Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
2. Обзор литературы. 9
2.1. Полиморфные маркеры. Типы полиморфизмов и методы их исследования 9
2.1.1. Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний 13
2.2. Характеристика многофакторных заболеваний, исследованных в данной работе 14
2.2.1. Ишемическая болезнь сердца (ИБС). Основные аспекты этиологии и патогенеза ИБС 14
2.2.1.1. Генетические факторы риска ИБС 17
2.2.2: Инфаркт миокарда (ИМ). 21
2.2.2.1. Генетические факторы риска ИМ. 22
2.2.3. Сахарный диабет типа 2 (СД 2). Сосудистые осложнения, возникающие при сахарном диабете типа 2 23
2.2.3.1. Артериальная гипертония при сахарном диабете типа 2. 26
2.2.3.2. Ишемическая болезнь сердца при сахарном диабете типа 2. 30
2.3. Характеристика исследованных в работе генов и полиморфных маркеров 37
2.3.1. Ренин-ангиотензиновая система (РАС) 37
2.3.1.1 Ген ангиотензиногена (AGT). 38
2.3.1.2. Ген рецептора ангиотензина II типа 1 (AGT1R) 41
2.3.1.3. Гомоцистеин. Ген метилентетрагидрофолат-редуктазы (MTHFK) 44
3. Материалы и методы. 50
3.1. Реактивы и ферменты 50
3.2. Буферные растворы 50
3.3. Формирование групп больных и здоровых индивидов 51
3.4. Выделение геномной ДНК человека методом фенол/хлороформной экстракции. 51
3.5. Аплификация ДНК 51
3.6. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами 52
3.7. Электрофоретическое разделение ДНК 53
3.8. Статистическая обработка результатов 53
3.8.1. Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов. Точный критерий Фишера. Поправка Бонферрони. 53
3.8.2. Оценка относительного риска. Odds ratio. Доверительный интервал 54
4: Результаты и их обсуждение 56
4.1. Изучение ассоциации полиморфных маркёров ряда генов-кандидатов с ИБС. 56
4.1.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров 7774Ми A/2357I гена > AGTcHBC: 57
4.1.2 Исследование ассоциации полиморфных маркеров А1166С и A(-153)G гена AGT1R сИБС 59
4.1.3. Исследование ассоциации полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена MTHFR сИЕС. 62
4.2. Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с ИМ 65
4.2.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров 7774Ми М235Тгена AGTcHM; 66
4.2.2: Исследование ассоциации полиморфных маркеров А1166С и A(-153)G гена AGTJRcHMl 69
4.2.3. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Сб77ТиА1298С гена MTHFR с ИМ. 71
4.3 1 Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с ИБС при СД типа 2. 73
4.3.1.1 Исследование ассоциации полиморфных маркеров 7774Ми М235Тгена AGTc ИБС при СД типа 2. 74
4.3.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров А1166С и A(-153)G гена AGT1R с ИБС при СД типа2. 76;
4.3.3. Исследование ассоциации полиморфных маркеров С677ТиА1298С гена MTHFR с ИБС при СД типа2. 78
4.4.1 Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с артериальной гипертонией при СД типа 2. 80;
4.4.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров 7774Ми M235I'гена.; AGTc артериальной гипертонией при СДтипа2 81
4.4.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров All66С и A(-153)G AGT1R с артериальной гипертонией при СД типа 2. 83
Выводы. 86
- Характеристика многофакторных заболеваний, исследованных в данной работе
- Характеристика исследованных в работе генов и полиморфных маркеров
- Буферные растворы
- Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с ИМ
Введение к работе
Исследование молекулярно-генетических; основ1, многофакторных заболеваний ? относится к одной из наиболее серьезных задач современной генетики;
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), в >, том числе гипертония * и ишемиче-ская болезнь сердца, по-прежнему остаются основной проблемой в медицине развитых стран мира в связи с высокой заболеваемостью, инвалидизацией и смертностью..
Для- подобных, многофакторных заболеваний характерен; сложный» механизм формирования фенотипа, являющегося результатом взаимодействия генетических факторов і с факторами ? внешней * среды. Однако, для ? каждого конкретного > заболевания * можно выделить группу, так называемых, генов-кандидатов,- продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии.
Одним из наиболее перспективных направлений современной молекулярной генетики > заболеваний является поиск полиморфных маркеров в; генах-кандидатах: и; выявление их ассоциации с наследственными заболеваниями.
При исследовании ассоциации. сравнивают; распределение частот аллелей и: генотипов1: полиморфного, маркера; расположенного» внутри5 или; рядом с геном-кандидатом, в группах больных и здоровых доноров. Наличие достоверных различий в распределении данных частот свидетельствует об ассоциации полиморфного маркера с заболеванием.
Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного пациента.
Цель и задачи работы..
Целью данной работы явилось изучение ассоциации полиморфных маркеров нескольких генов-кандидатов: ангиотензиногена (AGT), рецептора ангиотензина II типа 1 (AGT1R) и метилентетрагидрофолат-редуктазы (MTHFR) с развитием ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда и гипертонии при сахарном диабете типа 2 (СД 2).
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучение ассоциации полиморфных, маркеров? Т174М* и- М235Т гена ангиотензиногена= с ишемической болезнью сердца; инфарктом; миокарда; ю гипертонией при сахарном диабете типа 2.
