Введение к работе
Актуальность темы.
Получение рекомбинантных белков является типовой задачей, лежащей в основе многих биотехнологических проектов. Со времен появления модели лактозного оперона Жакоба и Моно молекулярные биологи и биотехнологи исходят из представления, что регуляции экспрессии гена осуществляется на уровне промотора и не зависит от структуры кодируемого белка. Эта модель вполне удовлетворительно описывает механизм регуляции работы генов в естественном окружении, но мало пригодна для создания продуцентов гетерологичных и, особенно, искусственно сконструированных белков. Общеизвестно, что использование даже самых современных и мощных бинарных промоторных систем, например, на основе промотора Т7, не дает гарантии детектируемого выхода продуктов слитых или укороченных производных природных генов. Еще реже удается добиться экспрессии in vivo полностью синтетических искусственных генов. Мы предполагаем, что трансляционные системы in vivo способны на стадии, предшествующей релизингу пептидил-тРНК, оценивать способность продукта к формированию компактной глобулярной структуры. Пептидные цепи, не способные к этому, подвергаются немедленной деградации. В рамках этой гипотезы универсальным подходом к конструированию эффективных продуцентов гетерологичных белков является обеспечение их способности к формированию устойчивой глобулярной структуры непосредственно в процессе трансляции.
Проблемы с конструированием рекомбинантных продуцентов часто возникают при работе с мембранными белками и белками с большим числом дисульфидных связей. Эти проблемы особенно часто встречаются при попытках получения в гетерологичных системах вирусных антигенов, как структурных так и неструктурных. Помимо низкого уровня накопления белка сложность составляет высокая токсичность многих вирусных антигенов для клеток рекомбинантных продуцентов. По-видимому, эта особенность структурных и части неструктурных вирусных белков связана с наличием у них способности образовывать мультимолекулярные сети в составе вирусной частицы. Многоцентровые взаимодействия вирусных белков друг с другом и с элементами клетки хозяина при гетерологичной экспрессии способны вносить хаос в передачу сигналов внутри цитоплазмы и с участием мембран. Таким образом, универсальным подходом к снижению токсичности вирусных антигенов могло бы стать их расчленение на отдельные домены, не способные образовывать сети.
Решение задачи по вычленению доменов в составе белков, структура которых неизвестна по причине их недоступности в очищенном состоянии, может быть решена тремя принципиально разными способами:
-
Предсказание доменной организации за счёт поиска лучше охарактеризованных гомологов и аналогов;
-
Разработка мультиэпитопных синтетических белков на основе иммунодоминантных пептидов, идентифицированных в структуре белка с помощью пептидного эпитопного картирования;
-
Скрининговый подход, основанный на конструировании случайных двусторонних банков делеционных производных генов вирусных антигенов с отбором из него делеционных производных, обладающих способностью к хорошей экспрессии в клетках бактерий.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является на примере производных оболочечного белка Gc хантавирусов отработать универсальную методологию препаративного получения рекомбинантных вирусных антигенов, используя комбинацию различных методов.
В соответствии с целью поставлены следующие задачи:
-
Апробировать подход к конструированию эффективных продуцентов делеционных вариантов белка Gc хантавируса Добрава, основанный на предсказании доменной организации этого белка по аналогии с оболочечными белками флавивирусов.
-
На основе анализа опубликованных данных пептидного эпитопного картирования белка Gc хантавируса Добрава предложить структуру короткого иммунодоминантного пептида, добиться его высокоэффективной экспрессии в растворимой форме в составе би- и три-функциональных слитых белков.
-
На модели неструктурного белка NS5a ВГС отработать систему конструирования банков делеционных производных in vitro с помощью ПЦР со случайной затравкой и скрининга этого банка путём отбора клонов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии трансгена.
-
С использованием скринингового метода получить набор делеционных производных белка Gc хантавируса Пуумала, обладающих способностью к высокоэффективной экспрессии в E. coli. Отобрать среди них иммуноположительные варианты.
-
Изучить и сопоставить технологические и иммунохимические свойства полученных рекомбинантных антигенов. Сконструировать на их основе лабораторные тест-системы для иммунохимической детекции специфических антител больных ГЛПС.
Научная новизна работы. Впервые в мире получены бактериальные продуценты рекомбинантных белков - производных поверхностного антигена Gc хантавируса Добрава, обладающие нормальной жизнеспособностью и обеспечивающие возможность очистки продукта. Полученный результат впервые экспериментально подтвердил теоретическую модель доменной организации белка Gc, в том числе, предположение о необходимости удаления из структуры рекомбинантного белка петли слияния, обладающей кинетизмом и склонной к взаимодействия с мембранами. Отработана система оценки выхода рекомбинантных белковых продуктов в растворимой форме in vivo на основе цветных флуоресцентных белков. Создана и апробирована полностью оригинальная система конструирования банков делеционных производных на основе ПЦР с вырожденным праймером и векторная система для скрининга этих банков на способность к экспрессии in vivo. C помощью новой системы получены делеционные производные неструктурного белка NS5a вируса гепатита С и поверхностного белка Gc хантавируса Добрава, не токсичные для клеток продуцента и обладающие способностью к высокоэффективной продукции в бактериях с образованием растворимого продукта.
Практическая ценность работы. Наибольшей практической ценностью среди результатов работы обладает новая система для конструирования и скрининга банков делеционных производных. Она позволяет в короткие сроки получать производные генов любых вирусных и других белков с оптимальными биотехнологическими характеристиками продукта: отсутствие токсичности, высокая растворимость и эффективность биосинтеза. В дальнейшем за счет иммуноскрининга таких белков могут быть отобраны варианты, обладающие наилучшими иммунохимическими характеристиками. Практической ценностью для конструирования серодиагностических тест-систем обладают белок NC-Dob на основе поверхностного антигена Gc хантавируса Добрава, лишенный трансмембранного участка и петли слияния и белок S3 – производное неструктурного антигена NS5a вируса гепатита С, а также, возможно, производные поверхностного антигена Gc хантавируса Пуумала, отобранные в результате скрининга. Практическую ценность для создания искусственных слитых белков с оптимальными биотехнологическими свойствами, в частности, пептидных антигенов без устойчивой собственной вторичной структуры, могут представлять плазмидные конструкции на основе цветных белков, фолдона фибритина фага JS98C3 и легкой цепи протеазного ингибитора PKPI-B1.
Апробация материалов диссертации. Основные материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на следующих научных конференциях: Bari Intern. Symposium on «Мitochondrial. physiology and pathology» IUDMB Sympos. S1 Satellite events of the 33th FEBS Congress and 11th IUBMB Athens; научной конференции «Фундаментальные исследования» Пунта Кана 13-22 апреля 2012 гг.
Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Имеется один зарегистрированный патент РФ.
Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на ___ страницах компьютерного текста и включают следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована ___ таблицами и ___ рисунками. Список использованной литературы содержит ___ библиографических источников.
