Содержание к диссертации
Введение
РАЗДЕЛ I. Обзор литературы 11
ГЛАВА 1. Молекулярно-генетические механизмы агро-бактериальной трансформации 11
1.1. Плазмиды агробактерий и опухолеобразование у высших растений 12
1.2. Процесс переноса Т-ДНК из агробактерий в растительную клетку . 15
1.3. Конструирование бактериальных векторов для введения генов в растения 18
1.3.1. Создание вектора на основе Ti-плазмиды 18
1.3.2. Векторы для трансформации растений на основе Ti-плазмиды 19
1.3.3 Маркёры трансформации 21
1.3.3.1. Селективные маркеры 21
1.3.3.2. Репортёрные гены 23
1.3.4. Промоторы 25
ГЛАВА 2. Антимикробные белки и их использование для защиты растений 26
2.1. Классификация антимикробных белков 26
2.2. Растительные дефензины 27
2.3. . Антимикробные свойства растительных дефензинов 29
2.4. Трансгенные растения с генами антимикробных белков, устойчивые к грибным патогенам 30
2.5. Очистка и экспрессия антимикробного белка МІАМР1 33
ГЛАВА 3. Регенерации из соматических тканей растений 35
3.1. Регенерации рода Brassica 35
3.2. Регенерация рапса 40
3.2.1. Выбор экспланта рапса 40
3.2.2. Роль фитогормонов в среде для регенерации рапса 43
ГЛАВА 4. Генетическая трансформация представителей рода Brassica с помощью Agrobacterium tumefaciens 45
4.1. . Метод кокультивирования с агробактерией 45
4.2. Факторы, влияющие на агробактериальную трансформацию представителей рода Brassica 47
РАЗДЕЛ II. Экспериментальная часть 58
ГЛАВА 5. Объекты, условия и методы проведения исследований 58
5.1. Клонирование 58
5.1.1. Место исследования 58
5.1.2. Бактериальные штаммы, плазмиды и используемые среды для выращивания бактерий 58
5.1.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК E.coli 59
5.1.4. Конструирование растительного вектора 59
5.1.5. Трансформация агробактериального штамма AGL0 плазмидной ДНКрСАМВІА1305.1-МіАМР1 61
5.1.6. Наращивание и приготовление агробактериального газона 62
5.1.7. Проверка наличия рекомбинантных ДНК в агробактерии 62
А» 5.1.8. Проверка наличия vzr-генов в трансформируемом штамме агробактерии 63
5.1.9. Анализ клонированного гена 64
5.1.10. Культивирование и хранение бактериальных штаммов 64
5.2. . Культивирование in vitro и оптимизация условий регенерации рапса . 64
5.2.1. Растительный материал 64
5.2.2. Условия культивирования 65
5.2.3. Подбор и приготовление питательных сред 65
5.2.4. Введение в культуру in vitro 66
5.2.5. Выбор экспланта рапса 67
5.2.6. Укоренение регенерантов в среде 67
5.2.7. Математическая обработка 68
5.3. Агробактериальная трансформация рапса 68
5.3.1. Подготовка эксплантов рапса к трансформации 68
5.3.2. Получение ночной культуры агробактерии 69
5.3.3. Инокуляция экспланта агробактерией 69
5.3.4. Получение трансформантов рапса 70
5.4. Методы анализа растений-трансформантов 70
5.4.1. Гистологическая окраска GUS 71
5.4.2. Выделение растительной геномной ДНК для ГШР 71
5.4.3. ПЦР-анализ наличия трансгена гигромицин-устойчивых растений ; 72
РАЗДЕЛ III. Результаты исследований 73
ГЛАВА 6. Клонирование ДНК, кодирующей ген анти микробного белка МІАМР1 73
6.1. Создание векторной конструкции с геном Mi AMP 1 73
6.2. Трансформация генетической конструкции в агробактерию 84
6.3. Проверка наличия v/r-генов в трансформируемом штамме *Р? агробактерии 88
ГЛАВА 7. Оптимизация условий регенерации рапса 90
7.1. Оценка растительного материала на интенсивность морфогенеза в культуре in vitro 91
7.2. Влияние состава питательной среды на формирование адвентивных почек рапса в условиях in vitro 94
7.3. Влияние АБК на побегообразование эксплантов рапса 98
7.4. Сравнение питательных сред № 5 и № 9 на адвентивный морфогенез рапса сорта "Quantum" в условиях in vitro 100
