Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 Структура полисахаридов растительных клеточных стенок 10
1.1.1. Целлюлоза 11
1.1.2. Лигнин 12
1.1.3. Гемицеллюлозы 13
1.1.3.1. Р-Глюканы 15
1.1.3.2. Ксилоглюкан 15
1.1.3.3. Ксилан 16
1.1.3.4. Галактоманнан, галактоглюкоманнан 18
1.1.4. Пектин 19
1.2. Ксиланазы мицелиальных грибов 20
1.2.1. Молекулярная масса 20
1.2.2. Температурный и рН оптимум грибных ксиланаз, классификация 21
1.2.3. Субстратная специфичность и продукты расщепления 24
1.2.4. Побочные активности грибных ксиланаз 26
1.2.5. Структура ксиланаз 10 и И семейства 27
1.2.6. Аминокислотные последовательности грибных ксиланаз и структуры кодирующих их генов 28
1.2.7. Посттрансляционная модификация ксиланаз 29
1.3. Регуляция транскрипции генов ксиланаз мицелиальных грибов 29
1.3.1. Aspergillus 30
1.3.2. Регуляторы транскрипции ксиланазных генов Aspergillus XlnR и CreA 32
1.3.3. Координированная экспрессия арабиназных генов Л. niger 36
1.3.4. Trichoderma 36
1.3.5. Регуляторы транскрипции ксиланазных генов Т. reesei 37
1.3.6. Регуляция промотора xynl Т. reesei 39
1.3.7. Регуляция промоторахуп2 Т. reesei 40
1.3.8. Penicillium 42
1.3.9. Регуляция транскрипции генов ксиланаз в зависимости от рН среды 43
1.4. P. canescens F178 (ВКПМ) 44
2. Материалы и методы 47
2.1. Реактивы, плазмидные вектора, ферменты и материалы 47
2.2. Бактериальные и грибные штаммы, их культивирование 47
2.3. Общие методы 48
2.4. Исследование ростовых характеристик грибов 48
2.5. Электрофоретическое разделение белков 48
2.6. Получение [а-32Р]-меченных фрагментов ДНК 48
2.7. Выделение ДНК из грибного мицелия 49
2.8. Выделение РНК из грибного мицелия 51
2.9. Обратная транскрипция РНК и ОТ-ПЦР 53
2.10. Электрофорез РНК и перенос на нейлоновую мембрану 53
2.11. Гибридизация 53
2.12. Плазмидная трансформация Е. coli 54
2.13. Скрининг фаговой библиотеки генов и анализ ДНК рекомбинантных фагов 55
2.14. Трансформация гриба Penicillium canescens 56
2.15. Компьютерные программы для анализа нуклеотидных последовательностей ДНК 56
2.16. ПЦР с использованием грибных спор в качестве матрицы 57
2.17. Измерение активностей ферментов 57
2.18. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 58
2.19. Клонирование xylA P. canescens 58
2.20. Получение кДНК xylA и определение ее нуклеотидной последовательности 59
2.21. Определение числа копий xylA в геноме мультикопийного продуцента 60
2.22. Клонирование xlnR P. canescens 60
2.23. Делеция xlnR 63
2.24. Синтез праймеров для амплификации фрагмента гена у-актина P. canescens 66
3. Результаты и их обсуждение 67
3.1. Ксиланаза А 67
3.1.1. Клонирование гена, кодирующего мажорную эндо-1,4-бета-ксиланазу Penicillium canescens 67
3.1.2. Определение структуры xylA 71
3.1.4. Сравнение свойств ксиланазы, производимой однокопийным и мультикопийным штаммами 75
3.1.5. Индукция синтеза ксиланазы мицелиальным грибом P. canescens 77
3.1.6. Влияние суперпродукции ксиланазы на продукцию других внеклеточных ферментов 79
3.2. Ксиланаза В 81
3.3. Клонирование гена P. canescens, кодирующего регулятор транскрипции ксиланолитических генов 85
3.3.1. Анализ геномной ДНК P. canescens и клонирование гена 85
3.3.2. Влияние делеции и амплификации xlnR на продукцию ксиланазы и рост штамма 87
3.3.3. Роль xlnR в регуляции продукции других ферментов 90
3.3.4. Транскрипция х/гс/? 92
Выводы 94
- Ксиланазы мицелиальных грибов
- Регуляция промоторахуп2 Т. reesei
- Определение числа копий xylA в геноме мультикопийного продуцента
- Клонирование гена P. canescens, кодирующего регулятор транскрипции ксиланолитических генов
Введение к работе
Человек давно использует ферменты мицелиальных грибов для обработки различного сырья. Однако, на протяжении долгого времени это использование ограничивалось небольшим количеством технологических процессов, таких как производство соевого соуса или сыра. В последние десятилетия, в связи с интенсификацией технологических процессов и с развитием новых технологий переработки растительного сырья и охраной окружающей среды, появилась потребность в получении ферментных препаратов с заданными свойствами. В связи с этим повысился интерес к молекулярной биологии грибов, как природных продуцентов гликолитических ферментов.