Изучение ассоциации полиморфных маркеров А1166С wA(-153)G гена рецептора ангиотензина II типа 1 с ишемической болезнью сердца, инфарктом миокарда и гипертонией при сахарном диабете типа 2.
Изучение ассоциации -полиморфных маркеров С677Т и;А1298С гена метилен-тетрагидрофолатредуктазы с ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В данной' работе впервые исследована ассоциациям полиморфного маркера' М235Т'гена-ангиотензиногена, а также полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолат-редуктазы с ишемической болезнью сердца, инфарктом миокарда и гипертонией при сахарном диабете типа 2 среди русских пациентов г. Москвы. Для полиморфного маркера ТІ 74М гена ангиотензиногена в данной популяции впервые. изучена ассоциация с развитием ишемической болезни сердца и гипертонии при сахарном диабете типа 2. Для полиморфного маркераЛ 1166С гена рецептора ангиотензина II типа 1 у русских г. Москвы впервые исследована ассоциация с развитием гипертонии; при сахарном диабете типа 2. Впервые в мире осуществлен анализ ассоциации полиморфного маркера A(-153)G гена ангиотензина II типа 1 с развитием ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда и гипертонии при сахарном диабете типа 2.
Для полиморфных маркеров 77 74М и М235Т гена ангиотензиногена не показано ассоциации с сердечно-сосудистыми патологиями. Для полиморфного маркера А1166С гена рецептора ангиотензина II типа 1 показана ассоциация с гипертонией при диабете типа 2. Факторами риска развития данной патологии является носительство аллеляЛ и< гомозиготного генотипа АА, в то время как аллель С и гомозиготность по данному ал-лелю связаны с пониженным риском развития заболевания. Для полиморфного маркера A(-153)G этого же гена обнаружена ассоциация с ишемической болезнью сердца и гипертонией при сахарном диабете типа 2. Генетическим маркером повышенного риска развития данных заболеваний является аллель G, тогда как аллель А:п генотип АА; напротив, являются маркерами предохраняего действия. Полиморфный маркер С677Т гена метилентетрагидрофолат-редуктазы не ассоциирован с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Для полиморфного маркера А1298С этого же гена показана ассоциация с ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда. Установлено, что носительство аллеля С и гомозиготного генотипа СС предрасполагает к развитию ишемической бо-
лезни сердца. Аллель А является защитным аллелем. При ишемической болезни сердца, отягощенной сахарным диабетом типа 2, риск развития ИБС повышен у пациентов, в геноме которых присутствует аллель С. Вероятность развития ИМ, также значительно возрастает в группе больных ишемической болезнью сердца, гомозиготных по аллелю С.
Все вышеизложенные результаты получены впервые. Они позволяют оценить вклад генетических факторов риска в развитие сердечно-сосудистых заболеваний и диабетических ангиопатий для московской популяции и могут быть использованы для прогнозирования течения и профилактики данных заболеваний и их осложнений.
2: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Характеристика многофакторных заболеваний, исследованных в данной работе
Ишемическая болезнь сердца - состояние, характеризующееся относительной v или. абсолютной коронарной недостаточностью. Это заболевание, при котором нарушается соответствие между потребностями сердца в кровоснабжении и его реальными! возможностями. Основными факторами риска ИБС являются: артериальная гипертензия, гипер-холестеринемия, курение, сахарный диабет, гиподинамия, ожирение, мужской пол и. генетическая предрасположенность. В настоящее время патогенез ишемической болезни сердца связывают не только с атеросклерозом венечных, артерий; как причиной чисто механической обструкции крови. Ясно, что к звеньям патогенеза ишемической болезни сердца следует отнести: также дизрегуляцию микроциркуляции в системе венечных артерий, которая, в частности, связана с нарушениями влияний эндотелиальной клетки- на; функции микрососудов. Известно, что степень сокращений миоцитов стенок венечных артерий изменяется- под действием агентов системной: регуляции сосудистого тонуса (ренин-ангиотензиновой системы, РАС). Упрощенно РАС можно представить следующим образом: ангиотензиноген — ангиотензин Г— ангиотензин II - рецепторы ангиотензина. II - эффекты. Ангиотензиноген расщепляется почечным ферментом.ренином с образованием неактивного пептида ангиотензина I. Ангиотензин 1-превращающий фермент (АПФ) расщепляет ангиотензин I до вазоактивного октапептида ангиотензина II. Ангиотензин- II является констриктором венечных артерий. Возбуждение бета-адренорецепторов; сосудистойг стенки расширяет сосуды, at возбуждение альфа-адренорецепторов приводит к вазоспазму и вазоконстрикции. Особенностью регуляции сосудистого тонуса в системе венечных артерий является его особо выраженная зависимость от функционального состояния эндотелия. Можно выделить несколько механизмов, формирующих первичные: повреждения сосудистой стенки. Во-первых, это окислительная модификация; липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Экспериментальные исследования на культурах клеток и животных моделях показали, что окислительный стресс может быть основным повреждающим фактором в» процессе развития атеросклеретической бляшки і [140].