7.5. Влияние фитогормонов на витрификацию растений-регенерантов рапса 101
ГЛАВА 8. Трансформация растений рапса с геном антимикробного белка МІАМР1 106
8.1. Влияние антибиотиков на экспланты нетрансформированных растений 106
8.2. Определение эффективности трансформации рапса при помощи созданной векторной конструкции с геном МІАМР1 108
8.3. Анализ первичных трансформантов рапса 111
8.4. Определение экспрессии гена р-глюкуронидазы (GUS) 112
Заключение 115
Выводы 117
Благодарности 119
Список литературы
- Плазмиды агробактерий и опухолеобразование у высших растений
- Классификация антимикробных белков
- Регенерации рода Brassica
- Бактериальные штаммы, плазмиды и используемые среды для выращивания бактерий
Введение к работе
В последние годы, в связи с задачами наращивания производства сельскохозяйственной продукции, большое внимание уделяется теоретическим разработкам и практической реализации внедрение новейших достижений биотехнологии. Проблема создания новых форм может быть решена по-разному для различных видов растений. Для одних, более лабильных, для этих целей может быть использована сомаклональная изменчивость, для других — это может быть слияние протопластов или мутагенез. К настоящему времени наиболее совершенным методом, позволяющим получать растения, обладающие новыми заранее заданными свойствами, несвойственными исходным формам, является генетическая
,|. инженерия.
Генетическая инженерия дает возможность получения растений со свойствами присутствие которых невозможно обеспечить методами традиционной селекции. Методами генетической инженерии можно конструировать функционально активные генетические структуры in vitro из фрагментов генов различных организмов и вводить такие конструкции в клетку, создавая условия для экспрессии введенных, часто совершенно
іф чужеродных генов.
В настоящее время решены фундаментальные вопросы, связанные с передачей генов: разработаны методы трансформации, созданы плазмиды для переноса, подобраны условия эффективного введения чужеродных генов. С помощью генетической трансформации созданы трансгенные растения, представляющие интерес для сельскохозяйственного производства, в том числе, обладающие такими признаками как устойчивость к гербицидам, насекомым, вирусам, фитопатогенам, абиотическим стрессам и др.
* Трансгенные формы картофеля, томатов, табака, риса, кукурузы, сои, рапса,
подсолнечника, льна проходят испытания на экспериментальных полях, а
некоторые уже составляют значительную часть в валовом сельскохозяйственном продукте ряда стран, в первую очередь, США.
В сельском хозяйстве остро стоит проблема потерь урожая вследствие заражения культурных растений бактериальными и грибными патогенами. До недавнего времени она была трудно разрешима. Новые возможности в решении этих вопросов были получены благодаря активному изучению механизмов защиты растений против фитопатогенов и выявлению важной роли белков в этом процессе. Интенсивное изучение структуры и функций антимикробных пептидов, исследование их генетической обусловленности может помочь в создании методами генной инженерии трансгенных культурных растений, устойчивых к различным заболеваниям.
В последние годы развитие биотехнологии и генной инженерии позволило методом генетической трансформации, применяя векторные конструкции, создавать растения, устойчивые к грибным болезням. Это достигается главным образом путем введения в них чужеродных генов, кодирующих защитные белки, накопление которых в тканях растений губительно для патогенов. К таким белкам принадлежат короткие цистеин-богатые белки, получившие название антимикробных белков.
