 71
3.1.1. Кислотообразование S. thermophilus 73
3.1.2. Активность S. thermophilus по отношению к галактозе 75
3.2. Синтез экзополисахаридов штаммами молочнокислых бактерий 78
3.2.1. Структурно - функциональная характеристика экзополисахаридов молочнокислых бактерий 79
3.2.2. Биосинтез ЭПС 82
3.2.3. Использование ЭПС+ штаммов молочнокислых бактерий в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов 83
Собственные исследования 88
Глава IV. Материалы и методы 88
4.1. Штаммы микроорганизмов 88
4.2. Питательные среды и условия культивирования бактерий 89
4.3. Микробиологические методы исследования 89
4.3.1. Микроскопирование 89
4.3.2. Определение ферментационной активности штаммов 89
4.3.3. Способность бактерий утилизировать сахара 89
4.3.4. Способность бактерий расщеплять эскулин 90
4.3.5. Определение спектра чувствительности к антибактериальным препаратам 90
4.3.6. Кислотообразующая активность штаммов 90 "
4.3.7. Способность штаммов синтезировать экзополисахариды 91
4.3.8. Способность бактерий ферментировать галактозу 92
4.4. Аналитические методы исследования 92
4.4.1. Количественное определение ЭПС 92
4.4.2. Определение содержания водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ 92
4.5. Генетические и молекулярно-биологические методы исследования 93
4.5.1. Выделение тотальной ДНК 93
4.5.2. Получение препаратов плазмидной ДНК 94
4.5.3. Рестрикция плазмидной и геномной ДНК 94
4.5.4. Электрофорез нативной и рестрицированной ДНК 95
4.5.5. Приготовление препаратов для проведения пульс-гель электрофореза геномной ДНК 95
4.5.6. Пульс-гель электрофорез геномной ДНК 95
4.5.7. Анализ рестриктограмм геномной ДНК, полученных методом геномной рестрикции и пульс гель электрофореза (PFGE) 96
4.5.8. Компьютерный анализ подбора праймеров 96
4.5.9. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 97
4.5.10. Выделение и очистка ДНК 97
4.5.11. Секвенирование фрагментов генов 97
4.5.12. Филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК 98
4.5.13. Проведение RAPD-PCR 98
4.5.14. Анализ рестриктограмм геномной ДНК, полученных методом RAPD-PCR, построение филогенетических деревьев и определение генетических дистанций 99
4.5.15. Генотипирование генов вирулентности 99
4.5.16. Генотипирование генов устойчивости к антибиотикам 100
4.5.17. Генотипирование генов репликации и конъюгативного переноса 103
4.5.18. Геномный анализ 103
4.6. Статистическая обработка полученных данных 104
4.7. Программное обеспечение 104
Результаты исследования и их обсуждение 106
Глава V. Применение молекулярно-биологических подходов для видовой идентификации молочнокислых бактерий 106
5.1. Сравнение данных генотипических и биохимических характеристик штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов 106
5.2. Филогенетический анализ типовых штаммов бактерий группы salivarius рода Streptococcus на основании данных о строении генов 16SpPHK 116
5.3. Идентификация подвидов Lactococcus lactis на основании данных о строении генов 16S рРНК 122
5.4. Реклассификация таксономической принадлежности отечественных пробиотических штаммов лактобацилл 129
Глава VI. Изучение генетического разнообразия бактерий рода Enterococcus, выделенных из кисломолочных продуктов 140
6.1. Видообразование у бактерий: сравнение генов 16S рРНК у близкородственных видов энтерококков 149
6.2. Генотипирование молочнокислых энтерококков на возможное присутствие генов вирулентности, свойственных патогенным энтерококкам 154
Глава VII. Изучение генетического разнаобразия и анализ размеров геномов штаммов Streptococcus thermophilus 163
Глава VIII. Изучение генетического разнообразия природных и промышленных штаммов молочнокислых бактерий 163
8.1. Изучение генетического разнообразия природных штаммов бактерий вида Streptococcus thermophilus 163
8.2. Генетическая паспортизация производственных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus 173
Глава IX. Характеристика устойчивости к антибиотикам пробиотических бактерий рода Lactobacillus 187
Глава X. Изучение технологических свойств штаммов молочнокислых бактерий 197
10.1. Технологические свойства штаммов Streptococcus thermophilus, выделенных из кисломолочных продуктов 197
10.2. Изучение технологических характеристик бактерий рода Enterococcus, выделенных из кисломолочных продуктов 208
10.3. Идентификация и отбор антагонистически активных культур Lactococcus lactis subsp. lactis 217
10.4. Разработка заквасок с низкой постокислительной активностью 219
Заключение 224
Выводы 240
Практические рекомендации 242
Список использованной литературы 243
Благодарности 286
- Проблемы, возникающие при фенотипической идентификации молочнокислых бактерий
- Использование молочнокислых бактерий в пищевой промышленности в качестве заквасочных культур при производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов. Основные производственно-ценные свойства
- Видообразование у бактерий: сравнение генов 16S рРНК у близкородственных видов энтерококков
- Разработка заквасок с низкой постокислительной активностью
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время производственные процессы, основанные на жизнедеятельности микроорганизмов, приобрели огромное значение. Современная биотехнология неразрывно связана с использованием новых подходов к созданию и отбору новых микроорганизмов, что влечет за собой увеличение разнообразия биотехнологической продукции. Фундаментальные основы промышленной биотехнологии микроорганизмов, направленные на получение продуктов питания и пробиотических препаратов нового поколения, заложены в трудах российских и зарубежных ученых (Семенихиной В.Ф., 2007; Ганиной В.И., 2005; Рогова И.А., 2006; Шевелевой С.А., 2005; Шендерова Б.А., 2005; Алешкина В.А., 2003; Алешкина А.В., 2010; Амерхановой А.М., 2009; Бондаренко В.М., 2007; Bover-Cid S., 2003; De Vuyst L., 2008; Eerola S., 2006; Klaenhammer T.R., 2008; Leroy F., 2008; Niinivaara F., 2005; Tanous C., 2003; Vandamme E.J., 2004 и др.)