Установлено, что активные формы кислорода связаны с развитием атеросклероза и различных ишемических синдромов [284,204]. Однако механизмы, ведущие к окислению ЛПНП in vivo, до сих пор до конца не изучены. Несмотря на обилие в плазме мощных антиокислительных механизмов, все же предполагают, что окисление липидов происходит в сосудистой стенке. [88]; Иммунохимические исследования; с использованием моноклональных антител, специфически распознающих связывающиеся с белками продукты окисления липидов, обнаружили продукты окисления ЛПНП прямо в стенке артерий; Более того, окисленные ЛПНП были выделены из атеросклеретических бляшек [19]. Окисленные ЛПНП стимулируют высвобождение, хемотаксического фактора (MCP-I) из эндотелиальных клеток, а также колониестимулирующего фактора, оказывающего влияние на пролиферацию клеток. Помимо этого они сами становятся хемо-аттрактантамиі для моноцитов. Модифицированные ЛПНП обладают антигенными свойствами и могут образовывать иммунные комплексы с антителами..Эти комплексы могут также повреждать, артериальную стенку, накапливаться в экстрацеллюлярном матриксе и подвергаться захвату макрофагами при участии макрофагальных Fc-рецепторов [235]. Перекисно-модифицированные ЛПНП стимулируют образование эн-дотелина [23], который вызывает сокращение артерий, а также ингибируют высвобождение окиси азота. Таким образом, участие ЛПНП в атерогенезе и развитии ИБС опосредуется не только через влияние на состояние сосудистой стенки, но и через изменение вазомоторных свойств коронарных артерий. Во-вторых, это дисфункция эндотелия сосудистой стенки. Эндотелий вовлечен в катаболизм ЛПНЩ который происходит после захвата и интернализации липопротеи-новых частиц при участии рецепторов ароВ и ароЕ. Липопротеинлипаза функционирующая на поверхности эндотелия расщепляет триглицериды в хиломикронах и липо-протеинах очень низкой плотности - (ЛПОНП). Помимо этого эндотелий продуцирует многочисленные факторы роста, регуляторы адгезии (тромбоцитов, и т.д. Например, в ответ на увеличение ЛПНП и холестерина в плазме эндотелиал ьные клетки начинают локально увеличивать экспрессию VCAM-1, адгезивной молекулы, связанной с миграцией моноцитов [294]; Дисфункция эндотелия является необходимым условием для развития преатеросклеротических повреждений; В-третьих, может происходить изменение активности окиси азота. Окись азота (NO), образующаяся из L-аргинина под действием NO-синтетаз, является мощным ва-зодилататором. Помимо этого окись азота проявляет защитное антиокислительное действие, активно взаимодействуя со свободными радикалами кислорода, однако при этом t теряет свою вазодилатирующую способность (293). При взаимодействии супероксида-ниона с окисью азота образуется пероксинитрат (ONOO-), также обладающий сильным-окислительным потенциалом. При этом переключение окиси азота на образование пе-роксинитрата лишает ее возможности проявить защитный эффект. Недавние исследования показывают прямую химическую роль активных форм азота в развитии окисли- тельной модификации липидов и белков сосудистой стенки [88]. Свободные радикалы также способствуют ускоренной деградации NO [170], что также нарушает вазодилата-цию сосудов. Коронарные микрососуды обладают ауторегуляцией: за счет сосудорасширяющего действия окиси азота и нейрогуморальных влияний, представляя собой гибкую, хорошо интегрированную и стабильную систему.
Однако, наличие: атеросклеротиче-ских бляшек, закрывающих более 50% просвета сосуда, может замедлять или нарушать механизмы ауторегуляции,- приводя і к дисбалансу между потребностями миокарда и реальным кровотоком. Частично этот дисбаланс компенсируется параллельной коллатеральной І сетью сосудов, которая развивается под воздействием ангиогенных факторов ишемизированного миокарда. Дисбаланс нарастает с дальнейшей прогрессией атеросклероза коронарных артерий и проявляется приступами стенокардии. 2.2.1.1. Генетические факторы риска ИБС. Генетическая предрасположенность играет немаловажную роль в развитии и прогрессировании ИБС, а теснейшая связь атеросклероза и гиперхолестеринемии с наследственными факторами выдвигает ИБС на уровень генетически обусловленных заболеваний. Атеросклероз - результат влияния множества факторов, однако, влияние внешних факторов риска: всегда дополняется, генетической? предрасположенностью. Это было подтверждено при исследовании моно- и дизиготных близнецов [130]. Накоплено много данных о вовлеченности продуктов различных генов в развитие ; коронарного атеросклероза, ишемической болезни сердца и, инфаркта миокарда. Гены-кандидаты, продукты которых связаны с развитием сердечно-сосудистых патологий, можно разделить на несколько основных групп; Во-первых, это гены, связанные с регуляцией сосудистого тонуса (гены ренин-ангиотензиновой системы, гены NO-синтетаз; а также ген адренергического рецептора — а2В).- Ассоциация полиморфного маркера I/D гена ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ) с сердечно-сосудистыми патологиями была показана во многих работах. В частности, генотип DD предрасполагает к развитию ишемической болезни сердца [4, 266]. Аллельный вариант Г полиморфного маркера М235Т гена ангиотензиногена (A GN) также ассоциирован с сердечно-сосудистыми патологиями. Для полиморфных маркеров 1/D генаNO-синтетазы 2 (NOS2) И—Т786Сгена NO-синтетазы 3 (NOS3) установлена ассоциация с ишемической болезнью сердца [157, 4]. Два полиморфных маркера 4a/4b \i.Glu298Asp гена эндотелиальной NO-синтетазы 3 также связаны с развита- ем сердечно-сосудистых патологий [93, 90]. а2В-адренергический рецептор связан с вазоконстрикцией и может быть вовлечен в патогенез ИБС.
