Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Систематика и таксономия Brassicaceae (Cruciferae) 8
1.2. Геномы видов Brassica 13
1.3. Молекулярные инструменты для выявления полиморфизма, различения и идентификации геномов Brassica 26
1.4. Патенты, основанные на использовании ДНК маркеров Brassica и методах получения растений, устойчивых к заболеваниям 43
1.5. Заключение: постановка задач диссертационной работы и выбор экспериментальных подходов 45
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 48
2.1. Растительный материал 48
2.2. Методы исследования 49
2.2.1. Выделение геномной ДНК из тканей растений 49
2.2.2. Амплификация фрагментов геномной ДНК и рестрикция 51
2.2.3. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК 52
2.2.4. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК 53
2.2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 55
2.2.6. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 56
2.2.7. Хромосомная локализация и генетическое картирование 57
2.2.8. Дот-гибридизация 58
2.2.9. Номенклатура маркеров, генов, хромосом и групп сцепления...58
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 60
3.1. Анализ полиморфизма геномов Brassica 60
3.1.1. Повторяющиеся последовательности PawS 60
3.1.2. Микросателлитные маркеры 61
3.1.3. RAPD маркеры 62
3.1.4. Последовательности генов 63
3.2. Создание SCAR маркеров геномов А-С 70
3.2.1. Создание геном-специфичных SCAR маркеров 70
3.2.2. Верификация SCAR маркеров 71
3.2.3. Хромосомная локализация и генетическое картирование SCAR маркеров 75
3.3. Изучение филогенетических взаимоотношений видов трибы Brassiceae 83
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ 84
4.1. SCAR маркеры генома В 84
4.1.1. Универсальный SCAR маркер генома В 84
4.1.2. Хромосом-специфичные SCAR маркеры генома В 85
4.2. SCAR маркеры геномов А и С 90
4.3. Верификация SCAR маркеров 94
4.4. Использование геном-специфичных маркеров для решения селекционно-генетических задач 95
4.4.1. Изучение филогенетических взаимоотношений видов трибы Brassiceae 95
4.4.2. Идентификация образцов Brassica в генетических коллекциях 98
4.4.3. Номенклатура хромосом и групп сцепления генома В 100
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 102
ВЫВОДЫ 106
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 107
ПРИЛОЖЕНИЯ 127
- Систематика и таксономия Brassicaceae (Cruciferae)
- Выделение геномной ДНК из тканей растений
- Последовательности генов
Введение к работе
Актуальность проблемы. ДНК маркеры, основанные на методе полимеразной цепной реакции (ПЦР), просты в использовании, экономически эффективны и дают быстрые результаты по сравнению с маркерами, основанными на методах гибридизации (например, RFLP). Однако, в силу высокой стоимости анализов, большинство созданных к настоящему времени ПЦР маркеров (AFLP, SSR), трудно использовать для массового обследования селекционного материала (например, анализа расщепляющихся популяций). Для селекционеров особенно удобны SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) маркеры: в отличие от ПЦР методов, генерирующих многочисленные фрагменты ДНК, SCAR маркеры дают однозначно интерпретируемые результаты (единственный фрагмент ДНК или его отсутствие).
Многочисленные виды семейства Brassicaceae включают широко распространенные овощные, масличные, кормовые и технические культуры, в том числе капусту {Brassica oleracea L.) во всем многообразии ее подвидов и разновидностей, листовые овощи (главным образом, В. rapa L.) и масличный рапс {В. napus L.); значение последней культуры быстро возрастает в связи с производством биотоплива. В соответствии с моделью треугольника U (U, 1935), тетраплоидные виды {B.juncea, геномы ААВВ; В. carinata, ВВСС; В. napus, ААСС) возникли в результате природной гибридизации исходных диплоидных видов Brassica {В. гора, АА; В. nigra, ВВ; В. oleracea, СС). Все эти виды Brassica предположительно произошли от одного общего предка, однако многие исследователи считают, что виды, содержащие геномы А и С, выделились из одной линии Brassica, а виды, содержащие геном В, - из другой (Schranz et al., 2006; Warwick and Sauder, 2005).