Агробактериальная трансформация известна как наиболее оптимальный способ введения чужеродных генов в двудольные растения. В связи с этим, достаточно актуальна проблема создания генетических конструкций, обеспечивающих высокий уровень трансформации и экспрессии целевого гена. От патогенов в большей степени страдают вегетативные органы растений. Поэтому экспрессия в них генов антимикробных белков, особенно - обладающих более высокой физиологической активностью пептидов из других растений, должна способствовать появлению необходимой устойчивости к патогенам у всего растения.
Актуальность нашего исследования определялась тем, что рапс (Brassica napus L.) является одной из ценных кормовых и масличных сельскохозяйственных культур, получивших большое распространение в Канаде, Китае, Европейских странах, Индии, и в других странах мира. В Иране ежегодно увеличивается площадь под посевами рапса. В 2004 году в Иране объем производства рапса на площади 72,000 га был 108,000 т.
Один из главных факторов, ограничивающих возделывание этой культуры - его восприимчивость к склеротинии (Sclerotinia sclerotiorum) -причинный агент белой болезни гнили. Применение фунгицидов не очень эффективно для устранения симптомов вызванных этой болезнью. Дополнительно применение фунгицидов увеличивает стоимость производства и может оказывать неблагоприятное влияние на окружающую среду. Поэтому идентификация генов для создания устойчивого рапса методами генной инженерии обеспечивает привлекательную альтернативу для улучшения устойчивости к этой болезни [Kazan et al., 1999].
Ускорить решение данной проблемы можно при помощи методов генной инженерии. McManus и его коллеги выделили из ядра австралийского ореха (Macadamia integrifolia) антимикробный белок Mi AMP 1 в 1999 году в Австралии в университете Квинсленда. Они полагали, что ген, кодирующий этот белок, может быть использован для генетической манипуляции с целью увеличения устойчивости к болезням в трансгенных растениях.
В связи с вышеизложенным, настоящая работа посвящена анализу полученных при помощи ПЦР амплификации в Центре молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева гена МІАМР1, кодирующего антимикробного белка австралийского ореха, созданию векторной конструкции с этим геном для проведения агробактериальной трансформации иранского рапса, который отличается генетической устойчивостью к болезни склеротинии.
Целью данной работы является создание растительного вектора, оптимизация условий регенерации и генетической трансформации рапса с использованием Agrobacterium tumefaciens. Для достижения поставленной цели нужно было решить следующие задачи:
1. Сконструировать растительный вектор;
2. Оптимизировать условия регенерации и агробактериальной
трансформации рапса;
3. Отобрать первичные трансформнты рапса.
В связи с вышеизложенными, важнейший этап в создании трансгенных растений посвящен разработке эффективной методики регенерации и генетической трансформации рапса. Целью данной методики является проведение эксперимента по агробактериальной трансформации, в результате которой в геном рапса будет включен фрагмент чужеродной ДНК, содержащий ген Mi AMP 1, продукт которого придаст растениям рапса устойчивость к склеротинии.
В работе по трансформации растений рапса применяли специальный агробактериальный штамм AGL0, содержащий растительный вектор рСАМВ1А1305.1 с геном МіАМРІ в качестве целевого гена.
Метод создания трансгенных растений рапса в культуре тканей включает в себя целый ряд важных этапов: выбор реципиентной системы, подбор оптимальных условий, культивирования, проведения регенерации и генетической трансформации, отбор устойчивых трансформантов рапса к антибиотику гигромицину и получение первычных трансформантов рапса.
