Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структура молекулы тайтина и его функции 8
1.1. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в Z-диске саркомера 10
1.2. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в 1-зоне саркомера 12
1.2.1. Изоформы тайтина 13
1.2.2. Взаимодействие тайтина с тонкими нитями в 1-зоне саркомера 16
1.3. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в А-диске саркомера 16
1.4. Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в М-лииии саркомера 18
Глава 2. Структура и функции молекул с-белка и х-белка 19
2.1. Структура и локализация молекул С-белка и Х-белка в саркомерах
скелетных мышц 19
2.2. Функции С-белка 23
Глава 3. Зимняя спячка млекопитающих 25
3.1. Общие представления о зимней спячке млекопитающих 25
3.2. Сезонные изменения в мышцах зимоспящих животных 28
3.3. Изменения в мышцах человека и животных в условиях микрогравитации .30
Заключение 31
Цель и задачи исследования 33
П. Экспериментальная часть 34
Глава 4. Материалы и методы 34
4.1. Экспериментальный материал 34
4.2. Выделение и очистка мышечных белков 35
4.2.1. Выделение тайтина из скелетных мышц 35
4.2.2. Выделение миозина из скелетных мышц 36
4.2.3. Очистка С-белка и Х-белка из скелетных мышц 38
4.2.4. Выделение актина из скелетных мышц 39
4.3. Гель-электрофорез белков в присутствии ДСН и денситометрия гелей 40
4.4. Иммуноблоттинг 44
4.5. Электрофорез в присутствии мочевины 44
4.6. In vitro фосфорилирование тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц .45
4.7. Измерение АТФазной активности актомиозииа в присутствии тайтина,
С-белка и Х-белка скелетных мышц 46
4.8. Электронно-микроскопические исследования 47
III. Результаты и обсуждение 48
Глава 5. Изучение структурно-функциональных свойств тайтина, с-белка и х-белка скелетных мышц кролика и суслика в норме 48
5.1. Электронно-микроскопическое изучение молекулярных параметров и агрегационных свойств молекул тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц кролика и суслика в норме 48
5.2. Взаимодействие тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц кролика и суслика с миозином в норме 52
5.3. Влияние тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц кролика и суслика на АТФазную активность и Са2+ -чувствительность реконструированного актомиозина в норме 54
5.4. Взаимодействие тайтина скелетных мышц кролика и суслика
с Ф-актином в норме 56
5.5. Электрофоретическое изучение тайтина скелетных мышц животных и человека в норме 59
5.6. Заключение 62
Глава 6. Изучение сезонных изменений структурно- функциональных свойств тайтина, с-белка и х-белка скелетных мышц зимоспящих сусликов 64
6.1. Сезонные изменения функциональных свойств тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц сусликов: влияние на АТФазную активность 2+ г
и Са -чувствительность реконструированного актомиозина 64
6.2. Фосфорилирование тайтина и Х-белка скелетных мышц сусликов: сезонные изменения и их вклад в смену состояния животного 67
6.3. Электрофоретическое изучение сезонных изменений качественного и количественного состава тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц сусликов 71
6.4. Заключение 76
ГЛАВА 7. Изучение изменений тайтина и х-белка м. soleus крыс и человека в условиях моделируемой микрогравитации 77
7.1. Электрофоретическое изучение тайтина и Х-белка m. soleus крыс и человека при моделируемой микрогравитации 77
7.2. Оценка эффективности подходов, направленных на уменьшение или предотвращения негативного влияния моделируемой невесомости nam. soleus крыс 81
7.3. Заключение 83
Выводы 84
Список литературы
- Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в 1-зоне саркомера
- Изменения в мышцах человека и животных в условиях микрогравитации
- Гель-электрофорез белков в присутствии ДСН и денситометрия гелей
- Взаимодействие тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц кролика и суслика с миозином в норме
Введение к работе
В настоящее время известна большая группа белков семейства тайтина (тайтин, С-белок, Х-белок, Н-белок, М-белок, миомезин и другие), относящихся к саркомерным цитоскслетным белкам поперечно-полосатых мышц позвоночных. Показано, что они связываются с миозип-со держащим и (толстыми) нитями и составляют 15% от общего количества белка в саркомере. Хотя предположения о присутствии белков немиозиновой природы в структуре толстых нитей высказывались давно (Рсре, 1967; Huxley, 1967; Hanson et al., 1971), до начала 70-х годов прошлого века природа этих белков была неизвестна. Обнаружение с помощью ДСН-гель-электрофореза С-белка и Х-белка в качестве минорных примесей в препаратах миозина (Starr & Offer, 1971), а также открытие тайтина (= коннектина) (Maruyama et al., 1977; Wang К. et al., 1979; Maruyama et al., 1981) стимулировали их выделение и изучение.