ДНК маркеры трех геномов являются незаменимыми инструментами для быстрой и надежной идентификации видов Brassica. Для решения различных селекционных задач, связанных с применением метода
интрогрессивной гибридизации, необходим набор различных ДНК маркеров. В частности, в селекции рапса {В. napus), сурепицы и овощных форм В. гара и капусты (В. oleraced) важную роль играет интрогрессия генетического материала генома В, который несет гены/признаки устойчивости к таким грибным и бактериальным болезням, как черная ножка рапса, фомоз, или сухая гниль капусты (патоген Leptosphaeria maculans; Christianson et al, 2006; Delourme et al., 2006) и сосудистый бактериоз (патоген Xanthomonas campestris pv. campestris; Vicente et al., 2002), а также к засухе и повышенным температурам (Kumar, 1984) и осыпаемости семян (Prakash and Chopra, 1988). Поэтому создание надежных и простых в использовании ДНК маркеров генома В позволит значительно ускорить процесс интрогрессии этих и других хозяйственно ценных генов/признаков в новые сорта. Чтобы проследить за переносом генома В в целом такой набор должен содержать ДНК маркеры, равномерно рассеянные по всем восьми хромосомам генома В. Маркеры отдельных хромосом или участков хромосом генома В, несущих гены хозяйственно ценных признаков, позволяют провести более детальный анализ результатов гибридизации, а также проследить за переносом хозяйственно ценных генов/признаков, если эти маркеры картированы на конкретных хромосомах. В инрогрессивной селекции рапса в большинстве случаев используются тетраплоидные виды Brassica, содержащие геном В (В. carinata и В. juncea), так как формирование жизнеспособного потомства при слиянии родственных видов с одинаковой плоидностью более вероятно, чем при скрещивании диплоидного и тетраплоидного родителей (Warwick et al., 2006). В связи с этим применение геном-специфичных SCAR маркеров, различающих гомеологические локусы тетраплоидных геномов, значительно упрощает отбор интрогрессивных линий.
Геном-специфичные SCAR маркеры являются вспомогательными инструментами для решения проблем сравнительной генетики и геномики, молекулярной систематики и таксономии, поддержания и оценки коллекций семян Brassica в генетических банках.
Цель и задачи исследования. Провести сравнительные исследования полиморфизма анонимных и транслируемых участков геномов видов Brassica, входящих в треугольник U. Создать на этой основе геном-специфичные SCAR маркеры, пригодные для использования в селекции с помощью маркеров (marker-assisted selection, MAS), и верифицировать их путем анализа широкого круга близкородственных и отдаленных форм трибы Brassiceae. Оценить возможность использования полученных маркеров в исследованиях по молекулярной систематике, сравнительной геномике, в работе по поддержанию генетических коллекций и при решении задач интрогрессивной селекции.
Научная новизна исследования. Получены новые данные о структурном полиморфизме и хромосомной локализации трех типов повторяющихся последовательностей и локусов/аллелей шести генов Brassica. Созданы и подробно охарактеризованы восемнадцать новых SCAR маркеров геномов А, В и С Brassica, основанных на анонимных и транслируемых последовательностях генома. Подтверждена гипотеза о близком родстве генома S. arvensis с геномом В Brassica.
Практическая значимость работы. Показана принципиальная возможность использования геном-специфичных SCAR маркеров для эффективного мониторинга генетического материала в интрогрессивной селекции рапса, безошибочной идентификации видов Brassica и филогенетических исследований в пределах трибы Brassiceae. В ходе работы была исправлена видовая принадлежность трех образцов Brassica и трех образцов Sinapis, полученных из трех генетических банков. В одном случае была соотнесена номенклатура групп сцепления и дополненных хромосом В. nigra.