Исследования и фундаментальные достижения последних десятилетий в микробиологии, генетике и молекулярной биологии дали возможность изучения генетического разнообразия бактериальных штаммов. С развитием генетической систематики, с расширением круга используемых методов, направленных на изучение бактериального генома и накоплением экспериментальных данных, касающихся генетического разнообразия различных таксономических групп бактерий, современная таксономия бактерий стала быстро развиваться, что позволило решить многие спорные вопросы систематики конкретных групп микроорганизмов (Турова Т.П., 2009). Вместе с тем оставались нерешенными проблемы, связанные с противоречиями между данными молекулярной систематики и традиционными представлениями, основанными на анализе фенотипа в отношении группы молочнокислых бактерий имеющих практическое применение.
До недавнего времени при отборе штаммов для создания бактериальных заквасок использовались только стандартные микробиологические подходы оценки стартерных культур, такие как выделение, идентификация таксономического положения на основе изучения их морфологических, физиолого-биохимических свойств, определение условий культивирования и их технологических свойств. Однако использование только этих традиционных технологий не всегда позволяет эффективно отбирать безопасные и технологичные штаммы молочнокислых бактерий для использования их в качестве заквасочных культур в производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов. Многими исследователями отмечалось, что у микробиологов возникают трудности при идентификации на видовом и дифференциации на внутривидовом уровне бактерий различных родов факультативных анаэробов. Особенно трудно идентифицировать виды внутри родов: Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Lactobacillus с помощью классических фенотипических методов (Dellaglio F., 1999; , 2003; Stackebrandt E., 2002; Facklam R., 1989; Eaton T.J., 1999; Gasson M.J., 2005; Стоянова Л.Г., 2006, Машенцева Н.Г., 2008). В этой связи особую актуальность приобретает проблема использования современных фундаментальных научных достижений изучения бактериального генетического разнообразия в прикладных областях науки. Фенотипическая характеристика штамма, применяемая для идентификации, паспортизации и типирования штаммов бактерий в настоящее время уже не является достаточной для установления таксономического положения изучаемого организма и целостной характеристики его свойств. Что же касается штаммов молочнокислых бактерий, практически использующихся в пищевой промышленности, использование современных молекулярно-биологических подходов для таксономической идентификации, молекулярно-генетической паспортизации, генотипирования бактерий позволит выбирать лучшие стартовые культуры для промышленного применения и получения качественных и безопасных пищевых продуктов и бактериальных препаратов.
Цель работы - применение комплекса молекулярно-биологических методов для изучения генетического разнообразия штаммов молочнокислых бактерий и использование результатов этого исследования при отборе бактериальных культур для создания заквасок, позволяющих гарантировать производство качественных и безопасных кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.
Задачи исследования
1. Выделить природные штаммы молочнокислых бактерий из естественной среды обитания (молоко, кисломолочные продукты домашнего изготовления, микробиота человека).
2. Показать необходимость использования молекулярно-биологических методов при установлении видовой принадлежности молочнокислых бактерий. Применить метод анализа последовательности гена 16S рРНК для идентификации бактериальных штаммов, принадлежащих к родам Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus.
3. Изучить генетическое разнообразие природных штаммов Streptococcus thermophilus с использованием методов геномной рестрикции и PFGE.
4. Продемонстрировать возможность использования метода анализа данных о последовательности гена 16S рРНК для внутривидовой дифференциации подвидов L. lactis subsp. cremoris и L. lactis subsp. lactis. Применить этот метод для идентификации бактериоцинпродуцирующих штаммов L. lactis.
5. Изучить разрешающую способность метода RAPD-PCR для штаммовой идентификации молочнокислых бактерий и осуществить генетическую паспортизацию природных и промышленных культур бактерий Streptococcus и Lactobacillus с использованием этого метода.
6. Продемонстрировать необходимость проведения исследований с использованием молекулярно-биологических подходов для изучения антибиотикорезистентности производственных штаммов молочнокислых бактерий. Применить метод ПЦР-генотипирования штаммов лактобацилл на наличие генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса.
7. Протестировать штаммы Streptococcus thermophilus на наличие технологичных и пробиотических свойств (способность синтезировать экзополисахариды, витамин и утилизировать галактозу) и отобрать среди них наиболее перспективные культуры для использования в качестве заквасок и бактериальных концентратов при производстве кисломолочных продуктов общего и функционального назначения.