С-белок в быстрых волокнах скелетных мышц и его изоформа Х-белок в медленных волокнах (Yamamoto & Moos, 1983; Starr & Offer, 1983) располагаются на поверхности толстых нитей с периодом 43 нм (Bennett et al., 1986), связываясь одновременно с тайтином и миозином. Тайтин является продольным элементом саркомерного цитоскелета поперечно-полосатых мышц позвоночных. До его открытия мышечное сокращение рассматривалось с позиции взаимодействия двух типов нитей: тонких (актии-содержащих) и толстых (миозип-содержащих), скользящих относительно друг друга (Huxley & Hanson, 1954; Huxley & Niedergerke, 1954). Обнаружение тайтина и выяснение его локализации позволило выдвинуть гипотезу о трехнитевой модели саркомера (Wang К., 1984; 1985).
Исследования показали, что тайтин и белки его семейства могут выполнять разные функции в саркомере. Предполагается, что они играют существенную роль в
миогенезе при сборке толстых нитей и формировании структуры саркомера, участвуют в регуляции актин-миозинового взаимодействия при мышечном сокращении. Тайтин вносит вклад в пассивное натяжение, развиваемое мышцей, и, возможно, участвует в регуляции генной экспрессии, обновления белков и активности ионных каналов (Granzier & Labeit, 2002; 2004). Тем ие менее, не все свойства этих белков в норме до конца изучены. Поэтому одна из задач данной работы - изучение структурно-функциональных свойств тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц в норме.
Не изучена роль белков семейства тайтина в мышцах при изменении условий внешней среды, включая экстремальные, например, зимняя спячка и микрогравитация. Интерес, проявляемый к изучению зимней спячки (гибернации) млекопитающих, определяется, прежде всего, способностью зимоспящих животных адаптироваться к неблагоприятным условиям среды за счет снижения активности всех физиологических систем организма, включая мышечную, при сохранении контроля за согласованностью их действия (Wang L., 1987). Поскольку при гибернации животные длительное время пребывают в обездвиженном состоянии, после чего за несколько часов способны перейти к нормальной двигательной активности без патологических последствий, есть основания ожидать, что в скелетных мышцах зимоспящих происходят обратимые адаптационные изменения, которые могут вносить вклад в смену физиологического состояния животных. Эти изменения могут касаться состава, структуры и функциональных свойств сократительных нитей и составляющих их белков. Полученные ранее в нашей лаборатории данные об изменениях изоформного состава и свойств миозина скелетных мышц сусликов при гибернации (Лукоянова, 1997а, 19976) подтверждают это предположение. В настоящей работе проведено исследование адаптационных изменений тайтина, С-белка и Х-бслка в скелетных мышцах сусликов при гибернации.
Изучение поведения тайтина и белков его семейства в мышцах человека и животных в условиях микрогравитации только начинается. Недавно проведенные исследования выявили уменьшение количества тайтина в m. soleus крыс при моделировании условий гравитационной разгрузки (Kasper & Xun, 2000; Toursel et al., 2002). Однако в литературе отсутствуют данные об изменении тайтина в m. soleus человека, а также о поведении Х-белка в этой мышце при микрогравитации. В настоящей работе изучено поведение изоформного состава тайтина, а также Х-белка в m. soleus человека и крыс в условиях моделируемой микрогравитации.
Структура и функциональные свойства области молекулы тайтина, расположенной в 1-зоне саркомера
Ген тайтина человека, расположенный в хромосоме 2 (регион 2q31), содержит 363 экзона, кодирующих белок с м.в. 4200 к Да (38138 аминокислотных остатка) (Bang et al., 2001). Молекулярная идентификация тайтиновых транскрипций из различных типов мышц показала, что транскрипции скелетного тайтина всегда содержат экзон только N2A уникальной последовательности (рис. 3). Транскрипции сердечного тайтина всегда содержат экзон N2B уникальной последовательности, но могут содержать и N2A экзон (Freiburg et al., 2000). Альтернативный сплайсинг эластичной области тайтина в 1-зоне саркомера, определяющий число и размер растяжимых элементов, является основой разнообразия изовариантов тайтиновых изоформ. Причины избирательной экспрессии N2A или N2B элементов в изоформах тайтина пока неизвестны.