Следует отметить, что изучение синтеза внеклеточных ферментов мицелиальными грибами объясняется не только растущей потребностью современной промышленности в этих ферментах, но и тем, что это удобная модель для изучения регуляции транскрипции эукариотических генов и секреции белков. Являясь одними из простейших эукариотических организмов, мицелиальные грибы представляют собой удобный объект для изучения. Многие их виды быстро растут, не требуют сложных питательных сред, и для них разработаны относительно простые способы генетической трансформации.
Одним из ферментов, находящих все большее применение в современной промышленности, является эндо-1,4-Р-ксиланаза (эндо-ксиланаза, ксиланаза) - фермент, расщепляющий главную цепь ксилана на ксилоолигосахариды. Он находит применение при производстве бумаги для отбеливания целлюлозной пульпы, в пекарном деле для удаления ксилана из теста для улучшения его свойств. В кормовой промышленности ксиланаза входит в состав мультиферментных комплексов, улучшающих свойства
кормов. Возможно применение ксиланазы, совместно с другими ферментами, для утилизации растительных отходов, таких как солома, опилки, и прочее.
В настоящее время основными продуцентами ксиланаз грибного происхождения являются грибы родов Aspergillus и Trichoderma. В то же время, постоянно ведется поиск новых продуцентов, вызванный потребностью в ферментах с улучшенными свойствами, и желанием расширить спектр существующих продуцентов.
Объектом нашего исследования был выбран мицелиальный гриб Penicillium canescens ВКПМ F178, первоначально выделенный как природный продуцент (3-галактозидазы, и до настоящего времени использующийся для производства этого фермента. Мы поставили перед собой задачу определить пути увеличения продукции эндо-1,4-|3-ксиланазы этим организмом, и оценить возможность создания на его основе промышленного штамма - продуцента.
Создание современных продуцентов является комплексной задачей, и одним из первых этапов этой работы является клонирование генов, кодирующих целевой фермент. Выделение гена открывает следующие возможности:
повысить продукцию целевого фермента, путем увеличения числа копий кодирующего его гена, или путем изменения промоторной области этого гена
изменить свойств белка, путем изменения нуклеотидной последовательность гена
изучать закономерности секреции белка.
Другим подходом к повышению продукции целевого фермента является изучение регуляции транскрипции кодирующего его гена. Эта работа включает в себя поиск низкомолекулярных индукторов транскрипции, поиск белков - регуляторов транскрипции, изучение путей передачи сигнала
от индуктора к регуляторному белку. В некоторых случаях увеличение внутримолекулярной концентрации индуктора и регуляторного белка приводит к повышению транскрипции гена целевого фермента.
Исходя из описанных выше подходов, в нашей работе были поставлены следующие задачи:
клонировать ген, кодирующий мажорную ксиланазу P. canescens F178
оценить возможность увеличения продукции ксиланазы с помощью увеличения числа копий этого гена
определить влияние увеличения числа копий этого гена на продукцию других внеклеточных ферментов
выяснить наличие у P. canescens F178 других генов, кодирующих ксиланазы, и оценить их влияние на суммарную продукцию ксиланазы
изучить регуляцию транскрипции гена (генов), кодирующих ксиланазу P. canescens F178
клонировать ген, кодирующий позитивный регулятор транскрипции гена мажорной ксиланазы P. canescens F178, и определить его роль в продукции других ферментов этим организмом.