Научная новизна работы
Впервые проведено выделение и изучение новых штаммов молочнокислых бактерий из различных экологических ниш (молоко, кисломолочные продукты домашнего изготовления, микробиота человека: гастроинтестинальный тракт, ротовая полость и грудное молоко кормящих женщин) и разных географических регионов (Россия, страны Восточной и Западной Европы), на основании этого получены новые фундаментальные знания о физиолого-биохимических и генетических особенностях штаммов бактерий родов Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus.
Получены новые фундаментальные знания о внутривидовом разнообразии природных изолятов молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus. При использовании методов геномной рестрикции и пульс-гель электрофореза (PFGE) и сравнительного анализа подобия геномных фингерпринтов продемонстрированы доказательства вариабельности изученных штаммов по размерам их геномов. Показано, что размер геномов у исследованных штаммов сильно варьирует – от 1417 до 2075 т.п.н., т.е. различия между минимальным и максимальным значением размера генома составляет около 600 т.п.н., что свидетельствует о внутривидовом генетическом полиморфизме бактерий данного вида.
Впервые выявлено генетическое разнообразие изученных в работе штаммов бактерий рода Enterococcus, что послужило основой классифицировать организмы, имеющие существенное отличие в нуклеотидных последовательностях генов rrs, как новый вид - Enterococcus lactis (нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК типового штамма нового вида Enterococcus lactis СК1114 депонирована в базе данных NCBI (номер депонированной последовательности AY902459). Штамм депонирован в коллекции ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов (номер депонированного штамма В8713).
Впервые продемонстрировано существование уникальных замен в проксимальной области гена 16S рРНК у штаммов подвида Lactococcus lactis subsp. cremoris, дающее возможность проводить точную молекулярную таксономическую идентификацию культур L. lactis subsp. cremoris и L. lactis subsp. lactis, трудно дифференцируемых с использованием классических микробиологических подходов.
Теоретическая значимость работы
Теоретически обоснована необходимость использования молекулярно-биологических подходов для отбора бактериальных стартерных культур при создании заквасок для биотехнологии, позволяющих гарантировать выпуск качественных и безопасных кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.
Полученные новые данные о таксономическом, генетическом разнообразии и биохимических, технологических, пробиотических и генетических свойствах штаммов бактерий родов Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus расширяют границы фундаментальных знаний о бактериях этих систематических групп и возможностях их использования в различных биотехнологических процессах.
Практическое значение работы
Изучение генетического разнообразия природных штаммов бактерий родов Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Enterococcus, дало возможность целенаправленно проводить отбор штаммов, перспективных для использования в биотехнологии, учитывая их генетические характеристики.
Проведена реклассификация (с применением методов молекулярно-генетической идентификации) некоторых производственных культур рода Lactobacillus, применяемых в промышленности РФ в качестве заквасок при изготовлении кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов, что позволяет производителям использовать современные данные об истинном таксономическом положении культур и их генетических характеристиках.
Показана необходимость проведения исследований с помощью молекулярно-биологических подходов для изучения антибиотикорезистентности производственных штаммов молочнокислых бактерий. Примененное ПЦР-генотипирование штаммов лактобацилл на наличие генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам и генов репликации и конъюгативного переноса, служит основанием исключения из состава заквасок культур, которые могут быть источником трансмиссивных генов антибиотикорезистентности в микробиоте человека.
Проведенная паспортизация промышленно-ценных штаммов с помощью методики RAPD-PCR и неспецифических праймеров дает возможность защиты правообладателей бактериальных культур от несанкционированного использования штаммов, авторами которых они являются, в аналогичных биотехнологических процессах недобросовестными производителями.
Полученные данные о наличии технологических, производственно - ценных и пробиотических свойств у штаммов Streptococcus thermophilus (способность синтезировать экзополисахариды, витамин и утилизировать галактозу), могут быть критерием отбора наиболее перспективных культур для применения в качестве заквасок и бактериальных концентратов при изготовления кисломолочных продуктов общего и функционального назначения в ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии. Штаммы термофильного молочнокислого стрептококка депонированы в коллекцию молочнокислых культур и бифидобактерий ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.
Определенные в ходе проведения работы нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК некоторых из изучаемых штаммов лактококков, лактобацилл, стрептококков и энтерококков были депонированы в базу данных Nucleotide Sequence Database of (GenBank NCBI) в качестве референтных последовательностей при проведении филогенетических и биоинформатических исследовательских работ (www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/?term=Botina). Номера депонированных последовательностей: , , , AY902456, AY902457, AY902458, AY902459, AY902460, AY902461, AY683829, AY683830, AY683831, AY683832, AY683833, AY683834, AY683835, AY683836, DQ255948, DQ255951, DQ255952, DQ255953, DQ255954, , , , , , , , , , DQ255951, DQ255952, DQ255953, DQ255954, , , , , , , , , , GU560031, GU560032, GU560033, GU560034, GU560035, GU560036, GU560037, GU560038, GU560039, GU560040, GU560041, GU560042, GU560043.
Внедрение результатов работы
Полученные данные о технологических и производственно-ценных свойствах культур термофильных молочнокислых стрептококков послужили основой для оформления патента на изобретение №2337953, Российская Федерация, МПК C12N1/20, A23C9/12, заявка 2007117139/13 от 08.05.2007, публикация патента 11.10.2008 г., бюллетень № 31. «Штамм бактерий Streptococcus thermophilus для сквашивания молока в процессе приготовления кисломолочных продуктов, включая йогурты».