Молекулярный вес установленных изоформ тайтина и их изовариантов составляет -3000-3700 кДа и зависит от типа мышц и волокон (Freiburg et al., 2000). В разных отделах сердца животных и человека экспрессируются две изоформы тайтина: N2B изоформа, с молекулярным весом 2970 кДа, и N2BA изоформа, с молекулярными весами ее изовариантов от 3200 до 3350 кДа (Freiburg et al., 2000). В медленной скелетной мышце m. soleus экспрессируется длинная N2A изоформа тайтина (м.в. 3700 кДа), а в быстрой мышце m. psoas - короткая N2A изоформа (м.в. 3400 кДа) (Freiburg et al., 2000). Электрофорстические исследования и методы иммуноокрашивания подтвердили присутствие N2A изоформы тайтина с молекулярным весом 3700 кДа в m. soleus крысы, кролика, человека, а также в m. longtssimus dorsi кролика (Freiburg et al., 2000; Cazorla et al., 2000; Neagoc et al., 2003; Trombitas et a!., 2001). В быстрой скелетной мышце m. psoas и в m. tibialis anterior кролика с помощью гель-электрофореза найдены два изовариапта короткой N2А изоформы тайтина с молекулярными весами -3300 кДа и 3500 кДа (Neagoe et al., 2003). Электрофоретический анализ образцов предсердия и левого желудочка (ЛЖ) сердца животных и человека показал, что изоформ ный состав тайтина в сердечной мышце млекопитающих представлен двумя изоформами, короткой N2B с м.в. -3000 кДа и длинной N2BA с м.в. 3250-3400 кДа (Cazorla et al., 2000; Trombitas et al., 2001; Neagoe et al., 2003; Makarenko et al., 2004).
Определенный интерес вызывает открытие в поперечно-полосатых мышцах трех уникальных изоформ тайтина I-зоны саркомера: Novex-1, 2, 3 (Bang et al., 2001). Novex-l/N2B и Novex-2/N2B ( 3000 кДа) экспрессируются как минорные изоформы сердечного тайтина. Более короткая изоформа Novex-З (-700 кДа) взаимодействует в 1-зоне саркомера с гигантским эластичным белком обскурином (Young et al., 2001) (рис. 1). Предполагают, что комплекс Novex-З таитин/обскурин, удлиняющийся при растяжении саркомера, может выполнять сигнальную функцию в саркомере, являясь связующим звеном между Z-линией и 1-зоной саркомера (Bang et al., 2001). Кроме того, присутствие в саркомере таких коротких изоформ тайтина как Novex-З возможно объясняет интеграцию тайтина в тетрагональную решетку Z-диска саркомера и приспособление молекул тайтина к трехтяжевой и двухтяжевой симметриям толстых и тонких нитей (Bang et al., 2001).
На данном этапе исследований уже не возникает сомнений в том, что тайтин прочно связан с толстыми нитями в Л-диске саркомера и что он закреплен в Z- и М-линиях. Однако вопрос о том, взаимодействует ли тайтин в 1-зоне саркомера с тонкими актин-содержащими нитями или он действует в этой зоне саркомера подобно свободной пружине, остается пока нерешенным. Между тем решение этого вопроса важно для понимания роли тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия в мышце. Ранее было высказано предположение, что тайтин способен слабо связываться с тонкими нитями (Maruyama et aL,-1987; Funatsu et al., 1993). Данные электронно-микроскопических исследований, включающих избирательное удаление тонких нитей из миофибрилл, показали, что с актиновыми нитями может взаимодействовать часть тайтин ово и молекулы, расположенная в 1-зопе саркомера около Z-диска (Trombitas & Pollack, 1993; Trombitas et al., 1997). Несколько проведенных in vitro исследований показали способность фрагментов тайтина связываться с актином (Jin, 1995; Astier et al., 1998; Linke et al., 1999; Jin, 2000; Gutierrez-Cruz et al., 2001; Yamasaki et al., 2001; Kulke et al., 2001; Raynaud et al., 2004; Niederlander et al., 2004). Однако прямого подтверждения связывания целой молекулы тайтина с актином in vitro до сих пор нет.