Систематика и таксономия Brassicaceae (Cruciferae)
Семейство Brassicaceae. Brassicaceae включает 25 триб, 338 родов и 3710 видов растений и разделяется на три основных группы (lineage), границы которых определены на основании молекулярной таксономии (Beilstein et al., 2008). Brassicaceae является «модельным» семейством в биологии растений, особенно для исследований в области эволюционной биологии развития (evo-devo). «Модельный» потенциал таксона обусловлен наличием большого количества данных по развитию, геномике и многочисленным филогенетическим исследованиям этого семейства. Особенно важен огромный массив данных о развитии и геномике Arabidopsis thaliana, накопленных в результате публикации полной нуклеотидной последовательности его генома (AGI, 2000). Следует отметить, что Brassicaceae является интересным и удобным объектом для эволюционных исследований с помощью молекулярных методов благодаря низкому содержанию ядерной ДНК, по сравнению с другими покрытосеменными растениями, а также незначительной межвидовой изменчивостью количества ДНК в клетке (Johnston et al., 2005).
До недавнего времени отсутствовали хорошо обоснованные гипотезы о происходении и эволюции семейства Brassicaceae. В первой теории происхождения Brassicaceae Hayek (1911), а затем Schulz (1936) и Janchen (1942) предлагали выделение Brassicaceae от подсемейства Cleomoideae (семейство Саррагасеае), произошедшее в странах Нового Света. Однако с помощью молекулярных методов было достоверно показано, что виды Brassicaceae происходят из стран Старого Света и находятся в родственном отношении к семейству Cleomaceae, включенному на сегодняшний день в порядок Brassicales (Mitchell-Olds et al., 2005; Beilstein et al., 2006).
Дорофеев (2002) предложил использовать методы тератологии, науки, изучающей врожденные уродства отдельных органов и организмов в целом, для изучения эволюционного морфогенеза органов цветка Brassicaceae. С помощью такого подхода он обнаружил, что наличие некоторых морфологических признаков, считающихся первичными, например наличие гинофора, не всегда указывает на большую древность изучаемого таксона, так как такие признаки могли многократно формироваться в ходе эволюции семейства.
Традиционная систематика Brassicaceae (Schulz, 1936), основанная на анализе конвергентных морфологических признаков, имеет ряд недостатков и требует дополнения в соответствии с современными знаниями. Необходимость такого пересмотра обуславливается следующими фактами:
- традиционная классификация Brassicaceae основывается, прежде всего, на разнообразии морфологии плода. Warwick и Sauder (2005) показали, что морфология плода является искусственными признаком для установления реальных процессов, происходящих в ходе видообразования, так как плоды одного типа могут встречаться у филогенетически далеких друг от друга видов;
- многочисленные исследования (см. обзор Bailey et. al, 2006) достоверно показали высокий уровень гомоплазии многих морфологических признаков Brassicaceae. (Гомоплазией называют сходство признаков, сформировавшееся в результате независимых эволюционных событий и не связанное с наличием общего предка.) Поэтому нецелесообразно использовать морфологические признаки для установления филогенетических отношений на уровне семейства, а в некоторых случаях и на уровне рода (Mummenhoff et al., 1997).
- большой размер семейства Brassicaceae (3710 видов) затрудняет составление представительных выборок родов и видов для надежного разрешения проблем систематики и таксономии путем описания морфологических признаков.
Beilstein et al. (2006) использовали анализ нуклеотидных последовательностей хлоропластного гена NADH дегидрогеназы (субъединица 5; ndhF) для построения филогении Brassicaceae. Это исследование явилось важным шагом к пониманию структуры будущих филогенетических и эволюционных исследований Brassicaceae. Границы нескольких новых триб были определены с использованием молекулярных методов систематики; новые трибы хорошо встраивались в установленную систему трех монофилетических групп (lineages I-III). Все три группы, как и трибы, в составе Brassicaceae имели монофилетическое происхождение. Филогенические взаимоотношения групп в составе Brassicaceae, установленные с помощью ndhF, оказались достаточным основанием для формирования новой молекулярной классификации семейства (Al-Shehbaz et al., 2006; рис. 1), которая постепенно заменяет традиционную классификацию Schulz (1936).