На основании теоретических и практических результатов были разработаны «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов». Рекомендованы Государственной Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, протокол № 2 от 14.10.2010. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 декабря 2010.
Современные молекулярно-биологические методики, разработанные в ходе исследования, используются при проведении научных исследований в ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.
Основные результаты работы нашли применение в лекционных курсах по повышению квалификации для практикующих микробиологов молочного производства «Микробиология молока и молочных продуктов», «Методы и организация производственного контроля» и в обучающем процессе при подготовке аспирантов ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии.
Основные положения, выносимые на защиту
1. При таксономической идентификации штаммов молочнокислых бактерий, принадлежащих к родам Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus и Enterococcus следует опираться на результаты исследований, полученных с помощью применения молекулярно-биологических методов, основанных на анализе последовательности рибосомальных генов.
2. Применение методов геномной рестрикции и PFGE, а так же метода RAPD-PCR дает возможность оценить генетическое разнообразие природных штаммов молочнокислых бактерий и позволяет осуществлять генетическую паспортизацию промышленных штаммов молочнокислых бактерий.
3. Необходимо использовать молекулярно-биологические подходы для изучения устойчивости к антибиотикам производственных штаммов молочнокислых бактерий с целью исключения из состава заквасок культур, которые могут служить источником генов трансмиссивной антибиотикорезистентности в микробиоте человека.
4. Применение в лабораторной практике молекулярно-биологических подходов при видовой идентификации, молекулярно-генетической паспортизации и определения в составе геномов генов, отвечающих за антибиотикорезистентность, позволяет проводить отбор безопасных производственных культур с целью их последующего использования в составе заквасок при производстве кисломолочных продуктов питания и пробиотических препаратов.
Апробация работы
Диссертация апробирована на расширенном заседании Ученого Совета ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности Россельхозакадемии 24 ноября 2010 г., протокол № 8.
Основные результаты работы доложены на Международных и Российских научных конференциях: Вторая Международная Научно-Практическая конференция «Перспективы развития биотехнологий в России» (2005, Пущино), 10-ая школа-конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), Международная научная конференция: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2006), ASM Conference on Streptococcal Genetics, (France, Sain-Malo 2006), Международная конференция «Успехи биотехнологии» (г. Цахкадзор, Республика Армения, 2006), Международная конференция «Микробные биотехнологии» (Одесса, 2006), Российская школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвящённая 100-летию со дня рождения С.И.Алиханяна (Москва-Пущино, 2006), Международный конгресс по пробиотикам (Санкт-Петербург, 2007), The 3th European Conference on Prokaryotic Genomics, ProkaGENOMICS (2007, Gottingen), Second International Congress of Central Asia Infectious Diseases (Alma Aty, 2008), Пятый съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), 13-ая международная Пущинская школа конференция молодых ученых «Биология-наука 21 века» (Пущино, 2009), Юбилейный Пятый Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009), 11-й международный славяно-балтийский научный форум "Санкт-Петербург – Гастро-2009" (Санкт Петербург, 2009), XXXII International Congress of the Society for Microbial Ecology and Disease (2009, St. Petersburg, Russia), Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», (Ростов на Дону, 2009), Конференция РАСХН-РФФИ. Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России. (Сергиев Посад, 2009), Второй Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по Биотехнологии, Биоэнергетике и Биоэкономике (Москва, 2010).
Исследования, вошедшие в основу работы, были поддержаны грантами РФФИ, Грантами Президента Российской Федерации для молодых российский ученых кандидатов наук.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 61 научная работа, из них 29 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 30 - в материалах научных конференций, 1 патент на изобретение, 1 методические указания.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 280 страницах машинописного текста, включает 22 таблицы, 21 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы включающего 43 отечественных и 323 зарубежных цитируемых источников.
Проблемы, возникающие при фенотипической идентификации молочнокислых бактерий
Идентификация микроорганизмов, проводимая в микробиологических лабораториях, до последнего времени опиралась почти исключительно на традиционные тесты, основанные на изучении фенотипических и биохимических характеристик штаммов бактерий. Они составляют основу для формального описания таксонов от семейства и рода до вида и подвида. Классические фенотипические характеристики бактерий охватывают морфологические, физиологические и биохимические признаки [151]. Морфология бактерии включает как клеточную морфологию (форма клетки, наличие эндоспор, жгутиков, органелл, включений, характер окраски по Граму), так и морфологию колоний (цвет, размеры, форма, консистенция). Физиологические и биохимические признаки включают сведения о росте при различных температурах инкубации, значениях рН, концентрациях солей, атмосферных или других условиях, росте в присутствии различных соединений, включая антимикробные вещества, сведения о наличии и активности разнообразных ферментов, утилизации органических соединений. Проведение классических фенотипических анализов молочнокислых бактерий можно с успехом заменить коммерческими тест-системами, состоящими из большого набора дегидрированных реагентов, внесенных в стерильные планшеты. Добавление инокулята инициирует реакцию (рост, ферментативную активность и т. д.). Результаты интерпретируются как визуально, так и спектрофотометрически и с использованием компьютерного программного обеспечения. Следует подчеркнуть, что все фенотипические тесты должны проводиться в стандартных условиях для получения воспроизводимых результатов в различных лабораториях. Несмотря на то, что многие из фенотипических признаков не всегда коррелируют с результатами экспериментов по гибридизации и секвенированию ДНК, в целом они дают ценную информацию, позволяющую разграничить отдельные таксоны.