Ксиланазы мицелиальных грибов
Ксиланазы, наряду с другими внеклеточными гликолитическими ферментами, производятся многими мицелиальными грибами при росте на питательных средах, содержащих растительные остатки в качестве источника углерода. Далее мы рассмотрим основные физические и химические свойства некоторых грибных ксиланаз, их классификацию, и структуры кодирующих их генов. 1.2.1. Молекулярная масса. Согласно литературным данным, молекулярные массы ксиланаз, производимых мицелиальными грибами, колеблются от 8,5 до 83 кДа (табл. 1.1). Однако, в ряде случаев величины, полученные по данным гель-фильтрации, оказывались значительно ниже величин, полученных по данным денатурирующего электрофореза в ПААГ и рассчитанных исходя из аминокислотной последовательности белка (табл. 1.1). Кроме того, мы не нашли данных о клонировании генов, кодирующих ксиланазы размером около 10 кДа. Поэтому величины около 10 к Да представляются нам заниженными. В некоторых случаях определение молекулярной массы с помощью денатурирующего электрофореза в ПААГ давало завышенные результаты по сравнение с расчетными, даже с учетом гликозилирования [89]. Большинство клонированных генов, кодирует ферменты массой 18-35 кДа. Наиболее часто встречаются ферменты массой около 20 кДа, и около 30 кДа. В Таблице 1 приведены молекулярные массы и ряд физизико-химических свойств ксиланаз некоторых мицелиальных грибов. 1.2.2. Температурный и рН оптимум грибных ксиланаз, классификация. Температурный оптимум для большинства грибных ксиланаз находится в диапазоне 40 - 60 С, однако обнаруживаются штаммы как с пониженным температурным оптимумом до 25 С [86], так и с повышенным до 75 С [91] и 90 С [142]. Термостабильность большинства ферментов находится в том же температурном диапазоне, что и их температурный оптимум. Максимальную активность и стабильность большинство грибных ксиланаз проявляют в слабокислой среде, чем отличаются от ксиланаз бактериального происхождения, у которых эти показатели обычно смещены в слабо-щелочную область [161]. В случае некоторых ферментов оптимум рН опускается до 2 [90,95], и поднимается до рН 8,5 [139]. Большинство ксиланаз относятся к 10 и 11 семействам гликозилаз (также называемым "F" и "G"), в то же время встречаются ферменты с ксиланазной активностью, принадлежащие к 5, 7, 8 и 43 семействам [43]. К 10-му семейству принадлежат ксиланазы с большой молекулярной массой (около 30 кДа) и низкой изоэлектрической точкой, а к 11-му - с низкой молекулярной массой (около 20 кДа) и высокой изоэлектрической точнкой. В свою очередь ксиланазы 11-го семейства подразделяют на группы, согласно их свойствам [161]. Недавно был разработан метод для экспериментального определения к какому семейству относится данный фермент [132].
Этод метод основан на необратимом ингибировании эндоксиланаз 11-го семейства эпоксил-гликозидами D-ксилозы, тогда как на ферменты 10-го семейства эти соединения не действуют. было упомянуто ранее, ксиланазы расщепляют главную цепь ксилана до ксилоолигосахаридов. У ферментов из разных организмов наблюдаются различия в размере продуктов расщепления, в активности по отношению к замещённым основаниям, в наличие побочных активностей. Например, две низкомолекулярные ксиланазы A. niger (pi 8,6 и 9,0) активнее гидролизуют растворимый ксилан (содержащий большое количество заместителей), чем нерастворимый (с малым количеством боковых цепей), обладают низкой активностью по отношению к линейным ксилоолигосахаридам, и не гидролизуют нерастворимый ксилан без боковых цепей. Таким образом, для их активности необходимо наличие боковых заместителей вблизи точки расщепления. Основными продуктами расщепления ксилана этими ферментами, являются три- и пентаолигосахариды [70]. Ещё одна низкомолекулярная ксиланазаЛ. niger (14 кДа и pi 4,5), также проявляет значительно большую активностью по отношению к растворимому ксилану чем к нерастворимому, расщепляет олигосахариды с длинной цепи от пяти - до девяти остатков, и не действует на ксилобиозу, ксилотриозу и ксилотетраозу. Основные продукты расщепления ксилана этим ферментом - смесь олигосахаридов с длинной цепи от двух до шести остатков, при этом ксилоза в продуктах расщепления не обнаруживается [156]. Основными продуктами расщепления ксилана высокомолекулярной ксиланазой A. niger (28 кДа и pi 3,65) являются три- и пентаолигосахариды. Минимальный размер олигосахарида, на который действует фермент - 4 ксилозных остатка [145]. Ксиланаза Т. longibrachiatum 11-го семейства проявляет максимальную активность по отношению к олигосахаридам длиннее 8-й ксилозных остатков, и не чувствительна к наличию боковых заместителей [114]. Основные продукты расщепления ксилана этим ферментом - ксилобиоза и ксилотриоза [147]. Ксиланаза этого же организма принадлежащая к 10-му семейству расщепляет ксилан до ксилозы и ксилобиозы [147]. P. Biely с соавторами [33], исследовав продукты расщепления ксилана несколькими ксиланазами 10-го и 11-го семейств, сделал вывод, что ксилотриоза является минимальным олигосахаридом, отщепляемым ксиланазами 10-го семейства, а для ферментов 11-го семейства - длина минимального отщепляемого фрагмента равна 4-5 остатков. На первый взгляд приведенные выше данные противоречат этому выводу, но это противоречие кажущееся, так как в случае ксиланаз 10-го семейства ксилоза и ксилобиоза может образовываться при расщеплении четырёх- и пятичленных ксилоолигосахаридов, соответственно, а ксилобиоза и ксилотриоза в случае ксиланаз 11 -го семейства - в результате расщепления олигосахаридов размером 6-8 ксилозных остатков. Вывод о минимальных размерах олигосахаридов, отщепляемых ферментами обоих типов, подтверждается, также, структурой их активных центров, о чем мы будем говорить далее.