Изменения в мышцах человека и животных в условиях микрогравитации
Погружение в спячку вплоть до достижения минимальной температуры тела занимает нескольких суток. При пробуждении животного переход от почти полного угнетения всех физиологических систем организма, включая мышечную, к их нормальной функциональной активности совершается очень быстро - за 2-3 часа без патологических последствий. Однако при изучении вклада разных физиологических систем млекопитающих в гибернацию не уделялось должного внимания мышцам и мышечным белкам, хотя скелетные мышцы составляют значительную часть массы тела животных и занимают одно из первых мест среди органов, вносящих вклад в термогенез зимоспящих при пробуждении. Исследования скелетных мышц касались, в основном, систем энергетического метаболизма (Tashima et al., 1970; Wang L., 1984; Petrovic et al., 1985; Wang L., 1987; El Hashimi et al., 1992; Soukri et al., 1995), а также мембранных процессов, в частности функционирования саркоплазматического ретикулума (Agostini et al., 1991; Pehowich, 1994). В немногочисленных работах, посвященных изучению скелетных мышц зимоспящих, нет однозначного представления о том, что происходит с мышцами и их белками в результате длительной инактивации во время спячки. С одной стороны, имеются данные, согласно которым во время зимней спячки не происходит каких-либо заметных изменений в ультраструктуре (Клика и Зайцова, 1984), композиционном составе и сократительных свойствах скелетных мышц и диафрагмы (Viskocil & Gutmann, 1977). Однако исследования других авторов свидетельствуют об атрофии скелетных мышц во время зимней спячки как у истинных, так и у факультативных гибернантов (Yacoe, 1983; Wickler et al., 1987; Wang L.s 1987; Brigham et al., 1990; Koebel et al., 1991; Steffen ct al., 1991; Agostini et al., 1991; Rourke et al., 2004): существенно уменьшается масса отдельных мышц (на 15-60%) на фоне снижения содержания в них белка (на 20-50%) и РНК (па 35%), наблюдается уменьшение площади поперечного сечения мышечных волокон. Описанные атрофические изменения в большей степени наблюдаются в быстрых скелетных мышцах зимоспящих животных (Wickler et al., 1991; Steffen et al., 1991; Agostini et al., 1991), что согласуется с недавно полученными данными об увеличении доли медленных изоформ тяжелых цепей миозина в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке (Rourke et al., 2004). Эти изменения также могут быть следствием трансформации быстрых мышечных волокон в медленные в период подготовки животного к зимней спячке, что подтверждается данными о значительном увеличении в мышцах гибернирующих сусликов мРНК, кодирующей медленные изоформы легких цепей миозина (Storey & Storey, 2000).
В нашей лаборатории на протяжении ряда лет проводятся исследования адаптационного поведения белков сократительных нитей скелетных мышц сусликов при зимней спячке. Были изучены адаптационные изменения изоформного состава и функциональных свойств миозина и миозин-содержащих нитей скелетных мышц зимоспящих сусликов и вклад этих изменений в подавление двигательной активности указанных мышц при зимней спячке (Лукоянова и др., 1996; 1997а; 19976). Было обнаружено уменьшение (в 2 раза) количества быстрых изоформ тяжелых и легких цепей в препаратах миозина скелетных мышц гибернирующих сусликов, что приводило к значительному снижению актин-активируемой АТФазной активности и Са2+ -чувствительности сформированных ш vitro миозиновых нитей. Показано также, что изменения изоформного состава миозина при зимней спячке приводят к снижению способности формируемых им нитей связываться с фосфофруктокиназой (ФФК) -ключевым ферментом гликолиза (Lukoyanova et al., 1996). Если учесть, что связывание ФФК с миозин-содержащими нитями играет важную роль в синхронизации запуска сократительной и гликолитической систем мышцы, а также снижает время доставки АТФ к АТФ-гидролизующим центрам миозина во время сокращения (Подлубная, 1992), то обнаруженное для миозина скелетных мышц гибернирующих сусликов уменьшение связывания будет вносить вклад в ингибирование сократительной способности скелетных мышц при зимней спячке. Вполне вероятно, что адаптационные изменения будут происходить также в тайтине и белках его семейства (С-белке, Х-белке), тесно связанных с толстыми нитями в районе Л-диска cap номеров. Однако подобные исследования до сих пор не проводились.