Молочнокислые бактерии, выделенные из различных источников, в том числе и из высококачественных пищевых продуктов, микрофлора которых сформирована естественным путем, чаще всего относятся к следующим родам молочнокислых бактерий: Lactobacillus, Lactococcus, Micrococcus, Pediococcus, Streptococcus и Enterococcus. Многими исследователями отмечалось что у микробиологов возникают трудности при идентификации различных родов каталазо-негативных факультативных анаэробов. Особенно трудно идентифицировать виды внутри родов: Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Lactobacillus с помощью классических фенотипических методов [122].
Термофильные кокки, выделяемые из различных природных источников и кисломолочных продуктов в большинстве случаев представляют собой штаммы бактерий, относящиеся к родам Streptococcus и Enterococcus. Термофильные молочнокислые бактерии вида Streptococcus thermophilus являются немногочисленными представителями «полезных» бактерий этого рода с точки зрения их практического применения. Большинство же бактерий рода Streptococcus являются патогенными. Они являются возбудителями инфекционных болезней животных (мыт лошадей, мастит крупного рогатого скота) и человека (скарлатина, ангина), а также смешанных инфекций (абсцесс, нефрит, полиартрит, сепсис). Так, бактерии Streptococcus agalactiae могут вызывать сепсис и менингит у новорожденных, Streptococcus mutans вызывает кариес, Streptococcus gordonii также вызывает заболевания ротовой полости, Streptococcus pyogenes, является патогенным для человека, инфицируя кожные покровы.
В классификации бактерий рода Streptococcus первоначально использовались иммунологические тесты, а также ряд физиологических и биохимических признаков. Подобная частная таксономическая система оказалась удобной для идентификации и особенно диагностики многочисленных видов стрептококков. Вместе с тем, по мнению многих исследователей уже давно эта система в значительной степени признавалась искусственной [182, 71]. Действительно, применение более совершенных методов, таких как определение уровня ДНК-ДНК гибридизации и изучение нуклеотидных последовательностей в генах 16S рРНК, позволило реклассифицировать род Streptococcus в три независимых подразделения: Streptococcus sensu stricto, Lactococcus и Enterococcus, a также вывести за границы этих таксонов анаэробные стрептококки [220, 294].
В классификации истинных стрептококков также сохранились определенные проблемы. В частности таксономический статус видов Streptococcus salivarius и S. thermophilus до последнего времени не был строго определен. Исходное выделение этих бактерий в отдельные виды долгое время не вызывало сомнений. Спорная ситуация возникла после опубликования результатов сравнительного изучения методом ДНК-ДНК-гибридизации нескольких штаммов S. salivarius и S. thermophilus [263]. В работах этих авторов было обнаружено достаточно высокое геномное сходство ДНК, превышающее 80%, что, как известно, характерно для штаммов одного вида. Более того, основываясь на родстве определенных штаммов S. salivarius и S. thermophilus и на сходстве в составе жирных кислот бактерий обоих видов, Фарроу и Коллинс предложили реклассифицировать вид S. thermophilus как S. salivarius ssp. thermophilus [126]. Последующие исследования генетических взаимоотношений этих видов выявили более умеренные уровни гибридизации ДНК, находящиеся в пределах 60% и ниже, т.е. не превышающие рамки видового таксона [352, 25]. В частности, авторы последней работы, при сравнении штаммов S. salivarius АТСС7073 и S. thermophilus АТСС19258 с использованием различных методик ДНК-ДНК-гибридизации показали, что значения гибридизации ДНК штаммов этих видов находятся на уровне 45-48%. С 1995 года изменение статуса обоих видов было зафиксировано в «Списке одобренных названий бактерий». Однако в современной литературе используются оба синонима названия (S. thermophilics и S. salivarius ssp. thermophilus) этого вида [135].
Бактерии рода Enterococcus также подразделяют на несколько групп, среди которых имеются патогенные (клинические изоляты) Enterococcus faecium, Е. durans и Е. faecalis и непатогенные «пищевые» энтерококки этих же видов, использующиеся в качестве стартовых культур [117].
Что касается видов Streptococcus faecium и S. faecalis, они реклассифицированы в Enterococcus faecium и Е. faecalis в 1984 году [295]. Вид Streptococcus durans, впервые описанный в 1937 году [229], переклассифицирован в Enterococcus durans также в 1984 [90]. Однако прежние родовые названия этих бактерий как синонимы используются до сих пор. Более подробно таксономия и особенности генетики молочнокислых термофильных кокков обсуждаются в следующей главе обзора.
Бактерии видов Streptococcus thermophilus и Enterococcus durans, Е. faecium, Е. faecalis трудноотличимы при идентификации их именно с использованием фенотипических методов, поскольку они обладают сходными фенотипическими характеристиками. Нередки также штаммы, обладающие свойствами, общими с энтерококками и стрептококками, что сильно затрудняет их дифференциацию. Такие штаммы, недостаточно идентифицированные и обладающие рядом морфологических и биохимических признаков, сходных с энтерококками, в отечественной литературе называют «нетипичными» штаммами Streptococcus thermophilus [34].