Плазмиды агробактерий и опухолеобразование у высших растений
Агробактерий, помимо хромосомной ДНК, несут также один или более небольших генетических элементов - плазмид, которые не сцеплены с хромосомой, но стабильно сохраняются без специальной селекции и, таким образом, могут рассматриваться как дополнительные, небольшие хромосомы агробактерий. Плазмиды агробактерий представляют собой двухцепочечные замкнутые кольцевые молекулы ДНК. Во всех вирулентных штаммах А. tumefaciens были обнаружены плазмиды длиной -200 т.п.н., связанные с опухолеобразованием и получившие наименование Ті-плазмид, часть которой встраивается в хромосомы клеток растения. В бактериальных клетках они способны реплицироваться автономно. Ti-плазмиды могут быть разделены на четыре группы по типу синтезируемых ими опинов. Чаще всего встречаются Ti-плазмиды, кодирующие аминокислоты нопалин или октопин. Причем агробактериальная клетка может содержать только один тип плазмиды: либо октопиновую, либо нопалиновую [Рыбчин, 1999; Шевелуха и др., 2003].
Описание Ti-плазмиды у A. tumefaciens на молекулярном уровне и демонстрация переноса и стабильной интеграции Т-ДНК в ДНК растения является заслугой трех разных групп исследователей, которые осуществили это почти одновременно: Нестер и Чилтон в 1977 году [США], Ван Монтегю и Шелл в 1979 году [Бельгия], Схильперорт и Ледебург в 1978 году [Голландия]. Исследования Ті-плазмид разных штаммов агробактерий показали, что в них имеется четыре области гомологии. Две из них - Т-ДНК (от англ. Transforming DNA- трансформирующая ДНК) и vir область (от англ.- virulence) - связаны с опухолеобразованием, а две другие отвечают за конъюгационный перенос (/га-область) и репликацию плазмид в клетках агробактерии (orz-область) [Дрейпер и др., 1991].
Генетические исследования показали, что все Ti-плазмиды имеют сходное строение и содержат последовательности, которые можно поделить на две группы: 1) необходимые для метаболизма самой агробактерии (гены катаболизма опинов, точка начала репликации плазмиды и т.д.); 2) необходимые для трансформации растительной клетки. При этом следует особо отметить, что гены первой группы имеют прокариотический тип промотора и могут функционировать только в бактериальной клетке, а второй группы - могут работать в растительной клетке. Ко второй группе относятся гены, ответственные за индукцию опухоли и синтез опинов [Шевелуха и др., 2003].
Большая часть генетической информации Ті- плазмид имеет отношение к опухолеобразованию - индукция опухоли, синтез и утилизация опинов, конъюгационный перенос Ті-плазмид, изменение метаболизма агробактерии, связанное с использованием ими питательных веществ, присутствующих в месте возникновения опухолей растения.
Было показано, что агробактерия не входит в растительную клетку, не входит в нее и Ті-плазмида, но часть Ti-плазмиды (Т-ДНК) переносится в ядро растительной клетки и может стабильно встраиваться в растительный геном. Присутствие агробактерии необходимо только для индуцирования образования опухоли. Опухолевые клетки начинают синтезировать опины, которые используются агробактериями в качестве источника азота, углерода и энергии [Шевелуха и др., 2003]. Опины представляют собой либо сахарные производные аминокислот (октопин, нопалин, лейцинопин, агропин), либо фосфорилированные производные Сахаров (агроцинопины). Тип опина, синтезируемого в опухоли зависит от штамма агробактерии. Октопин и нопалин - опины, образующиеся из аргинина, находятся в корончатых галлах. Каждый бактериальный штамм может использовать только тот опин как источник углерода и азота, который синтезируется индуцируемой ими опухолью. [Пирузян, Адрианов, 1985]. Известно, что опины индуцируют не только катаболитные гены, но также гены конъюгативного переноса (/га-гены), на этих плазмидах, приводя к распространению Ті-плазмид в бактериальной популяции, присутствующей в опухолевых тканях. [Рыбчин, 1999]. Таким образом, при заражении растения агробактерией происходит перестройка метаболизма трансформированных растительных клеток, и они начинают синтезировать соединения, необходимые только для бактерий.