В условиях реальной или моделируемой микрогравитации скелетные позно-то ни чес кие мышцы млекопитающих испытывают драматические структурно-функциональные изменения. Комплекс этих изменений можно представить, как своеобразный «гипогравитационный мышечный синдром», который проявляется в снижении мышечного тонуса и силы мышечных сокращений, выраженных, преимущественно, в гравитационной мускулатуре ног и туловища (Какурин и др., 1971; Berry, 1973). При длительных воздействиях микрогравитации эти нарушения осложняются развитием мышечной атрофии, сопровождающейся уменьшением объема мышечных волокон как медленного, так и быстрого типа, деструктивными изменениями миофибриллярного аппарата, дальнейшим снижением тонуса, выносливости и общей работоспособности мышц (Какурин и др., 1971; Berry, 1973; Thomson & Rummel, 1974; Гуровский и др., 1975; Shenkman et al., 1994; McDonald & Fitts, 1995; Fitts et al., 1998; Nemirovskaya et al., 2002). Эти перестройки обусловлены глубокими сдвигами внутриклеточных процессов, приводящих к изменению уровня синтеза саркомсрных белков скелетных мышц, в частности, трансформации миозинового фенотипа в сторону увеличения доли быстрых изоформ тяжелых цепей миозина (Oganov et al., 1982; Thomason et al., 1990; Talmadge et al., 1996).
Гель-электрофорез белков в присутствии ДСН и денситометрия гелей
Для обнаружения изоформ и инвариантов тайтина с молекулярной массой более 3 МДа нами применялись крупнопористые полиакриламидпые гели с добавлением агарозы по методу (Tatsumi & Hattori, 1995). Методика приготовления таких гелей заключалась в следующем: к раствору, содержащему определенное количество акриламида (соотношение акриламида к бис-акриламиду 36.5:1), ДСН, трис-HCl буфера, рН 8.6-8,8 и нафетому до температуры 40СС, добавляли агарозу до концентрации 0.5%. Конечная концентрация акриламида составляла 2-2.3%, ДСН — 0.1%, трис-HCl буфера — 0.375 М. Полимеризация инициировалась добавлением 0.058% тетраметилэтилендиамина и 0.075% персульфата аммония и осуществлялась в течение 2-х часов при температуре 4С. В наших экспериментах мы использовали гелевый буфер с рН 9.0-9.2 вместо 8.6-8.8, что способствовало увеличению электрофореческой подвижности тайтина в геле.
Методика градиентных гелей не претерпела в нашей работе значительных изменений. Отметим только, что концентрация буфера (трис-HCl, рН 8.6), насыщающего гель, в наших экспериментах составляла 0.5 М, а не 0.375 М. Гель также содержал от 2.5—3 % до 9-12 % полиакриламида (соотношение акриламида к бис-акриламиду 36.5:1), 0.1% ДСН, 0.05% тетраметилэтилендиамина, 0.05% персульфата аммония.
Нами был также изменен процесс приготовления электрофоретических проб. Обычно для лучшей солюбилизации белков электрофоретические пробы перед проведением электрофореза нагревают до 80-100С в течение нескольких минут. При этом в мышечных пробах увеличивается вероятность протеолиза тайтина эндогенными протеазами. Для предотвращения протеолиза тайтина применяется протеолитический ингибитор леупептин, что, однако, не исключает разрушающего действия на тайтин температур выше 57С (Granzier & Wang, 1993). В наших экспериментах образцы скелетных мышц инкубировались в течение 30-40 минут при комнатной температуре в солюбилизирующем растворе, содержащем 10 мМ трис-НС1, 1% ДСН, 10% глицерина, 6 мМ ЭДТА, 80 мМ ДТТ, 8 мкг/мл леупептина, рН 6.8-7.0. Денатурацию белковых препаратов (тайтина, С-белка, Х-белка) также проводили без дополнительного нагревания, инкубируя пробы в течение 30—40 минут при комнатной температуре в солюбилизирующем растворе, содержащем 12 мМ трис-НС1, 0.5% ДСН, 5% глицерина, 16 мМ ДТТ, рН 6.8-7.0. Денатурацию миозина и актина проводили в течение 2-3 минут при 95-100С в том же солюбилизирующем растворе.