Клетки термофильных молочнокислых кокков обычно характеризуются сферической или овальной формой, иногда вытянутые. Они делятся в одной плоскости и располагаются парами, короткими или длинными цепочками в зависимости от условий роста и вида микроорганизма. Эти бактерии грамположительны, являющиеся факультативными анаэробами, требовательны к источникам питания, они характеризуются отсутствием подвижности, спорообразования, цитохромов, каталазы, способности восстанавливать нитраты в нитриты, способны сбраживать углеводы с образованием молочной кислоты. Термофильные молочнокислые стрептококки отличаются от других молочнокислых бактерий способностью к росту при повышенных температурах в интервале 45-50 С.
При дифференциации бактерий близкородственных родов Streptococcus и Enterococciis определяют минимальную и максимальную температуры роста, рост после 30 минут выдерживания при 60С, способность к росту на среде с желчью, на среде с различным содержанием NaCl, на агаризованной среде с кровью, способность сбраживать сахара и эскулин, характеристики сквашивания молока. Следует отметить, что молочнокислые бактерии рода Enterococciis более устойчивы к воздействию окружающей среды. Они способны расти при более высокой температуре инкубации, чем бактерии рода Streptococcus, более устойчивы к антибиотикам в среде и способны сбраживать большее число Сахаров. Так, показано, что характерным отличительным признаком молочнокислых бактерий рода Enterococciis может являться их способность к расщеплению эскулина и росту в среде с содержанием NaCl до 6%, что отличает их от молочнокислых стрептококков [1]. Этими же авторами показана возможность дифференциации близкородственных видов энтерококков Е. durans и Е. faecium на основании способности последних к сбраживанию маннита и росту при содержании NaCl в среде до 7 %.
Использование молочнокислых бактерий в пищевой промышленности в качестве заквасочных культур при производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов. Основные производственно-ценные свойства
Из бактерий ранее классифицированных в род Streptococcus, единственным видом, применяемым в качестве стартовых культур при производстве кисломолочных продуктов в РФ, является S. thermophilic. Термофильные стартовые культуры отличаются от мезофильных способностью к росту при повышенных температурах (40-52С в отличие от 30-27С для мезофильных). При отборе штаммов по единственному признаку - росту при температуре 45С — отбирается группа, куда входят представители разных родов и видов. Среди молочнокислых бактерий рост при температуре 45С характерен для бактерий четырех родов: Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus и Enterococcus [294, 364].
Среди термофильных, сквашивающих молоко бактерий следует отметить виды Enterococcus faecalis и Е. faecium, ранее относимые к тому же роду Streptococcus [326]. Представителей данных видов бактерий часто можно выделить из кисломолочных продуктов и ферментированных сыров. По биохимическим свойствам Е. faecalis и Е. faecium очень похожи на представителей вида S. thermophilic, но их отличает большая выносливость к повышенной концентрации NaCl в среде, большая ферментативная активность в отношении Сахаров и более широкой диапазон температур, не препятствующие их росту. Казалось бы, что нет ничего страшного, если вместо заявленных термофильных стрептококков в продукт попадет один из названных видов энтерококков. Но представители рода Enterococcus не входят в состав GRAS (generally recognized as safe), то есть разрешенным к использованию безопасным компонентам. К тому же энтерококки способны образовывать нежелательные соединения - прессорные амины, что может неблагоприятно сказаться на здоровье потребителя. Поэтому важно четко идентифицировать штаммы бактерий, используемые для приготовления заквасок.
Важно учитывать степень и скорость кислотообразования стартовых микроорганизмов, так как это оказывает непосредственное влияние на вкус продукта, его физические качества, скорость получения готового продукта, его сохранность и взаимодействие с другими компонентами закваски. рН продукта (особенно сыра) на прямую связан с содержанием в нем и формой кальция. Более медленное образование кислоты снижает скорость перехода одной формы казеина, находящегося в комплексе с двумя атомами кальция, в другую форму, образующую комплекс с одним атомом кальция (dicalcium para-casein в monocalcium para-casein), что приводит к снижению тягучести конечного продукта. Если рН курда (молочного сгустка) продолжает падать до значений 5,1-5,3, теряется больше кальция, сгусток становится менее жирным и менее тягучим.
В зависимости от того, какой кисломолочный продукт требуется получить в результате ферментативного процесса, соответственно подбирают закваску, которая может включать в себя штаммы одного вида, например, S. thermophilus, но обладающие различным набором или степенью выраженности производственно-ценных качеств. Так, например, для получения варенца и ряженки применяют закваску, состоящую из чистой культуры S. thermophilus, для получения простокваши таюке часто используют монокультуру термофильного стрептококка. В то же время простокваша, полученная при внесении смешанной культуры — термофильного стрептококка и лактококков, также не является отступлением от разрешенной методики. При внесении в молоко смешанной закваски из S. thermophilus и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, так называемой «болгарской палочки» и соблюдении определенного режима ферментации получают мечниковскую простоквашу либо йогурт. Кроме того, термофильные стрептококки используются вместе с представителями лактококков, лактобацилл и дрожжей в составе заквасок при производстве таких продуктов, как айран, кварк, сметана и творог.