Длина Т-ДНК составляет 23 т.н.п., 5-8% Ті-плазмид и кодирует 10-15 белков, которые непосредственно не участвуют в процессе ее интеграции. В растительную ДНК может встраиваться одна или более копий Т-ДНК. Т-ДНК содержит оис-гены (oncogenicity), продукты которых препятствуют нормальной регуляции метаболических процессов, вовлеченных в синтез фитогормонов, что и приводит к онкогенному фенотипу. Т-ДНК содержит гены изопентилтрансферазы (ipt), триптофанмонооксигеназы (JaaM) и индолилацета-миногидролазы (iaaH). Эти гены кодируют ферменты, направляющие биосинтез растительных гормонов; изопентил-АМФ (цитокинина) и индолилуксусной кислоты (ауксина), что объясняет независимость трансформированных растительных клеток от этих ростовых регуляторов. [Binns et al., 1988; Лугова, 2000].
Таким образом, суть механизма опухолеобразования заключается в том, что Т-ДНК переносится в растительную клетку, становится частью ее ядерной ДНК и в результате экспрессии этой Т-ДНК растительная клетка перерождается в опухолевую. При этом ояс-гены и гены опинов не участвуют в переносе Т-ДНК в растительные клетки и не влияют на ее стабильность в геноме растений.
Классификация антимикробных белков
В природе растения растут на субстратах богатых различными микроорганизмами, но их заражение происходит сравнительно редко. Это объясняется тем, что растения производят целый ряд соединений с защитными свойствами, большую часть которых составляют белки. Накопление данных о многообразии антимикробных белков или PR-белков (pathogenesis related proteins) привело к появлению их классификаций. Первоначальная классификация включала только пять классов PR-белков [Van Loon et al., 1987; Bol et al., 1990]. В 1994 PR-белки табака и томатов были разделены на 11 семейств [Van Loon et al., 1994]. В 1999 году все обнаруженные PR-белки разделены на 14 семейств [Van Loon et al., 1999]. Для включения в систему новых PR-белков имеется два критерия: 1. Белок должен индуцироваться патогеном в тканях, но не экспресси-роваться в норме; 2. Индуцированная экспрессия должна быть вызвана за счет действия, по крайней мере, двух различных комбинаций между растением и патогенами.
Большое внимание придается изучению малых антимикробных пептидов. Регуляция синтеза малых пептидов осуществляется быстро, так как они являются продуктами малоразмерных генов (300-400 п.н.), и вырабатываются хозяином с минимальными затратами энергии. Это объясняет главенствующую роль малых пептидов в защитной системе растений и животных [Boman, 1995]. Было обнаружено, что подобные антимикробные белки содержатся не только у позвоночных животных, насекомых, но и у растений.
Растительные дефензины - короткие белковые молекулы, которые состоят из 30-50 а.к. В первичной структуре изученных дефензинов наблюдается 50% сходство, а также имеются 8 остатков цистеина в определенных позициях, 2 остатка глицина, один ароматический остаток, один глутаминовый. Все остатки цистеина задействованы на образование дисульфидных связей, что придает высокую стабильность молекулам дефензинов [Broekaert et al., 1995]. Первые растительные дефензины (от англ. defense - защита) были выделены из зерен пшеницы и ячменя, и были изначально названы у-тионинами [Mendez et al., 1990]. Доказано что тионины и у-тионины структурно не связаны. В 1992 году независимо друг от друга в лаборатории
Marshac из кукурузы и в лаборатории Broekaert из редьки и были выделены короткие пептиды широкого фунгицидного и бактерицидного действия [Osborn et al., 1995]. Они однотипны по организации и составу, обнаруживаются в семенах, вегетативных и генеративных органах, а их структурные и функциональные свойства похожи на свойства дефензинов насекомых и млекопитающих. В связи с этим данные белки получили название растительных дефензинов [Broekaert et al., 1993].