Характеристика исследованных в работе генов и полиморфных маркеров
Ренин-ангиотензиновая система отвечает за регуляцию тонуса кровеносных сосудов, поддержание водно-солевого гомеостаза, обеспечивает питание и стимулирует пролиферацию клеток гладкой мускулатуры сосудов и миокарда: Таким: образом; вовлеченность генов, кодирующих компоненты данной системы в патогенез сердечнососудистых заболеваний очень вероятна. Помимо общециркуляторной системы существуют автономные и специфичные локальные РАС (почки, головной мозг, сердце, половые железы, эндотелий сосудов). В состав РАС входят следующие компоненты. Фермент ренин, являясь карбоксипептида-зой, катализирует реакцию превращения неактивного белка ангиотензиногена, секре-тируемого печенью, в ангиотензин I; Последний, в свою очередь, под действием другой карбоксипептидазы (фермента, превращающего ангиотензин; I, АПФ) превращается -. в регуляторный пептид ангиотензин И.1 В сердце функцию АПФ выполняет химаза. Помимо превращения ангиотензина І в ангиотензин II АПФ также катализирует реакцию расщепления брадикинина на неактивные продукты. Ангиотензин И-сильный вазокон-стриктор, по своему действию являющийся антагонистом сосудорасширяющего пептида вазопрессина. Помимо регуляции кровяного давления этот, пептид обладает свойствами ростового фактора, стимулируя пролиферацию клеток гладкой мускулатуры кровеносных сосудов и миокарда. Свои биологические функции в отношении сосудов ангиотензин II реализует через посредство сосудистого рецептора ангиотензина II (тип 1, ATi - angiotensin II receptor type 1). Связывание этого регуляторного пептида с другим рецептором — адренальным (тип2, АТг) — вызьгеает усиление синтеза альдостерона надпочечниками. АТг, вступая во взаимодействие с минералокортикоидным рецептором, увеличивает реабсорбцию ионов натрия через натриевые каналы эпителия нефронов. 2.3.1.1. Ген ангиотензиногена (AGT). Ген; ангиотензиногена расположен на хромосоме Iq42-q43; Для данного гена описано 15 различных полиморфизмов. При этом наилучшим образом исследованы два полиморфизма, расположенные во- втором; экзоне. Это однонуклеотидные полиморфизмы, которым соответствуют, аминокислотные полиморфизмы (треонин или метио-нин) в положениях 235 (М235Т) и 174 (Т174М) полипептидной цепи [304].
Семейный анализ ипопуляционные исследования показали сцепленность молекулярных вариантов ангиотензиногена, несущих треонин-235 и метионин-174, с эссен-циальнойї гипертонией у представителей: разных, рас: европеоиды, (британцы [37], французы [248]; американцы европейского происхождения [66], жители: Словении [181]), негроидов (жители островов Карибского бассейна - выходцы из Африки [38]) и монголоидов (корейцы [129]): Результаты исследований среди японцев [166, 111,121] и китайцев [246,133,167,168,290] противоречивы. У британских [274], японских [104], французских [107] и немецких [282] гипертоников обнаружено повышенное содержание ангиотензиногена в плазме крови. При этом максимальные уровни плазменного ангиотензиногена наблюдались среди гомозигот Thr235/Thr235 [251, 63;. 282]. По» всей: видимости, среди двух полиморфизмов (М235Т и 77 74М) гена AGT вариабельность аминокислотного остатка именно в 235-м положении І в наибольшей степени влияет на уровень данного белка в; крови ввиду более частой встречаемости (в 10 раз и более) этой мутации в популяции по сравнению со 174-м положением [209, 11]. Таким образом, носительство генотипа Thr235/Thr235 у гипертоников по сравнению с нормотониками свидетельствует о том, что именно этот вариант гена AGT является фактором риска развития гипертонической болезни. В! испанской популяции не было обнаружено ассоциации этих полиморфных. маркеров с развитием эссенциальной гипертонии [76,203,61 і 177]. Многочисленные." данные указывают на важную роль, молекулярных вариантов гена AGT, несущих аллели /74М и = 235Т, в формировании предрасположенности к ишемической болезни сердца и, как; следствие, к ИМ. Результаты исследований, возможной і ассоциации полиморфных маркеров 77 74М и М235Т гена AGT с ИБС в раз- личных популяциях противоречивы. Так, у датчан [224] и китайцев [124] такой ассоциации не было обнаружено, в то время как во французской популяции была показана связь аллеля 77 74 со степенью поражения коронарных артерий [ 108]. В японской популяции подобная ассоциация была г установлена для генотипа Т174Т [48]. У североамериканских европейцев [138], новозеландцев [ИЗ], итальянцев [172] и .жителей Канарских Островов [202, 89] в качестве фактора риска выступает аллель Т235.Результаты исследований в, немецкой популяции І также противоречивы: одни исследователи г указывают на связь полиморфных маркеров Т174М и М235Т с ИБС [73, 282,278] тогда как другие такой связи не обнаруживают [ 197]. В? одной і работе показана ассоциация» полиморфного маркера 77 74Mrena.AGT с коронарным атеросклерозом у русского населения Томской области [303]. Гипертрофия левого желудочка (ГЛЖ), часто. развивающаяся в гипертрофическую кардиомиопатию, относится к одному из факторов, связывающих, гипертонию и; ИМ1 Юіиническим проявлением ГЛЖ является увеличение массы (гипертрофия) левого« желудочка сердца и межжелудочковой перегородки. Связь полиморфизма 77 74М гена;. AGT с ГЛЖ демонстрируется: в популяции русских города Москвы [305]; Среди русских города Санкт-Петербурга вклад в развитие данной патологии смотрели1 для полиморфизма М235Т гена; ангиотензиногена. При і. этом не: было обнаружено ассоциации полиморфного маркера М235Т гена AGTс развитием ГЛЖ у пациентов с гипертонией; [226]. Большое количество работ посвящено исследованию ассоциации полиморфных маркеров ТІ 74М и М235Т с развитием инфаркта миокарда: Так, у итальянцев [ 172]: и североамериканских европеоидов [138] была показана связь генотипа 7Т полиморфизма М235Т с ИМГ У поляков генотип ТТ полиморфного маркера М235Т ассоциировался со значительным риском ИМ только у курящих [31].