Детальное изучение термофильных молочнокислых бактерий, не используемых пока в производстве, дает возможность выбирать наиболее перспективные, отвечающие требованиям производителей, штаммы.
S. thermophihis являются не только объектом фундаментальных исследований, но и изучаются с точки зрения их ценности при использовании в различных биотехнологических процессах. В связи с этим, все большее число работ, посвященных изучению молочнокислых бактерий, начиная с 80-х годов прошлого века, в России и за рубежом стали носить прикладной характер. Важное промышленное значение молочнокислых бактерий при производстве различных кисломолочных продуктов, а также при ферментации мяса и овощей инициировало широкий спектр исследований по генетике, биохимии и биофизике этой группы микроорганизмов. Особый интерес к изучению молочнокислых бактерий появился после обнаружения у них важных технологических свойств, к которым относятся метаболизм лактозы, ферментация цитрата, уреазная активность, протеолитическая активность, секреция бактериоцинов, ароматообразование, выделение экзополисахаридов и другие.
Видообразование у бактерий: сравнение генов 16S рРНК у близкородственных видов энтерококков
В наших предшествующих исследованиях [1,2] было показано, что многие отечественные штаммы термофильных молочнокислых бактерий, используемые в составе заквасок и рассматривавшиеся ранее как термофильные стрептококки {Streptococcus thermophilus), на самом деле относятся к энтерококкам - Enterococcus durans и Е. faecium или к близким к ним видам. Этот вывод был сделан на основании ПЦР-тестов на присутствие видоспецифических генов, а также по результатам секвенирования генов 16S рибосомальных РНК. Естественной средой обитания многих видов энтерококков служит желудочно-кишечный тракт человека и животных. Устойчивость энтерококков к высокой температуре, а также к действию антибиотиков и разнообразных вредных факторов внешней среды (например, низких значений рН, высоких концентраций солей и т.п.) позволяет им колонизировать различные ниши и нередко служить причиной микробного заражения молочных и мясных продуктов [143].
Определенные штаммы энтерококков также широко используются в составе заквасок при изготовлении сыров [146]. Авторы работы [117], исследовавшие факторы вирулентности у Е. faecalis, Е. faecium и Е. durans, проводят разграничение между следующими типами штаммов у энтерококков: 1 — штаммы, использующиеся в качестве заквасок, 2 -штаммы, выделяемые из молочных и мясных продуктов, 3 - клинические изоляты. Как уже упоминалось, штаммы последнего типа в основном относились к виду Е. faecalis и лишь небольшое их число — к Е. faecium. Штаммы первого типа, как правило, не содержали либо содержали очень мало генов, ответственных за вирулентность, тогда как клинические изоляты обычно несли более полные наборы таких генов. Так, штаммы Е. faecium не содержали генов cylMBA и agg, ответственных за активацию цитолизина [140] и прикрепление бактерий к поверхности клеток эукариот [136], соответственно. У большинства штаммов этого вида также не обнаруживался ген gelE, ответственный за синтез токсина — внеклеточной металлоэндопептидазы [310]. Но этот ген присутствовал в одном из клинических изолятов Е. faecium [117].
В отличие от Е. faecium и Е. durans штаммы Е. faecalis, в том числе используемые в качестве заквасок, как правило, несли более многочисленные (от 6 до 11) детерминанты вирулентности, включая упомянутые выше cylMBA, agg и gelE [117]. В настоящей работе мы выясняли, присутствуют ли эти гены в штаммах энтерококков, используемых в качестве заквасок на территории СНГ. Среди этих штаммов в основном были обнаружены геномоварианты близкие к Е. durans, тогда как штаммов близких к Е. faecalis не было обнаружено. Полученный нами результат подтверждает вывод об отсутствии многих генов патогенности у штаммов Е. durans и Е. faecium, используемых в качестве заквасок.
Проблемы, возникающие в связи с использованием энтерококков в качестве заквасок возникают главным образом из-за того, что они могут сравнительно легко образовать патогенные для человека и животных варианты в результате горизонтального переноса генов, определяющих вирулентность этих бактерий [117]. К счастью, среди молочнокислых энтерококков, используемых в качестве заквасок на территории СНГ (в рамках нашей коллекции), не были обнаружены штаммы относящиеся к виду Е. faecalis, так как у этого вида патогенные штаммы встречаются особенно часто. Результаты типирования наличия генов патогенности приведены на рисунке 13.
Гены вирулентности, определяющие патогенность штаммов, обычно находятся на плазмидах. Поэтому может вызвать некоторое беспокойство тот факт, что большинство исследованных нами ранее штаммов из геномоваров I-VI содержат крупную плазмиду около 120 т.п.н. [1]. В связи с этими данными и было предпринято настоящее исследование, имевшее целью проверить, не содержат ли бактерии какого-либо из 6-ти выявленных нами ранее геномовариантов известных для энтерококков генов вирулентности. Для этого мы воспользовались опубликованными в работе [117] последовательностями праймеров, позволяющих выявить с помощью ПЦР гены agg, cylA и gelE, обычно присутствующие в клинических изолятах энтерококков, а также в штаммах Е. faecalis.