Поскольку большинство белков этой группы было выделено из семян, где они присутствуют в достаточно большой концентрации, можно предполагать что функция этих белков состоит в защите семян от различных фитопатогенов. Помимо семян эти белки экспрессируются в растительных тканях [Terras et al., 1995].
В ответ на воздействие микробных патогенов растения способны индуцировать экспрессию PR генов, связанных с патогенезом. Накопление в растении PR белков совпадает с повышением устойчивости растений в ответ на взаимодействие с патогеном [Chiang et al, 1991]. Это явление известно как системная устойчивость (SAR). Салициловая кислота (SA), жасмоновая кислота (JA) и газообразный растительный гормон этилен играют важную роль в проведении сигнала, приводящего к SAR. Так в результате изучения индукции гена дефензина из листьев Arabidopsis было показано, что данный ген транскрибируется при обработке метил-жасмонатом, так же как и в результате заражения при помощи Altemaha brassicola [Penninckx et al., 1996].
Это показывает, что растительные дефензины экспрессируются как конститутивно, так и индуцибельно. Также наблюдается органоспецифич-ность их экспрессии.
Регенерации рода Brassica
Регенерация растений из рода Brassica изучалась в различных лабораториях у В. парт [Zhang et al., 1999; Tang et al., 2003; Cardoza et. al., 2004; Jonoubi et al., 2003, 2004, 2005; Halina et al., 2005; Reda et al., 2006; Wang et al., 2006], B.juncea [Gong et al., 2004], B, campesths [Mukhopadhyay et al., 1992; Kranthi et al., 2005], B. carinata [Narasimhulu et al., 1992] и, наконец у В. oleracea [Wei et al., 1998; Lingling et al., 2005].
Исследования показали, что легче всего добиться регенерации в культуре in vitro у B.juncea, а наиболее трудный для этого вид - В. campestris. Остальные представители рода занимают промежуточное положение. Интересно, что присутствие в геноме амфидиплоидов компонента В. campestris снижает частоту регенерации побегов, указывая на генетическую детерминацию этого признака. Кроме межвидовой, у Brassica отмечена также широкая внутривидовая вариабельность по способности к адвентивному органогенезу [Narasimhulu et. al., 1992].
Зависимость способности к морфогенезу от происхождения экспланта и возраста растения-донора была изучена у В. парт и В. oleracea var. botrytis. Наилучшую регенерационную способность проявляли стеблевые и листовые сегменты, изолированные из одномесячных растений, культивируемых in vitro. Довольно хорошей, но сильно вариабельной и зависящей от сорта была регенерация из сегментов стеблей и "тонких слоев", состоящих из эпидермиса и нижележащих зон первичного кортекса взрослых растений (до цветения). В том же исследовании было показано, что удовлетворительного уровня регенерации из гипокотилей и семядолей трёхдневных проростков удастся достигнуть лишь после включения в протокол этапа культивирования на среде, индуцирующей клеточную пролиферацию [Ovesna et al., 1993]. Последний результат расходится с данными, полученными в работах других исследователей, которые отмечают высокий выход регенерантов (до 100%) при использовании в качестве эксплантов четырёх-семнадцати дневных семядолей и гипокотилей [Chi et al., 1989; Vandemoortel et al., 1993; Metz et al., 1995; Lim et al.,1998; Radchuk et al., 2000; Cardoza et. al., 2003; Reda et. al., 2006].
Влияние минерального состава питательной среды на эффективность регенерации изучалась на цветной и кочанной капустах. Показано, что использование среды Мурасиге и Скуга (MS) даёт существенно больший выход регенерантов, чем среда Гамборга (В5) [Radchuk et al., 2000].