Обобщая литературные данные, можно заключить, что, обычно, ксиланазы 11-го семейства расщепляют ксилан на более крупные фрагменты, и лучше связываются с более длинными олигосахаридами по сравнению с ксиланазами 10-го семейства. 1.2.4. Побочные активности грибных ксиланаз. У многих ксиланаз была обнаружена минорная целлюлазная активность [39, 70, 145, 146, 156]. Например, ксиланаза из Aspergillus niger IBT-90 обладает целлюлазной активностью, что является преимуществом при использовании этого фермента в пекарном деле [146]. Мажорная ксиланаза Fusarium oxysporum также проявляла целлюлазную активность (в 15-30 раз более слабую по сравнению с ксиланазной) [39]. Ксиланаза A. niger (28 кДа и pi 3,65) проявляла активность по отношению к карбоксиметилцеллюлозе, арабиногалактану, глюкоманнану и р-нитрофенил-Р-О-глюкопиранозиду (то есть целлюлазную и P-D-глюкозидазную активности) [145]. У ксиланазы P. chrysogenum не было обнаружено целлюлазной активности, но она гидролизовала р-нитрофенилцеллобиозид [81]. Многие ферменты проявляют трансферазную (трансгликозидазную) активность [39, 147, 158, 178]. При исчерпывающем гидролизе ксилана некоторыми ферментами образуется значительное количество ксилозы, даже если фермент не обладает Р-ксилозидазной активностью. Так происходит, например, в случае ксиланазы P. chrysogenum (10-ое семейство), где ксилоза и ксилобиоза являются главными продуктами гидролиза ксилана, хотя этот фермент не обладает Р-ксилозидазной активностью [81]. Этот результат можно объяснить расщеплением коротких олигосахаридов, о чем мы говорили в предыдущем разделе. Следует иметь в виду, что в некоторых случаях обнаружение побочных активностей может быть вызвано недостаточной очисткой фермента или субстрата, как, например, в случае ксиланазы Т. longibrachiatum, когда обнаруженная целлюлазная активность объяснилась загрязнением препарата целлюлозы ксиланом [148]. 1.2.5. Структура ксиланаз 10 и 11 семейства. Все представленные в таблице 1.1 ферменты являются мономерами. Для некоторых ферментов с помощью рентгеноструктурного анализа была определена трехмерная структура [74, 107, 154, 166, 167].
Регуляция промоторахуп2 Т. reesei
Регуляция продукции ксиланаз грибами рода Penicillium при росте на простых синтетических средах изучена не так хорошо, как у A. niger, однако, полученные результаты позволяют отметить некоторые закономерности и различия в регуляции синтеза этих ферментов у грибов, принадлежащих к разным видам рода Penicillium. P. chrysogenum синтезирует ксиланазу при росте на ксилане и ксилозе в качестве единственных источников углерода [80, 185]. Для P. pinophilum, P. persicinum и P. brasilianum было показано, что синтез ксиланаз индуцируется ксилозой, и репрессируется глюкозой [94]. У P. canescens F178 (ВКПМ) синтез ксиланазы индуцируется L-арабинозой и L-арабитолом. D-ксилоза и D-ксилитол также индуцируют синтез ксиланазы, но в значительно меньшей степени. Глюкоза репрессирует синтез ксиланазы [2, 15]. У P. canescens 10-Юс репрессию синтеза ксиланазы вызывают глюкоза, ксилоза и лактоза [75]. Приблизительно равный уровень ксиланазной активности обнаруживается в культуральной жидкости P. simplicissimum как при росте на D-ксилозе, так при росте на L-арабинозе, в качестве единственных источников углерода. (Вавилова Е.А Винецкий Ю.П, неопубликованные данные). Как упоминалось ранее, P. purpurogenum синтезирует две ксиланазы, с высокой (33 кДа) и низкой (23 кДа) молекулярными массами (Табл. 1.1). Синтез низкомолекулярного фермента (ХупВ) индуцируется ксиланом из березы, ксилозой и ксилитолом, в то время как синтез высокомолекулярной ксиланазы (ХупА) происходит только при росте на ксилане из овсяной шелухи [36]. Основное различие в составе двух ксиланов состоит в том, что ксилан овсяной шелухи содержит значительные количества L-арабинозы, в то время как в березовом ксилане этого сахара практически нет [19, 106, 128]. Таким образом можно предположить, что синтез ХупА индуцируется арабинозой. Сходный результат был получен для P.janthinellum [46]. У P. funiculosum, у которого были идентифицированы четыре ксиланазы (Табл. 1), максимальная ксиланазная и целлюлазная активность культуральной жидкости наблюдалась при использовании в качестве источника углерода целлюлозы. Синтез ксиланаз, но не целлюлаз, также наблюдался при росте на ксилане [141]. Суммируя перечисленные факты можно заключить, что у грибов рода Penicillium существуют механизмы индукции синтеза ксиланаз целлюлозой, ксилозой и арабинозой, и у грибов разных видов эти механизмы представлены в разной степени. Кроме того, синтез ксиланаз у Penicillium подвержен катаболитной репрессии. В промоторных областях многих генов, кодирующих ксиланазы Penicillium, были обнаружены консенсусные последовательности сайтов связывания XlnR [21, 35, 36, 185] и СгеА [35, 36, 185]. Однако нет данных о клонировании генов, кодирующих какие-либо регуляторы транскрипции ксиланолитических генов Penicillium. 1.3.9. Регуляция транскрипции генов ксиланаз в зависимости от рН среды.