В китайской популяции результаты исследований противоречивы: так в одной работе была обнаружена положительная ассоциация аллеля Г и генотипа ТТ полиморфного маркера М235Т с развитием инфаркта миокарда [42], однако;-.в другой работе ассоциации полиморфных маркеров Т174Ми M235TTe,na.AGTc данной патологией выявлено не было [124]. В испанской популяции было установлено; что в качестве маркера риска развития данной патологии выступает аллель М и генотип ММполиморфного маркера М235Т, аллель Г, напротив, является защитным аллелемі [59].h У русских с развитием.инфаркта миокарда ассоциировался полиморфный маркер Т174М [305]А У датчан ассоциации полиморфных маркеров ТІ 74М и М235Т с ИМ не обнаружили [224]. Положительная ассоциация маркеров Т174М к М235Тгена.AGT с развитием сердечно-сосудистьи заболеваний показана при сочетании их с полиморфными маркерами других генов ренин-ангиотензиновой системы: А СЕ и AGT1R [254,. 76, 241, 182, 194], генов липидного обмена; в частности, АРОЕ [12] и других генов, продукты которых прямо или косвенно вовлекаются в процесс развития ССЗ [278]. В китайской, японской. и.- испанской \ популяции была выявлена ассоциация; полиморфного маркера М235Т гена AGT с цереброваскулярными заболеваниями. У китайцев наблюдали корреляцию между аллелем Г, величиной давления и развитием инсульта, выражавшуюся в наличии у гомозиготных;носителей данного аллеля наибольших уровней давления крови и: развития обширного инсульта головного мозга [82]. В японской популяции показана ассоциация полиморфизма М235Т гена AGT с развитием лакунарного инфаркта [242]. Повреждение белого вещества головного мозга может являться фактором риска развития инсульта. Незначительная ассоциация полиморфного маркера М235Т гена ангиотензиногена с наличием указанной патологии демонстрируется у испанцев [227]. Были проведены два-исследования, в которых изучали ассоциацию полиморфного маркера М235Т гена AGT с ожирением. В одной из этих работ не обнаружили ассоциации полиморфизма М235Т с обдоминальным ожирением [237], в то время как в другой была выявлена ассоциация данного полиморфного маркера с ожирением у детей с гипертонией [181].
Буферные растворы
Буфер ТЕ (1х) — 10 мМ Трис-HCl (рН=8,0), 1 мМ ЭДТА. Буфер ТАЕ (1х) — 40 мМ Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА. Буфер ТВЕ (1х) — 0,089 МТрис, 0,89 М борная кислота, 0,002 М EDTA (рН=8,0). Буферы для рестрикции (1х): Буфер G (green) - 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 10 мМ хлорид магния, 0,1 мг/мл БСА (1мг/мл). Буфер Y (yellow) — 33 мМ Трис-ацетат, рН 7,9; 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0,1 мг/мл БСА (1 мг/мл). Буфер SE (для SfaNT) - 50 мМ буфер трис-HCl, рН 7,6; 10 мМ хлорид магния; 100 мМ хлорид натрия и 1 мМ ДТТ. Буфер SE (для Fsp4Hl) - 33 мМ Трис-ацетат, рН 7,9; 10 мМ ацетат, магния, 66 мМ ацетат калия и 1 мМ ДТТ. 3.3. Формирование групп больных и здоровых индивидов. Образцы крови больных ИБС и крови индивидов, вошедших в группу "контроль" любезно предоставлены Л.О. Минушкиной и Д.А. Затейщиковым из Медицинского центра Управления делами президента РФ. Образцы крови больных гипертонией и сахарным диабетом типа 2, а также крови индивидов, вошедшихв группу "контроль" любезно предоставлены Кравченко Т. В.4 из Эндокринологического центра РАМН.. 3.4. Выделение геномной ДНК человека методом фенол/хлороформной экстракции.. 200 мкл венозной крови человека смешивали с равным \ объемом лизирующего буфера (10 мМ «Трис-НСІ (рН=8,0), 0,32 М сахароза, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 0,1%-ный тритон;Х-100), добавляли ДТТ, ДСН и протеиназу К в конечной концентрации 0,2%, 40 мМ и 20 мкг/мл соответственно и инкубировали либо при 37С в течение ночи, либо І 2 ч при 60С. Затем І последовательно обрабатывали фенолом, смесью фенол/хлороформ (1:1) и хлороформом г (дважды на каждой стадии). ДНК осаждали добавлением 1 мл 96%-ного этанола в присутствии 0.3 М ацетата натрия и тРНК дрожжей г (10 мкг/мл) с последующей инкубацией при -70С. Осадок ДНК промывали 80%-ным этанолом, сушили в термите при 65С 20 мин., растворяли в 30 мкл бидистиллирован-ной воды в термите при 65С 1 час. Препараты ДНК хранили при -70С. 3.5. Аплификация ДНК. ПЦР проводили на амплификаторе РНС-2 ("Techne", Великобритания) или» "Терцик . ("ДНК- Технология", Москва) в 50 мкл реакционной смеси, содержащей буфер 1. или 2, 0,2 мМ каждого dNTP по 10 пикомолей каждого из праймеров, 100-200 нг геномной ДНК и 2,0 ед. ДНК-полимеразы Taq. Буфер 1 включал 67 мМ Трис-НС1 (рН=8,8), 16,6 мМ сульфат аммония и 0.1 %-ный твин-20. Концентрацию хлорида магния варьировали в зависимости от амлифицируемого локуса. Буфер 2 содержал 100 мМ; Трис-НСІ (pH 8,8), 500 мМ КС1 и 25 MMMgCfe.