Попадьин [2002], анализируя влияние состава питательных сред на В. oleracea увидел, что изменение концентрации БАП от 2 до 3 мг/л в средах не оказывало значимого эффекта на частоту регенерации, так же как и изменение концентрации сахарозы от 30 до 45 г/л, но в литературе имеются данные, согласно которым при увеличении осмотического давления питательной среды происходило увеличение частоты адвентивного морфогенеза [Vandermoortel et al., 1993]. Vandermoortel с соавторами исследовал влияние осмотического потенциала питательной среды на регенерацию побегов у В. oleracea var. botrytis. Им были получены данные о том, что наиболее благоприятным для адвентивного морфогенеза является осмотический потенциал, значение которого равно -0,19 Мра. Понижение его до -0,57 Мра способствует каллусогенезу и подавляет органогенез. В большинстве работ по изучению адвентивного морфогенеза in vitro установлено, что определяющим фактором, влияющим на этот процесс, является фитогормональный состав питательной среды. Обычно для этих целей авторы использовали 0,1-2 мг/л ЬГУК или ИУК в сочетании с 1-8 мг/л БАП или зеатина [Metz, et al, 1995; Ралдугина и др., 1995; Lim et al., 1998; Zarhloul et al., 1999; Cardoza et. al., 2003; Jonoubi et al., 2004; Zhang et al., 2005].
Попадьин [2002] отмечает, что витрификации способствует высокое содержание НУК в питательной среде. Данный результат не совпадает с литературными данными о стимуляции витрификации побегов гвоздики, дыни и каперса высокими концентрациями именно цитокининов [Leshem et al., 1988; Сафразбекян и др., 1990]. Он подчеркивает, что это, вероятно, связано с неодинаковой реакцией на воздействие фитогормонов у разных культур.
Показано, что для растений многих видов успешный процесс регенерации из различных эксплантов связан с необходимостью предварительного каллусогенеза с последующим переносом на среду, индуцирующую органогенез [Petersen et al., 1991; Ралдугина и др., 1994]. Ралдугина и др. [1995] наблюдали, что эффективность органогенеза у семядольных эксплантов при предварительном инкубировании на каллусиндуцирующей среде зависела от возраста проростков. По их результатам, максимальную способность к побегообразованию рапса проявили экспланты семядолей 3-дневных проростков. Частота побегообразования несколько уменьшалась у 5-дневных проростков, а на эксплантах 7-дневных проростков побеги не образовывались. Они сделали заключение, что наиболее оптимально использовать для регенерации побегов экспланты семядолей 3-дневных проростков, а предварительный каллусогенез либо проводить нецелесообразно, либо следует ограничить его длительность 4 сут.
Действие прекультивирования на органогенез скорее всего обусловлено ограниченным временем чувствительности экспланта к гормону-индуктору побегообразования. Если эксплант за время каллусогенеза успевал "состариться" и потерять чувствительность к гормонам-индукторам органогенеза, то побегообразования не происходило. В работе Sharma с сотр. [1991] на семядолях В. juncea было показано, что прекультивирование эксплантов в течение 7 сут на среде без гормонов полностью подготавливало компетентные клетки на местах среза к формированию корней и их последующий перенос на среду с гормонами не изменял поведение этих клеток. В опытах Ралдугиной и др. [1995] наблюдалась связь условий прекультивирования с возрастом проростков. Пяти и семи-дневные проростки после каллусогенеза на среде без гормонов практически полностью утрачивали способность к побегообразованию. В то время как побегообразовательная способность семядолей без предварительного каллусогенеза на разных средах у 3-дневных проростков достигала 60%, у 5-дневных - 30%. Для 5-дневных проростков увеличение времени прекультивирования на среде с гормонами вызывало увеличение частоты побегообразования, тогда как инкубация эксплантов на среде без гормонов не приводила к образованию побегов [Ралдугина и др., 1995].
Обнаружено, что добавление к регенерационной среде различных веществ: солей, осмотиков, ингибиторов роста или АБК - вызывало усиление эмбрио- и органогенеза [Chi et al., 1989; Chi et al., 1990; Sethi et al., 1990; Ралдугина и др., 1994].