Чистоту выделенных препаратов тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц кролика и сусликов проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза в 7% полиакриламидном геле по методу (Fritz et al., 1989) с нашими модификациями. Чистоту вьше ленных препаратов миозина и актина скелетных мышц кролика проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза в 13% полиакриламидном геле по методу (Laemmli, 1970).
Электродный буфер при проведении электрофореза содержал 0.192 М глицина, 0.025 М трис и 0.1% ДСН, рН 8.3. Электрофорез проводили при токе 3-5 мА первые 30-60 минут, после этого поднимали напряжение до 12-15 мА. По окончании электрофореза гели фиксировали в растворе, содержащем 10% этанола и 10% уксусной кислоты, в течение 20-30 минут. Затем гели окрашивали в течение 30-40 минут в растворе, содержащем 0.1% кумасси G-250 и R-250 (смешанных в пропорции 1:1), 45% этанола и 10% уксусной кислоты. Отмывка окрашенных гелей проводилась в 7% уксусной кислоте. Отмытые гели сканировали на сканере «UMAX Astra 4450». Денситометрия белковых полос в геле проводилась с помощью компьютерной программы Total Lab 1.11. В таблицах приведены средние арифметические величины соотношений интегральных плотностей соответствующих белковых полос на гелях и их стандартные ошибки.
Иммуноблоттинг тайтина проводили по методу (Towbin et al., 1970), Перенос белка из полиакриламидных гелей на нитроцеллгалозные мембраны (диаметр пор 0.45 мкм) после электрофореза проводили в трис-глицин/метанольном буфере с добавлением ДСН при напряженности поля 0.8 мА/см2 в течение 15-30 часов при постоянном охлаждении. Неспецифическую сорбцию мембран блокировали 5% раствором обезжиренного молока в фосфатном солевом буфере (ФСБ) в течение 1 часа при комнатной температуре. Инкубацию как с первичными, так и вторичными антителами проводили в течение 1 часа в ФСБ с 0.05% Твин-20. Использовали моиоклональные антитела 9D10 к PEVK-области тайтина в І-диске саркомера. В качестве вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, использовали кроличьи антитела против IgG мышей. Белковые полосы выявляли с помощью 3.3 -диаминобензидина. Время экспозиции иммуноблотов варьировали от 1 до 20 минут в зависимости от интенсивности окраски.
Изменение степени фосфорилирования регуляторних легких цепей миозина скелетных мышц сусликов при гибернации определяли электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии мочевины согласно методу (Perrie & Perry, 1970). Гель содержал 8 М мочевины, 8% акриламида, 0.128% метиленбисакриламида, 25 мМ трис, 122 мМ глицина, рН 8.6. Полимеризация осуществлялась добавлением 1.5% персульфата аммония и 0.2% тетраметилэтилендиамина. Электродный буфер содержал 25 мМ трис и 122 мМ глицина, рН 8.6. Белковые препараты денатурировали при 100С в течение 3-5 минут в смеси, содержащей 8 М мочевины, 10 % р меркаптоэтанола и 0.05% бромфенолового синего. Электрофорез проводили в течение 2-2.5 часов при напряжении 150 Вольт. Гели окрашивали раствором, содержащим 0.125% кумасси G-250 и R-250 (смешанных в пропорции 1:1), 45% этанола и 10% уксусной кислоты. Отмывка гелей проводилась в 7% уксусной кислоте.
Взаимодействие тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц кролика и суслика с миозином в норме
Учитывая, что в медленной мышце soleus преобладает N2A изоформа тайтина с м,в. 3700 кДа, а в быстрой мышце psoas — N2A изоформа тайтина с м.в. 3400 кДа (Freiburg et al., 2000), можно предположить, что в мышцах сусликов длинные изовариапты тайтина более характерны для медленных волокон, а короткие изовариапты - для быстрых мышечных волокон. В таком случае, обнаруженное нами уменьшение количества коротких изовариантов тайтина в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке может свидетельствовать о преимущественной деградации быстрых мышечных волокон в этот период с характерными для них изоформами белков. В пользу этого предположения могут быть приведены и другие данные. Известно, что быстрые волокна скелетных мышц наиболее чувствительны к изменению нейротрофического контроля. При денервации или стимуляции мышцы с низкой частотой они более быстро атрофируются (Bacou et al., 1996). Подобным образом быстрые волокна могут атрофироваться во время зимней спячки, когда практически отключена система нервной стимуляции скелетных мышц, а процессы биосинтеза белка заингибированы низкой температурой (Жегунов и др., 1993). Еще одним подтверждением этого предположения могут быть наши электрофоретические данные, показывающие, что наряду с уменьшением количества С-белка в m. psoas гибернирующих сусликов часто наблюдалось уменьшение его молекулярного веса, что может быть следствием укорочения молекул С-белка в результате их деградации.