Согласно полученным нами данным, указанные гены действительно присутствовали в контрольном штамме Е. faecalis, но они не обнаруживались ни в одном из изучаемых штаммов (см. рисунок 13).
Отсутствие генов вирулентности agg, cylA и gelE у всех исследованных нами штаммов, представляющих различные таксоны энтерококков может свидетельствовать о широкой дивергенции энтерококков как бактерий, освоивших молоко в качестве экологической ниши - вне зависимости от их эволюции как патогенов. Однако следует также отметить, что использование энтерококков в качестве заквасок неизбежно сопряжено с риском образования патогенных производных этих бактерий в результате горизонтального переноса генов вирулентности.
Разработка заквасок с низкой постокислительной активностью
Кисломолочные продукты в силу специфических свойств и направленного воздействия на организм человека приобретают все большую популярность во всем мире. В основе производства кисломолочных продуктов лежат микробиологические процессы. Следовательно, качество кисломолочных продуктов зависит от качества заквасок, используемых для их производства, что в свою очередь определяется свойствами микроорганизмов, входящих в их состав. В настоящее время в связи с тем, что кисломолочные продукты имеют длительные сроки хранения очень важно, чтобы в процессе хранения сохранялись исходные свойства продукта.
Было установлено, что в процессе хранения кисломолочных продуктов при 4-6С отмечается увеличение титруемой кислотности и снижение вязкости продукта.
Поэтому в настоящее время фирмы, производящие закваски для кисломолочных продуктов ведут селекцию штаммов по кислотообразующей, постокисляющей активности и способности образовывать вязкие сгустки.
При определении кислотообразующей активности термофильных молочнокислых стрептококков было установлено, что предел кислотообразования для исследованных штаммов при термостатировании 24 ч при 42 С составлял рН 4,13-4,29, при термостатировании при 37 С — 4,15-4,28.
Нами были отобраны 13 штаммов термофильных молочнокислых стрептококков и 8 штаммов болгарской молочнокислой палочки, образующих сгустки различной вязкости. Сквашивание стерильного обезжиренного молока проводили 1% закваски и образцы выдерживали при 42 С. Результаты исследований приведены в таблице 22.
В качестве контроля использовали штамм термофильного молочнокислого стрептококка, представленный фирмой «Даниско», как штамм, обладающий низкой постокислительной способностью.
Из приведенных данных видно, что после сквашивания исследованными штаммами рН составлял 4,93-5,48. Через 24 ч. хранения изменения рН были незначительными и составляли 4,42-5,28
Через 28 суток хранения изменения были более значимыми - рН колебался в пределах 4,26 - 5,07. Для контрольного штамма рН составлял 4,57. Вязкость, как правило, в процессе хранения снижалась.
Как видно из таблицы близкими свойствами по- энергии кислотообразования к контрольному штамму обладали штаммы lt4, Р2о, 17t, 132, 18ч, 3t, t31.
Результаты исследований с использованием штаммов молочнокислой болгарской палочки приведены в таблице 23.
Как видно из таблицы,23 после сквашивания молока рН для разных штаммов колебался в пределах 4,36-5,49. В процессе хранения происходило значительное снижение рН, и через 28 дней хранения рН снижался до 3,5-3,77. Вязкость изменялась незначительно.
Из отобранных штаммов термофильных молочнокислых стрептококков и болгарских палочек были составлены 10 заквасок. Закваски составлялись в трех вариантах:
- оба штамма (термофильный молочнокислый стрептококк и болгарская палочка) образовывали вязкий сгусток;
- штамм термофильного молочнокислого стрептококка, образующий вязкий сгусток и штамм болгарской молочнокислой палочки, образующий невязкий сгусток;
- штамм термофильного молочнокислого стрептококка, образующий невязкий сгусток и штамм болгарской молочнокислой палочки, образующий вязкий сгусток.
Комбинация штаммов составлялась следующим образом - 95% термофильного молочнокислого стрептококка и 5% болгарской молочнокислой палочки.
Результаты исследований приведены в таблицах 24-26.3акваски, составленные из штаммов термофильного молочнокислого стрептококка и болгарской палочки, образующих вязкий сгусток, образовывали вязкий сгусток и после сквашивания. В процессе хранения в течение 28 дней вязкость сгустка несколько снижалась, однако оставалась на достаточно высоком уровне. рН после сквашивания составлял 4,71-4,91; рН после хранения через 14 суток - 4,45-4,7; через 28 суток - 4,32-4,5.
Закваски, составленные из штаммов болгарской молочнокислой палочки, образующих вязкий сгусток и термофильного молочнокислого стрептококка, образующего невязкий сгусток, после сквашивания образовывали не вязкий сгусток, который не изменялся в процессе хранения в течение 28 суток. рН после сквашивания составлял 4,7-5,1; после хранения через 14 суток 4,5-4,76; через 28 суток 4,3-4,57.
Закваски, составленные из штаммов термофильного молочнокислого стрептококка, образующего вязкий сгусток, и штаммов болгарской палочки, образующих невязкий сгусток, образовывали вязкий сгусток, вязкость в процессе хранения несколько снижалась, однако оставалась на довольно высоком уровне. рН после сквашивания составлял 4,86-5,03; после хранения через 14 суток 4,52-4,60; через 28 суток 4,47-4,50.