При необходимости в реакционную смесь вносили ДМСО в конечной концентрации 10%. На начальной стадии ПЦР денатурировали ДНК при 94С в течение 3-5 мин. Затем осуществляли 35-40 циклов ПЦР в зависимости от полиморфного маркера и количества исходной ДНК по трехступенчатой программе, включающей денатурацию ДНК (94С/20-40с), отжиг праймеров в течение 20-40с и синтез второй цепи (72С/20-30с). Для всех локусов конечная стадия - синтез второй цепи при 72С в течение 7 мин, отсутствовала. Температуру отжига праймеров варьировали в зависимости от амлифици-руемого локуса. Условия ПЦР и последовательности праймеров для амплификации исследованных локусов приведены в табл. 2. Полиморфизм ряда генов исследовали, обрабатывая соответствующими \ рестриктазами продукты ПЦР, содержащие полиморфный участок. В случае гена A GT использовали рестриктазу JVicoI для маркера.Т174М, SfaNl - для М235Т; в случае гена AGT1R - рестриктазу 2fcfDI для маркера А1166С, Sspli— для A(-153)G\ рестриктазы Hinjl и. Fsp4Hl использовали- для изучения полиморфизмов С677Т и А1298С гена MTHFRi соответственно. К 15 мкл амплифицированной ; смеси добавляли 2 мкл 10-кратного буфера, 2 мкл БСА (1 мг/мл) и 2-5 ед. фермента. Расщепление ДНК рестрик-тазами Ncol и Hinfl проводили в буфере Y, SfaNl и Fsp4Hl- в буфере SE, BstDEl - в буфере G. Рестрикцию проводили в течение 3-4 ч при 60С (BstDEl), в течение 1-го часа при 37С (Ncol), либо в течение ночи при 37С (SfaNl; Hinfl; Fsp4Hl; Sspl): 3.7. Электрофоретическое разделение ДНК. Фрагменты ДНК после амплификации или рестрикции разделяли в агарозном и: полиакриламидном гелях (ПААГ). Электрофорез в 2%-ном агарозном геле проводили в горизонтальной камере с использованием в качестве электродного буфера їх ТАЕ при напряженности поля 8 В/см. По окончании электрофореза гели окрашивали бромистым этидием (0,5 мкг/мл) и просматривали в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. Разделение ДНК в ПААП осуществляли в вертикальной камере с использованием в качестве электродного буфера їх ТВЕ при напряженности поля 15 В/см. В зависимости от размера разделяемых фрагментов использовали 5 и 10% гели, содержащие 7% глицерин, длиной 12, 18 и; 20см и толщиной 0,7 см s при соотношении акрила-мид/бисакриламид 29:1. В лунки геля наносили по 10-15 мкл анализируемой ДНК и 0,4-0,5 мкг маркерной ДНК. В качестве последней использовали pUC19/MspI и 50 Ър DNA Ladder. ПААГ окрашивали.бромистым этидием и просматривали в ультрафиолетовом! свете также как в случае агарозных гелей. 3.8. Статистическая обработка результатов. 3.8.1. Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов. Точный критерий: Фишера. Поправка Бонферрони. Для сравнения частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных маркерові в группах с наличием и отсутствием заболевания нами использовался .точный критерий Фишера. Достоверными считали различия при р 0,05. Тест Фишера в простейшем его виде позволяет, оценить статистическую достоверность различий между 2 группами по частотам 2 аллелей или генотипов, т. е. для биашіельного локуса. Используется матрица частот аллелей размером (2x2), столбцами и строками, в которой являются соответственно аллели (или генотипы) и группы сравнения. . Нулевой гипотезой считается предположение об отсутствии различий между группами, альтернативной — об их наличии. Под отсутствием различий понимается, происхождение двух исследуемых выборок из одной популяции. В отличие от других статистических тестов, например, основанных на критерии х2, уровень значимости различий вычисляется с помощью точного алгоритма. Его суть заключается в определении вероятностей получения нашей конкретной выборки и всех выборок с еще меньшей вероятностью.