Транскрипцию генов A. nidulans в ответ на изменение рН среды регулирует транскрипционный фактор РасС [164]. Этот белок становится активным при повышении рН среды, и активирует транскрипцию генов, индуцируемую щелочными условиями, одновременно репрессируя транскрипцию генов, экспрессия которых происходит в кислых условиях. В некоторых работах отмечается зависимость продукции ксиланаз мицелиальными грибами от рН окружающей среды [35, 36, 90, 116], однако роль РасС в регуляции продукции ксиланаз в зависимости от рН показана только для ксиланаз А и В A. nidulans [116]. 1.4. P. canescens F178 (ВКПМ). P. canescens F178 - природный почвенный изолят, который был выделен как природный продуцент р-галактозидазы, и до настоящего времени используется для производства этого фермента [1]. Он характеризуется большой продукцией внеклеточного белка (до 5 г/л), большая часть которого состоит из нескольких ферментов, высокой скоростью роста на недорогих ферментационных средах, низким количеством секретируемых протеиназ. Все эти свойства делают его перспективным биотехнологическим объектом. Некоторое время назад, был клонирован ген, кодирующий В-галактозидазу P. canescens ВКПМ F178, и введен в геном этого гриба в нескольких копиях, в результате чего продукция В-галактозидазы была увеличена в 12 раз [12]. Кроме того, исследования свойств этого организма, показали, что культуральная жидкость, полученная при его росте в жидкой среде со свекловичным жомом в качестве источника углерода, кроме 0-галактозидазной, обладает значительной a-L-арабинофуранозидазной и эндо-ксиланазной активностью, и что синтез всех трех ферментов индуцируется арабинозой [15]. Кроме того было показано, что ксилоза также индуцирует синтез В-галактозидазы и ксиланазы, но в значительно меньшей степени чем арабиноза [2]. Ген Р-галактозидазы P. canescens был введен в штамм A. nidulans, где его транскрипция продолжала эффективно индуцироваться арабинозой, и репрессироваться глюкозой [23]. Факт индукции синтеза ксиланазы арабинозой является интересным отличием P. canescens F178 от описанных выше грибов рода Aspergillus и Trichoderma. К началу нашего исследования, этот факт давал основания предполагать наличие общего транскрипционного контроля для генов, кодирующих ксиланазу, Р-галактозидазу и a-L-арабинофуранозидазу Р. canescens, как это было описано для арабиназ A. nidulans в главе 1.4.3. Основными компонентами внеклеточного комплекса P. canescens F178, при его росте на свекловичном жоме, кроме Р-галактозидазы, a-L-арабинофуранозидазы и ксиланазы являются, арабиноксилан-арабинофурангидролаза (70 кДа) и эндо-1,3/1,4-глюканаза (40 кДа) [18]. В этой же работе были определены молекулярный вес a-L-арабинофуранозидазы P. canescens F178 (60 кДа), молекулярный вес ксиланазы (31 кДа), её изоэлектрическая точка (3,8-4,0), температурные и рН оптимумы (55 С и 5,9, соответственно) и ряд других свойств. Следует отметить, что продукция Р-галактозидазы, ксиланазы и арабинофуранозидазы P. canescens F178 многократно превосходит продукцию этих ферментов изученными дикими штаммами Aspergillus и Penicillium. Интересной особенностью P. canescens F178 является крайне медленный рост, при использовании L-арабинозы в качестве единственного источника углерода. В работе Е.А. Вавиловой и др. [3] было показано, что в пути катаболизма арабинозы у P. canescens F178 имеется дефект на уровне фермента арабитолдегидрогеназы, приводящий к нарушению катаболизма арабинозы и внутриклеточному накоплению L-арабитола. По-видимому, именно внутриклеточное накопление L-арабитола вызывает повышенный синтез ферментов, индуцируемых арабинозой, прежде всего Р-галактозидазы, ксиланазы и a-L-арабинофуранозидазы.