Таким образом, обнаруженное нами уменьшение количества С-белка и коротких изовариантов тайтина при отсутствии изменений количества Х-белка и длинных изовариантов тайтина в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке может свидетельствовать об избирательной атрофии быстрых мышечных волокон при гибернации и сохранении медленных волокон с характерными для них изоформами белков. Каково физиологическое значение выявленных нами изменений? Принимая во внимание наши результаты об активирующем эффекте С-белка и ингибирующем эффекте Х-белка на актин-активируемую АТФазную активность миозина, можно предположить, что снижение количества С-белка и сохранение количества Х-белка при гибернации (наряду с увеличением его степени фосфорилирования) вносят вклад в подавление сократительной активности скелетных мышц сусликов в этот период. Тайтин из мышц гибернирующих животных слабее активирует АТФазу актомиозина и снижает ее Са +-чувствителыюсть по сравнению с эффектами тайтина из мышц активных сусликов. Можно предположить, что помимо эффекта фосфорилирования, увеличение доли длинных изовариантов тайтина также будет вносить вклад в подавление двигательной активности мышц при зимней спячке. Различные эффекты изовариантов тайтина на функциональные свойства актомиозина можно объяснить разницей в их первичной структуре и заряде.
В заключение следует отметить, что уменьшение относительного количества С-белка и «быстрых» изоформ тайтина в мышцах гибернирующих животных может указывать также и на трансформацию быстрых волокон в медленные при зимней спячке. Это предположение подтверждается данными и об уменьшении количества быстрых изоформ тяжелых и легких цепей миозина при гибернации (Лукоянова и др., 19976; Rourke et al., 2004), и результатами о значительном увеличении в мышцах гибернирующих сусликов количества мРНК, кодирующей медленные изоформы легких цепей миозина (Storey & Storey, 2000).
Таким образом, на основании анализа собственных результатов и литературных данных можно предположить, что у зимоспящих сусликов (Citellus undnlatus) имеется эволюционно закрепленный адаптационный механизм избирательной атрофии быстрых мышечных волокон скелетных мышц и сохранения (или увеличения) медленных волокон как наиболее выносливых и энергетически более выгодных с характерными для них изоформами белков. Такая адаптация направлена па ингибирование сократительной активности скелетных мышц для экономии энергетических ресурсов, что необходимо для выживания животного в экстремальных условиях спячки и выхода из нее без патологических последствий.
Проведено изучение сезонных изменений структурно-функциональных свойств тайтина, С-белка и Х-белка скелетных мышц зимоспящих сусликов и их вклада в подавление сократительной активности мышц при гибернации.
1. Обнаружено увеличение степени фосфорилирования тайтина и Х-белка в скелетных мышцах гибернирующих сусликов, что приводит к снижению активирующего влияния тайтина и увеличению ингибирующего влияния X-белка на ферментативные и регуляториые свойства миозина. Сделано предположение, что увеличение степени фосфорилирования саркомерных цитоскелетных белков при гибернации вносит вклад в подавление сократительной активности мышц в этот период;
2. Выявлено уменьшение количества С-белка и коротких изовариантов тайтина при отсутствии изменений количества Х-белка и длинных изовариантов тайтина в скелетных мышцах сусликов при зимней спячке, что может являться результатом преимущественного катаболизма быстрых мышечных волокон в этот период и сохранения медленных волокон с характерными для них изоформами белков. Такая адаптация будет способствовать выживанию животного в экстремальных условиях спячки и выходу из нее без патологических последствий.
Поскольку в условиях микрогравитации происходит атрофия мышц, нам чрезвычайно интересно было сравнить поведение тайтина и Х-белка в m. soleus в условиях микрогравитации и при гибернации.
Похожие диссертации на Изучение тайтина и белков его семейства в скелетных мышцах в норме, при гибернации и микрогравитации