Сумма этих вероятностей и является искомым уровнем значимости. Для многоаллельных систем критерий Фишера также применим. Возможны два варианта его применения. Во-первых, расчет можно вести для .таблиц не (2x2), а (2хп), где п — число аллелей или генотипов. Во-вторых, компромиссным решением является группировка определенных аллелей (или генотипов), например, вьщеляя один из аллелей (или генотипов) в одну группу и сравнивая его со всеми остальными. В таких случаях для локусов, число аллелей которых превышает два, вводится поправка на множественность аллелей и генотипов. Эта поправка (поправка Бонферрони) рассчитывается по формуле Px(n-l), где Р - значение статистического критерия (в данном случае, точного критерия Фишера), п— число аллелей или генотипов. 3.8.2. Оценка относительного риска; Odds ratio. Доверительный интервал. В исследованиях типа "случай-контроль" относительный риск развития заболевания оценивается с помощью показателя соотношения шансов (odds ratio, OR). Он характеризует отношение заболеваемости среди лиц, подвергавшихся и не подвергавшихся воздействию факторов риска. Значение OR вычисляли с помощью формулы: (ИПхИО)/(ЛПхЛО). (ИП) — число истинно положительных результатов нового теста. (ЛО) — число ложно отрицательных результатов нового теста: (ЛП) — число ложно положительных результатов нового теста. (ИО) — число истинно отрицательных результатов нового теста. OR=l рассматривали как отсутствие ассоциации; 0R 1 как положительную ассоциацию ("фактор предрасположенности"), 0R 1 - как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием ("фактор устойчивости"). Доверительный интервал (CI, confidence interval) представляет собой интервал значений, в пределах которого с вероятностью 95% находится ожидаемое значение рассматриваемого параметра; в данном случае, значение OR.
Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с ИМ
Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с ИМ проводили, используя две группы, общая характеристика которых приведена в таблице 10. В группу пациентов, перенесших инфаркт миокарда, вошло 93 человека (возраст 64,1± 1,1. лет, мужчины/женщины 58/35). Данная группа была выделена из ранее описанной группы больных ИБС (п=223). В качестве контроля использовали группу больных ИБС этой же группы без ИМ в анамнезе (п=124). Геномную ДНК больных ИМ исследовали по; шести полиморфным; маркерам: AGT{T174M,M235T),AGT1R (A1166C,A( 153)G)HMTHFR (С677Т,А1298С). 4.2.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров 77 7 /Л/ и М235Т гена AGT с ИМ; При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера ТІ 74М отмечено резкое преобладание содержания аллеля 7! в обеихі исследованных группах (0,839 и 0,839 в группах с наличием»и отсутствием ИМ,Т соответственно). В группе с наличием ИМ наблюдали незначительное.; снижение частоты встречаемости гомозигот ТТ (0,726 против 0,699 в контрольной группе) на фоне увеличения содержания гетерозигот 7М Однако, этиразличия статистически недостоверны (табл.11). Таким образом," в популяции русских г. Москвы полиморфный маркер Т174Мтена ангио-тензиногена не вовлекается в развитие ИМ у больных ИБС. Результаты исследований возможной, ассоциации. полиморфных маркеров Т174Ми М235Т гена ангиотензиногена с ИМ в других популяциях также противоречивы. Положительная ассоциация аллеля; Г маркера М235Т с развитием ИМ была обнаружена у североамериканских европеоидов [138]. У населения Италии с развитием ИМ ассоциировался генотип ТТ маркера М235Т[ 172]. У поляков генотип ТТ полиморфного маркера М235Т ассоциировался со значительным риском ИМ только у курящих [31]. В исследовании, проведенном на европейской популяции Испании также была обнаружена ассоциация генотипа ТТ полиморфного маркера М235Т гена AGT с ранним развитием инфаркта миокарда, но при синергическом взаимодействии с полиморфизмом; є2/єЗ/є4 гена АРОЕ [12]. В то же время в работах Fernandez-Areas et al. в 1999 и 2001 году было показано, что среди испанских мужчин в качестве маркера риска развития ИМ выступет аллель М и генотип ММ, а наличие в геноме аллеляГ, напротив, уменьшает риск развития , данной патологии, когда присутствуют другие главные факторы риска. Незначительная ассоциация полиморфных маркеров .77 74М и М235Т с риском развития ИМ была установлена у французов [251].