Определение числа копий xylA в геноме мультикопийного продуцента
По 50 мкг ДНК мультикопииного и исходного штаммов расщепляли ферментами рестрикции Sail и EcoRl одновременно, осаждали этанолом и растворяли в 160 мкл воды. На два 1% агарозных геля наносили раствор ДНК обоих штаммов в количестве 24, 16, 12, 8, 6, 4, 3, 2, 1,5, 1 мкл (т.е. в разведениях в 1,5 раза). Фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза, по окончании которого ДНК переносили на нейлоновые фильтры, один из которых гибридизовали с фрагментом ДНК гена Р-галактозидазы P. canescens bgaS (ген находящийся в геноме в одной копии), а второй - с фрагментом xylA. Количество ДНК уравнивали по сигналу от bgaS, а количество копий xylA определяли по разведению, при котором яркость полосы мультикопииного штамма совпадала с яркостью сигнала однокопийного штамма. 2.22. Клонирование xlnR P. canescens. Ген был клонирован из библиотеки генов в фаговом векторе AEMBL4. В качестве зонда для скрининга библиотеки и блот-гибридизации фаговой ДНК мы использовали тот же фрагмент ДНК A. niger, что и при анализе геномной ДНК P. canescens. В результате скрининга нами был выделен индивидуальный фаговый клон, ДНК которого содержала область, изображенную на Рис. 2.2а. Эта область была субклонирована в плазмидный вектор pUC57 в виде трех перекрывающихся фрагментов: ВатШ- ВатШ размером около 6 т.п.н., Sall-Sall - около 3 т.п.н., и ВатШ- ВатШ - около 1,8 т.п.н. Рис. 2.2а. Полученные таким образом плазмиды были обозначены как pXR55, рМ2 и pXR175, соответственно. Плазмида pXR175 была расщеплена ферментом рестрикции ЕсоКХ, частично расщеплена ферментом BamHl, образовавшийся фрагмент EcoRl-ВатШ (вместе с фрагментом ВатШ- ВатШ) был выделен из агарозного геля, и клонирован в плазмиду pXRM2, расщепленную ферментами EcoRl и ВатШ, в результате чего была получена плазмида pXR07, содержащая около 0,7 т.п.о. 5 -нетранслируемой области xlnR и около 0,15 т.п.н. 3 -нетранслируемой области (Рис. 2.26). Затем фрагмент Bsp6&\ - Bcul в плазмиде pXR55 был заменен фрагментом Bsp6%\-Bcu\ из плазмиды pXR07, в результате чего была получена плазмида pXR57, содержащая около 0,7 т.п.о. 5 -нетранслируемой области и 3,8 т.п.н. З -нетранслируемой области xlnR (Рис. 2.26). Мы заменили кодирующую область xlnR P. canescens геном нитратредуктазы (niaD) мицелиального гриба Р. chrysogenum под управлением собственного промотора. Для этого, мы синтезировали олигонуклеотиды niaD: 5 - TGCAGAATTCTTCTCTTCGCGGACTG-3 и niiA: 5 -GGCATCGGATCCATATGACTGAACAATGTGAAG-3 , содержащие сайты рестрикции EcoRl и ВатШ, соответственно, и с помощью ПЦР амплифицировали соответствующий фрагмент ДНК P. chrysogenum. Полученный фрагмент мы обработали ферментами EcoRl и ВатНІ и клонировали в плазмидный вектор pBluescript II SK по сайтам EcoRl и ВатШ, в результате чего получили плазмиду pPChniaD (Рис. 2.3). Она была проверена на способность комплементировать мутацию niaD в P. canescens РСА-10. Затем мы заместили фрагмент Bgl\\-Cla\ в плазмиде pXR53 фрагментом ВатШ-Clal из pPChniaD. Полученная плазмида была названа pXRN53 (Рис. 2.3). Плазмиду pXRN53 расщепляли ферментом рестрикции ВатШ, при этом в реакционную смесь добавляли фрагмент Клёнова ДНК-полимеразы I и dNTP для достройки концов образующихся фрагментов (для затруднения образования кольцевых структур из получившихся фрагментов при последующей трансформации гриба). Затем ДНК осаждали изопропиловым спиртом, промывали 70% этанолом, и растворяли в деионизованной воде до концентрации 1мкг/мкл. Полученный таким образом линейный фрагмент, содержащий ген niaD мицелиального гриба P. chrisogenum, фланкированный 0,7 т.п.н. 5 - нетраслируемой и 3,7 т.п.