Выделение геномной ДНК из тканей растений
СТАВ буфер готовили непосредственно перед выделением ДНК. Компоненты, входящие в состав СТАВ буфера, за исключением [ЗМЕ, смешивали и нагревали на водяной бане (65С) до полного растворения СТАВ. рМЕ разрушается при нагревании, поэтому этот реактив добавляли после инкубации буфера на водяной бане, непосредственно перед растиранием растительной ткани.
Навески свежей растительной ткани весом 2 г отбирали в полипропиленовые пробирки объемом 15-20 мл или высушивали при 45С в течение 12 часов и растирали (Matasyoh et al., 2008). В подготовленные таким образом образцы добавляли 7 мл СТАВ буфера, предварительно нагретого до 65С. Смесь инкубировали на водяной бане (65С) в течение 1.5 часов, тщательно перемешивая каждые 30 минут. После инкубации к гомогенату добавляли равный объем (7 мл) смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), перемешивали в течение 10 мин и затем центрифугировали 20 мин при 3000 х g. После центрифугирования верхнюю фазу переносили в чистые пробирки, добавляли 1/10 объема (-0,7 мл) 10 % СТАВ буфера и инкубировали при 65С в течение 10 мин. Затем добавляли 7 мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), тщательно перемешивали в течение 2-3 мин и центрифугировали 20 мин при 3000 xg. Верхнюю фазу переносили в чистые пробирки, добавляли 7 мл изопропилового спирта, осторожно перемешивали и оставляли на ночь при -20 С. При добавлении изопропилового спирта ДНК выпадала в осадок. На следующий день ДНК осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 2500 х g. Осадок ДНК промывали в 96% этаноле и сушили 1.5-2 часа при комнатной температуре. Высушенный осадок растворяли в 500 мкл HQH2O в течение ночи при температуре +4 С.
Полученный раствор ДНК переносили в 2 мл пробирки, добавляли 10 мкл РНКазы А (10мкг/мл) и инкубировали при температуре 37С в течение 40 минут. Затем для очистки образцов ДНК от белков добавляли равный объем (500 мкл) фенола, насыщенного Трис-HCl, тщательно перемешивали и центрифугировали 10 мин при 7000 xg. После центрифугирования верхнюю фазу переносили в чистые 2 мл пробирки, добавляли равный объем (500 мкл) смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), тщательно перемешивали и центрифугировали 6 мин при 7000 х g. Верхнюю фазу переносили в чистые 2 мл пробирки, добавляли 1/10 объема ЗМ ацетата Na или 4 мкл/100 мкл ДНК 5 М НС1 и осаждали ДНК добавлением 2-3 объемов 96% этанола.
При ограниченном количестве растительного материала использовали меньшие навески сырого материала, пропорционально уменьшая объемы реактивов для выделения и очистки ДНК.
Перед проведением анализов препараты ДНК под спиртом центрифугировали в течение 5 мин при 1700 х g. Осадок промывали 96% этанолом и сушили в течение 1.5-2 часов при комнатной температуре.
Высушенный осадок растворяли в 400 мкл J1QH2O или ТЕ буфера рН 8.0. Определение конг{Єнтрации ДНК. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре Genesis 10UV (Thermo Scientific) nNanodrop 1000 (Thermo Scientific) при длине волны 260 нм. Для спектрофотометрического анализа с помощью Genesis 10UV раствор выделенной ДНК разбавляли в 200 раз (5 мкл раствора ДНК + д НгО до 1 мл). Полученные растворы помещали в спектрофотометрическую кювету объемом 1-1.5 мл и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 260 нм (для нуклеиновых кислот). Полученную величину умножали на 10, тем самым, переводя единицы оптической плотности в концентрацию в размерности мкг/мкл.