Результаты поиска ассоциации полиморфных маркеров 77 74М и М235Т гена AGT с ИМ в китайской популяции носят противоречивый характер: одни исследователи указывают на связь генотипа ТТ маркера М235Т с высоким риском развития инфаркта миокарда [42], тогда как другие такой связи не обнаруживают [124]. В исследовании, проведенном на датской популяции, не обнаружено ассоциации полиморфных; маркеров ТІ 14М\ и М235Т с риском развития ИМ [224]і 4.2.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров А1166С и A(-153)G гена AGT1R с ИМ. В. результате исследования , распределения - аллелей и генотипов полиморфного маркера А1166С в группах "ИМ-" и "ИМ+" наблюдали незначительное преобладание частоты аллелля А над частотой аллеля С, и встречаемости гомозигот АА — над содержанием гомозигот СС. При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов данного полиморфного маркера в обеих группах статистически достоверных различий І выявлено не было (табл. 13);. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в исследованной популяции полиморфный маркер А1166С гена рецептора ангиотензина II типа Г не вовлекается в развитие ИМ у больных ИБС. Наши данные, не соответствуют результатам недавнего исследования проведенного на московской популяции, в котором отмечена ассоциация между полиморфным маркером А1166С и развитием инфаркта миокарда [44]. В ряде зарубежных популяций показано, что у носителей аллеля С и, особенно, генотипа СС полиморфного маркера А1166С гена AGT1R значительно повышен риск развития ИМ. Аллель С как фактор риска развития инфаркта миокарда выступает в японской популяции [8]. У представителей южной Франции частота встречаемости ал-леля С в группе пациентов с ИМ увеличивалась, преимущественно, после 45 лет [34]. У мужчин норвежской популяции [18], а также у мужчини женщин испанской популяции [60] с развитием инфаркта миокарда ассоциировался генотип СС маркера А1166С. В ряде работ, посвященных исследованию ассоциации данного полиморфного маркера с различными сердечно-сосудистыми заболеваниями, продемонстрирована ассоциация этого полиморфизма с развитием ИМ при сочетании с полиморфным маркером I/D гена А СЕ. Данное синергическое взаимодействие показано. в исследованиях, проведенных среди жителей Словении [182], Италии [58] и Франции [249]. В то же время в исследованиях, проведенных на немецкой [71] и английской популяциях [234, 198, 116], не обнаружено ассоциации полиморфного маркера А1166С гена рецептора ангиотензи-на II типа 1 с развитием инфаркта миокарда. Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера A(-153)G гена AGT1R в группе больных ишемической болезнью сердца, осложненной инфарктом миокарда, по сравнению с группой больных ИБС без данного осложнения, выявил тенденцию к незначительному накоплению аллеля-G и,.особенно, генотипа GG у больныхИБС с ИМ по сравнению с группой больных ИБС без ИМ. (0,426 и 0,149 против 0,422 и 0,118," соответственно). Одновременно с этим гетерозиго--ты наблюдались в 1,1 раза чаще в группе "ИМ-" (0,608 против 0,554) по сравнению с группой "ИМ+". Различия в распределении аллелей и генотипов в обеих исследованных группах были незначительны и статистически недовстоверны (табл. 14). Очевидно, что полиморфный.маркер A(-153)G не ассоциирован с развитием ИМ у русских г. Москвы больных ишемической болезнью сердца.
Данные об исследовании ассоциации полимофного маркера А (-153) G с развитием ИМ у больных ИБС вообще отсутствуют. 4.2.3. Исследование ассоциации полиморфных маркеров С677ТиА1298С гена MTHFR с ИМ; В результате исследования: распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера Сб77Тв обеих исследованных группах было отмечено преобладание аллеля С над аллелем Т, и генотипа СС над генотипом ТТ. В группе больных ИБС, перенесших ИМ, по сравнению с группой больных без этого осложнения было выявлено увеличение частоты аллеля С, на фоне снижения содержания аллеля Г. Также у больных ИБС с ИМ было обнаружено увеличение встречаемости гомозигот СС — в 1,2 раза, в то время; как доля генотипа ТТ была существенно уменьшена (почти в 3 раза) по сравнению с группой больных ИБС без; ИМ. Обнаруженные различия в распределении аллелей и генотипов в обеих исследованных группах были незначительны и і статистически; не-довстоверны (табл.15). В большинстве работ, посвященных ассоциации полиморфного маркера С677Т гена метилентетрагидрофолат-редуктазы с сердечно-сосудистыми заболеваниями, показана роль аллеля Г и генотипа ТТ как основных генетических факторов риска. Кроме того, обнаружено, что наличие данной мутации сопровождается повышением уровня гомоцистеина в крови [297, 141, 287, 52, 83, 176,.77, 24, 86]. Связь генотипа ТТ полиморфного маркера С677Т с высоким риском развития ИМ показана у мужчин в японской [ 160] и турецкой І [84] популяциях. Результаты исследований среди итальянцев противоречивы: одни исследователи указывают на связь полиморфного маркера С677Т с развитием ИМ [145], тогда как другие такой связи не обнаруживают [143]. В исследованиях, проведенных на североамериканской. , 220, 139, 218], польской [80, 81], китайской [98, 296], австралийской [280] и индусской [159] популяциях, ассоциации полиморфного маркера Сб77Тс ИМ не обнаружено. При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера А1298С у пациентов с ИМ по сравнению с пацинтами без ИМ выявили тенденцию к накоплению аллеля С (0,516 против 0,420) и, особенно, генотипа СС (0,220 против 0,101), при одновременном снижении аллеля А (0,484 против 0,580) и генотипа АА (0,187 против 0,260, соответственно). В группе больных ИБС с ИМ значимо повышена частота встречаемости генотипа СС по сравнению с группой больных ИБС без этого осложнения (0,220 против 0,101), табл. 16. Анализируя данные, представленные в таблице 16, очевидно, что носители генотипа СС имеют повышенный риск развития ИМ (OR — 2,51).
