Введение к работе
Актуальность темы
Мембранные белки (МБ) составляют более четверти всех белков, кодируемых геномом человека. Они представляют собой существенную часть биологической мембраны и участвуют во многих процессах жизнедеятельности клетки. Установление взаимосвязи между структурой МБ и их функцией является одной из актуальных задач структурной биологии, решение которой имеет большое практическое значение. Так, МБ являются исключительно привлекательными мишенями разного рода терапевтических стратегий и в настоящее время действие примерно половины лекарственных препаратов направлено именно на них. Получение данных, касающихся пространственной структуры МБ, а также механизмов их функционирования, способствует более глубокому пониманию биологических процессов и является ключевым моментом, лежащем в основе рационального дизайна лекарственных препаратов нового поколения.
Белки семейства KCNE являются регуляторами свойств потенциал-зависимых калиевых каналов. Несмотря на то, что мутации в регуляторных субъединицах приводят к различным заболеваниям, таким как аритмия, глухота, семейный периодический паралич, структурные особенности, лежащие в основе функционирования белков семейства KCNE до сих пор еще не изучены. Главным образом это связано с отсутствием достаточного количества белкового препарата для проведения структурных исследований. Основные проблемы, возникающие при получении всех МБ, связаны с гидрофобностью их трансмембранных участков. До сих пор получение каждого нового МБ, пригодного для проведения структурно-функциональных исследований, остается сложной, а зачастую и вовсе неразрешимой задачей.
Цель и задачи исследования
Целью данной диссертационной работы является создание эффективных систем экспрессии и очистки dKCNEl, KCNE1, KCNE2 и KCNE3 в клетках Е. coli, а также изучение структурных особенностей, присущих белкам семейства KCNE.
Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие основные задачи:
Создание эффективных систем экспрессии генов dKCNEl, KCNE1, KCNE2, KCNE3.
Разработка эффективных методик очистки белков dKCNEl, KCNE1, KCNE2 и KCNE3.
Определение структурных характеристик, присущих белкам семейства KCNE на основании данных, полученных методами КД-спектроскопии, динамического светорассеяния и ЯМР-спектроскопии высокого разрешения.
Объекты и методы исследования
В работе использовали традиционные методы генной инженерии и белковой химии: полимеразную цепную реакцию (ПЦР), рестрикцию, лигирование, электрофорез ДНК,
выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей, выделение плазмидной ДНК из Е. coli, трансформацию клеток Е. coli плазмидной ДНК, денатурирующий электрофорез белков, различные типы хроматографии; методы спектроскопии кругового дихроизма; динамического светорассеяния; ЯМР-спектроскопии.
В качестве объектов исследования были выбраны белки семейства KCNE - KCNE1, KCNE2, KCNE3 и dKCNEl, укороченный вариант KCNE1.
Научная новизна и практическая значимость работы
В данной диссертационной работе предложены оригинальные стратегии получения МБ в клетках Е. coli, позволяющие получать миллиграммовые количества чистых белков, а также их изотопно-меченых производных ( N, С, Н), достаточные для проведения структурно-функциональных исследований. Эффективность представленных методов подтверждается высокими выходами белковых продуктов - dKCNEl, KCNE1, KCNE2 и KCNE3.
Показано, что белки семейства KCNE имеют характерные а-спиральные участки в iV-и С- концевых доменах, а-спиральный трансмембранный регион и прилегающий к мембране заряженный «квадруплет». Выдвинута гипотеза об опосредованном влиянии iV- и С-концевых участков белков семейства KCNE на функционирование калиевых потенциал-зависимых каналов.
Выявлены «гликофориновые мотивы» в трансмембранных участках всех представителей семейства KCNE, а также S5/S6 доменах каналов KCNQ1 и HERG. Предполагается, что эти мотивы ответственны за образование функционально активных комплексов калиевых каналов.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции NMRCM (Санкт Петербург 2007); L юбилейной научной конференции МФТИ (ГУ) (Москва 2007); XVI зимней международной молодёжной научной школе (Москва 2004); XLVII научной конференции МФТИ (ГУ) (Москва 2004).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 4 работы, из них в рецензируемых журналах - 1; в российских и иностранных журналах, входящих в перечень ВАК - 1; тезисы докладов на международных конференциях и семинарах - 1; тезисы докладов на российских научных конференциях - 2.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из Введения, трех глав, Заключения, Выводов и Списка цитируемой литературы. Общий объем работы составляет 103 страницы текста, включая 17 рисунков, 7 таблиц и 1 схему. Список цитируемой литературы содержит 110 источников.
Похожие диссертации на Мембранные белки семейства KCNE: создание эффективных бактериальных штаммов-продуцентов, очистка и изучение структурных особенностей