При измерении ДНК с использованием Nanodrop 1000 1 мкл ДНК наносилась на рабочую поверхность прибора без разведения. Программное обеспечение Nanodrop 1000 автоматически определяет значения концентрации образцов ДНК.
Последовательности генов
Полиморфизм LFY. Для выявления геном-специфичных полиморфизмов было проведено множественное выравнивание гомологов генаЛРГиз В. гара, В. oleracea, В. парт и B.juncea, извлеченных из Генбанка. Анализ этого выравнивания не выявил геном-специфичные участки, однако раскрыл полиморфные и консервативные фрагменты гена LFY. Интроны оказались наиболее полиморфными фрагментами гена, и ПЦР праймеры, комплементарные консервативным участкам на конце экзона 2 и начале экзона 3, которые фланкируют интрон 2, были сконструированы для амплификации интрона 2 LFYm растений Brassica (приложение 36, Br.Flint2.univ). Полноразмерные интроны 2 LFY6bum клонированы и секвенированы из В. oleracea (2 образца), В. гара и В. carinata (локусы BolC.LFY.a-1, BolC.LFY.a-2, BraA.LFY.a-l и BcaC.LFY.a; номера регистрации в Генбанке DQ083759, DQ070882, DQ083758 и DQ083761, соответственно). Нуклеотидные последовательности интрона 2 из различных форм Brassica оказались идентичными на 96-99%, однако выравнивание этих последовательностей выявило участок наибольшей вариабельности. Для более детального изучения полиморфизма вариабельного участка были сконструированы ПЦР праймеры Br.varFHnt2.univ, фланкирующие данный участок (приложение 36). ПЦР амплификация с праймерами Br.varFlmt2.univ выявила геном-специфичный характер вариабельности в полиморфных участках (рис. 8). Эти фрагменты были клонированы и секвенированы из В. гара, В. nigra и В. oleracea (локусы BraA.LFY.a-2, BniB.LFY.a и BolC.LFY.a-3; номера регистрации в Генбанке EU056365, EU056366, EU056367, соответственно).
Полиморфизм нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов оказался гораздо выше, вследствие их большой вариабельности, и степень идентичности составила всего 87%. Отличия между вариабельными участками интрона 2 LFYB. гара и В. oleracea определялись SNP и 1-5 п.н. инделами, а участок интрона 2 LFYva В. nigra отличался геном В-специфичной инсерцией 167 п.н.
LFY (фрагменты мРНК и геномной ДНК) из В. г ара, В. napus и В. oleracea и 6 гомологичных GSS клонов (табл. 6). Полноразмерные последовательности LFYvi3 В. oleracea, предоставленные G. Teakle (неопубликованные данные) и соответствующие двум локусам LFYa и LFYb, были включены в множественное выравнивание. Такое выравнивание позволило определить соответствие полученных нами последовательностей Глокусу LFYa.
Гены COL1 и СОЬ. В Генбанке NCBI содержится 92 последовательности СОЫ и 49 последовательностей СОЬ из В. nigra (Sjodin et al., 2008), а также множество гомологов этих генов из В. гара, В. napus и В. oleracea. Хотя СОЫ и СОЬ принадлежат к одному семейству генов CONSTANS и, по-видимому, являются паралогами, нуклеотидные последовательности этих генов объединяют всего три гомологичных консервативных участка, составляющие примерно 30% их длины, тогда как остальные 70% не гомологичны. BLAST поиск гомологии СОЫ среди неаннотированных последовательностей Brassica обнаружил десять GSS из В. oleracea, пять EST из В. гара и 14 EST клонов из В. napus. Такой же поиск, проведенный для СОЬ, выявил один гомологичный GSS клон из В. гара и шесть GSS клонов из В. oleracea, а также четыре EST клона из В. гара и 11 EST клонов из В. napus.