Бактериальные штаммы, плазмиды и используемые среды для выращивания бактерий
В связи с присутствием в используемом нами для трансформации векторной конструкции в качестве селективного фактора гена гигромицинфосфотранс-феразы (hpi), придающего растениям устойчивость к антибиотику гигромицину, необходимо было проверить влияние этого антибиотика, а также антибиотика цефотаксима, использованного для подавления роста бактерий при культивировании эксплантов, на регенерацию растений из семядольных эксплантов рапса.
Изучение влияния антибиотиков гигромицина и цефотаксима на жизнеспособности нетрансформированных семядольных регенерантов рапса сорта Quantum показало, что семядольные экспланты были высоко чувствительны к действию гигромицина и почти не реагировали на цефотаксим. Гигромицин отрицательно действовал на регенерацию побегов на семядольных эксплантов in vitro. Начиная с концентрации гигромицина 2 мг/л, происходило ингибирование роста, что приводило к гибели регенерантов. При концентрации гигромицина 2 мг/л после 5 недель обработки 37,5% регенерантов погибали. При 5 мг/л гигромицина экспланты в местах среза темнели и через 5 недель все регенеранты погибали. При увеличении концентрации гигромицина до 10 мг/л гибель регенерантов происходила через 4 недели, а при концентрации 20 мг/л через 3 недели регенераны теряли жизнеспособность (таб. 3.6).
Из результатов следует, что селективная среда для регенерации побегов-трансформантов должна содержать гигромицин в концентрации 5-10 мг/л. Добавление в среду цефотаксима, антибиотика, используемого для элиминации агробактерий из растительной ткани, даже в высоких концентрациях не оказывало влияние на жизнеспособность эксплантов, хотя и не снижало частоту побегообразования. При совместном действии цефотаксима и гигромицина, добавленных в максимальных из использованных нами концентрациях (цефотаксим 500 мг/л), получали такой же эффект, как и при использовании одного гигромицина.
Трансформацию растений рапса проводили по методике описанной в разделе "Материалы и методы" при помощи Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0 с бинарным вектором рСАМВ1А1305.1, содержащим ген МІАМР1 с репортерным геном GUSPlus под контролем промотора 35S CaMV и различными регуляторными элементами, созданной нами. В качестве селективного гена использовался ген hpt под контролем CaMV 35S double enhancer промотора. Кодируемый геном фермент инактивирует антибиотик гигромицина.
После трансформации семядольных эксплантов рапса с агробактерией, удалив остаток суспензии агробактерии, стерильной фильтровальной бумагой, их помещали для кокультивирования на агаризованные среды MS № 2 и № 5 без добавления антибиотика цефотаксима. Кокультивирование проводили в течение двух суток на рассеянном свете как при температуре 26С, так и при температуре 22С, до момента начала появления едва заметного бактериального газона вокруг эксплантов. Такая методика была нами применена и для трансформированных эксплантов, которые использовали в качестве контроля (таб. 3.7).
Как следует из таб. 3.7, частота регенерации трансформированных эксплантов для кокультивирования в течение 2-х сут перед переносом их на морфогенные середы, на среде № 2 для каллусообразования (50,4%) была выше, чем в контрольном варианте на среде № 5 (47,1%), учитываемые показатели не имели существенных различий между собой на 5% уровне значимости.
При обработке температурой наибольшая частота регенерации побегов наблюдалась на нетрансформированных эксплантах, где она составила в среднем 52,4%, в то время частота регенерации трансформированных эксплантов при культивировании их при температуре 26С составила в среднем 42,9%, а при температуре 22С - в среднем, 50,9%. Данные обработки имели существенные различий между собой на 5% уровне значимости.
Так же мы изучали влияние времени кокультивацип семядольных эксплантов и обработки температурой сорта Option 500 с агробактерией на частоту регенерации побегов трансформированных и нетрансформированных эксплантов (рис. 3.29).