н. З -нетраслируемой областей xlnR P. canescens, использовали (не отделяя от расщепленного вектора) для трансформации P. canescens РСА10. Для трансформации брали 2-4 мкг ДНК на 107 протопластов. Трансформанты отбирали среде с NaNOj, в качестве единственного источника азота, затем пересевали на минимальную среду с NaN03. Отбор трансформантов, в которых произошла замена xlnR на niaD, производили с помощью ПЦР в два этапа. На первом, в качестве матрицы для реакции использовали суспензию спор, и определяли трансформанты, у которых замена не произошла. Реакция проводилась с парой праймеров pxlnR2 (5 GCAGTCGCCACTTCTACCA-3 ) и pxlnR3 (5 -CCAATGGTGAGTTCCAGCAGT-3 ), отжигающихся на кодирующей части xlnR. В случае дикого аллеля гена, синтезировался фрагмент размером около 0,9 т.п.н., в случае делеции - не синтезировалось никакого фрагмента. Из тех трансформантов, в реакции со спорами которых фрагмент 0,9 т.п.н. не синтезировался, выделяли ДНК, которую использовали в реакции с парой праймеров pcxlnR51 (5 -GATCCGAATAGACCAAACCAT-3 ) и pcxlnR31 (5 -GTCGACCACATGCTTCGT-3 ). Эти праймеры отжигаются на участки, фланкирующие заменяемую область. Размер амплифицируемого фрагмента в случае дикого аллеля xlnR - 4 т.п.о, а в случае делеции - 4,8. Затем делецию подтверждали гибридизацией геномной ДНК с фрагмемтом xlnR, полученным ПЦР с праймерами pxlnR2 и pxlnR3 (см. выше) и фрагментом niaD P. chryzogenum Bglll-EcoKV (Рис. 2.3). Такая двухступенчатая методика была применена потому, что при проведении реакции со спорами в качестве матрицы, обычно не нарабатываются фрагменты большого размера. Следует отметить, что первоначально для делеции делеции xlnR мы сконструировали плазмиду pXRniaD с геном niaD A. niger, фланкированным фрагментами xlnR P. canescens размером 0,8 и 1,4 т.п.н., и не отобрали ни одного штамма с делецией из 60 трансформантов, в то время как На Рис. 3.4 приведено сравнение интрон-экзонной структуры xylA P. canescens и генов ксиланаз 10-го семейства некоторых грибов, а на Рис. 3.5 сравнение аминокислотных последовательностей белков, кодируемых этими генами. Можно видеть, что структуры генов P. canescens и P. simplicissimum [154] аналогичны. Более того, аминокислотные последовательности зрелых белков, кодируемых этими генами, совпадают (структура лидерного пептида ксиланазы P. simplicissimum в цитируемой работе не приведена), что, по-видимому, говорит о таксономической близости этих организмов. Также можно видеть, что аминокислотные последовательности всех белков близки, однако наблюдаются различия в интрон-экзонной организации генов. Так, у P. chrysogenum [80] и A. kawachii [88] области генов соответствующие, второму экзону xylA P. canescens разделены интроном, в результате чего ген P. canescens содержит на один интрон (и, соответственно, экзон) меньше, чем соответствующие гены этих грибов. Область гена P. purpurogenum [37], соответствующая пятому и шестому экзонам xylA P. canescens, объединена в одни экзон. Также следует отметить, что нуклеотидные последовательности границ шестого интрона xylA P. canescens (Рис. 3.3) не являются каноническими [79], также как границы соответствующего интрона Р. chrysogenum и P. simplicissimum. В то же время, границы соответствующего интрона A. kawachii соответствуют каноническим донор-акцепторным последовательностям "GT-AG". Электрофорез белков культуральной жидкости полученных трансформантов показал, что введение плазмиды не привело к появлению новых белков, но вызвало увеличение количества белка размером 31 кДа (рис. З.б.а). Увеличение транскрипции клонированного гена также было подтверждено гибридизационным анализом мРНК (рис. 3.6.6). Таким образом мы показали, что клонированный нами ген действительно кодирует мажорную эндо-1,4-Р-ксиланазу P. canescens, что восьмикратное увеличение числа его копий приводит к пропорциональному увеличению количества того, правильно ли прошли эти процессы. В связи с этим встал вопрос, справляются ли системы, отвечающие за посттрансляционную модификацию ксиланазы с почти восьмикратным увеличением количества белка.
Клонирование гена P. canescens, кодирующего регулятор транскрипции ксиланолитических генов
Как было показано в обзоре литературы, у ряда грибов рода Aspergillus ключевую роль в регуляции продукции ксиланолитических и целлюлолитических ферментов играет продукт гена xlnR - активатор транскрипции ксиланолитических и целлюлолитических генов XlnR. Гомолог этого гена также был обнаружен у гриба Т. reesei, у которого его продукт активирует транскрипцию однго из двух ксиланазных генов. Мы решили выяснить, есть ли у P. canescens ген, гомологичный xlnR A. niger, и если есть, то какова его роль в регуляции продукции ксиланазы и других внеклеточных ферментов этим организмом. Эта часть работы состояла из следующих этапов: - поиска в геноме P. canescQns уникального участка с похожей структурой - клонирования этого участка, определение и анализ его нуклеотидной последовательности - делеция и амплификация этого участка, для определения его физиологической роли. 3.3.1. Анализ геномной ДНК P. canescens и клонирование гена. С помощью ПЦР мы получили фрагмент ДНК xlnR A. niger, который использовали в качестве зонда для гибридизации по Саузерну геномной ДНК P. canescens. После подбора условий отмывки мембраны от неспецифически связавшегося зонда, был получен автограф, представленный на Рис.3.12. Можно видеть, что на автографе наблюдаются достаточно четкие гибридизационные сигналы, что говорит о специфичности связывания зонда, и, следовательно, о возможности использовать его для скрининга геномной библиотеки. Более того, при расщеплении ДНК ферментами Sail и Hindlll в Одновременно с ксиланазной активностью, в культуральной жидкости измерялась активность р-галактозидазы. Результаты измерений также представлены в таблице 3.5. Из приведенных данных видно, что делеция xlnR влияет на продукцию р-галактозидазы значительно слабее, чем на продукцию ксиланазы. К тому же это влияние неоднозначно. Таким образом, продукция р-галактозидазы у P. canescens, находится под контролем другого регулятора, несмотря на то, что она индуцируется арабинозой, также как продукция ксиланазы. Также было показано, что введение дополнительных копий xlnR увеличивает продукцию ксиланазы (Табл. 3.6, Рис. 3.156). Анализ мРНК штаммов с делецией xlnR и дополнительными копиями этого гена, выращенных на свекловичном жоме, показал, соответственно, снижение и увеличение количества ксиланазной мРНК, что говорит о том, что делеция xlnR влияет именно на транскрипцию ксиланазного гена. (Рис. 3.15а). 3.3.3. Роль xlnR в регуляции продукции других ферментов. Мы измерили ряд ферментативных активностей в культуральной жидкости штаммов с делецией и дополнительными копиями xlnR, выращенных на среде со свекловичным жомом. Результаты приведены в таблице 3.6. Из представленных данных видно, что у штаммов с делецией xlnR значительно уменьшена не только продукция эндо-Р-1,4-ксиланазы, но, также, других ферментов с ксиланолитической активностью (арабиноксилан-арабинофураногидролазы, р-ксилозидазы и Р-целлобиазы), в то время как продукция Р-галактозидазы и a-L-арабинофуранозидазы изменялась незначительно.
Активности Р-глюкозидазы и эндо-Р-1,4-глюканазы так же изменялись мало, оставаясь весьма низкими. Электрофоретическая картина секретируемых белков исследуемых штаммов приведена на Рис. 3.156. Можно видеть, что штаммом с утраченной функцией гена xlnR синтезируются два мажорных белка - р-галактозидаза (полоса в области 120 кДа) и a-L-арабинофуранозидаза (полоса в области 70 кДа), в то время другие ферменты, проявляющиеся на электрофорезе в виде заметных полос, практически не секретируются, в том числе, не секретируется мажорная ксиланаза (полоса в области 31 кДа). Увеличение числа копий xlnR увеличивало активность тех же ферментов, активность которых уменьшалась у штамма с удалённым геном xlnR. Из Рис. 3.156 видно, что среди всех секретируемых белков значительно увеличивался вклад компонентов с массой 50-60 кДа, а также появлялись новые электрофоретические полосы, соответствующие белкам с массой порядка 20 кДа, возможно, соответствующие ксиланазе В. Затрагивались и некоторые целлюлитические ферменты: в мультикопийном варианте P.canescens XR53 возрастала секреция Р-целлобиазной и эндо-глюканазной 1. Показано наличие у P. canescens F178 двух генов xylA и xylB, первый из которых кодирует ксиланазу 10-го семейства, а второй - 11-го. 2. Показано, что продукция ксиланазы P. canescens обусловлена, главным образом, активностью гена xylA, в то время как вклад xylB в общую продукцию ксиланазы незначителен. 3. Клонирован полный ген xylA, и показано, что введение дополнительных копий этого гена в исходный штамм пропорционально увеличивает продукцию ксиланазы. Это доказывает, что транскрипция xylA является лимитирующим фактором в продукции ксиланазы P. canescens. 4. Клонирован ген xlnR, кодирующий позитивный регулятор транскрипции гена мажорной ксиланазы P. canescens xylA, и показано что его амплификация приводит к увеличению транскрипции этого гена. 5. Показано, что xlnR необходим для индукции синтеза ксиланазы, обусловленной как L-арабинозой, так и D-ксилозой. 6. Показано, что xlnR играет ключевую роль в продукции целого ряда ксиланолитических ферментов мицелиальным грибом P. canescens, и что увеличение числа копий этого гена приводит к увеличению синтеза этих ферментов. 7. Показана перспективность использования P. canescens F178 в качестве базового штамма для создания промышленного штамма продуцента.
