Введение к работе
Актуальность проблемы. Создание эффективных продуцентов
аминокислот - комплексная задача, требующая решения множества проблем, связанных с различными сторонами жизнедеятельности бактерий. К ним можно отнести увеличение экспрессии биосинтетических генов, достаточный уровень предшественников требуемой аминокислоты, энергетическое обеспечение биосинтеза и жизнедеятельности клеток и т.д. Одной из таких важных задач является эффективный транспорт синтезированной аминокислоты из бактериальной клетки. Выброс из клетки продукта может сдвинуть в нужном направлении равновесие в цепи необходимых биохимических реакций, решить проблему негативного контроля синтеза целевого продукта, который в большинстве случаев осуществляет аминокислота, не допустить накопления в клетке ее токсических количеств. Наряду с чисто прикладными задачами, проблема переноса вещества через цитоплазматическую мембрану имеет важное значение и в фундаментальном аспекте, поскольку именно этот процесс обеспечивает проникновение питательных веществ в клетку, поддерживает клеточный гомеостаз и необходим для вывода токсичных метаболитов.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось обнаружение новых генов Е.соИ, участвующих в транспорте аминокислот. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1) осуществить поиск среди всех неохарактеризованных открытых рамок
считывания полного генома Е.соИ тех, которые могут кодировать
транспортеры аминокислот;
-
исследовать эффект амплификации отобранных генов на уровень устойчивости клеток Е.соИ к ингибирующим концентрациям аминокислот и их аналогов, а также на скорость поглощения ими природных аминокислот;
-
оценить влияние амплификации изучаемых генов на продукцию штаммов Е.соИ - продуцентов различных аминокислот;
4) провести компьютерный анализ upstream-областей изучаемых генов на предмет обнаружения вероятных сайтов связывания регуляторных белков Е. coli.
Научная новизна и практическая ценность работы. На основании
сравнительного анализа генома E.coli с геномами других организмов отобрано 30 ^охарактеризованных на момент выполнения работы гипотетических белков E.coli (открытых рамок считывания), имеющих гомологию с известными транспортерами или белками систем множественной лекарственной устойчивости.
Изучено влияние повышенной экспрессии этих генов на уровень устойчивости клеток E.coli к 50 соединениям различной химической природы. Обнаружено, что амплификация (в некоторых случаях инактивация) 20 исследуемых генов приводит к изменению устойчивости модельного штамма Е. со И TG1, причем 14 из них влияют на устойчивость бактерий к ряду аминокислот или их аналогов.
Измерены скорости поглощения 18 природных аминокислот клетками модельного штамма Е. coli TGI при амплификации изучаемых генов. Показано, что повышенная экспрессия 5 генов сказывается на скорости поглощения некоторых аминокислот клетками данного штамма.
Исследовано влияние повышенной экспрессии изучаемых генов на продуктивность десяти штаммов E.coli - продуцентов различных природных аминокислот. Обнаружено, что при амплификации 9 генов происходит изменение уровня накопления синтезируемой аминокислоты некоторыми штаммами-продуцентами.
Компьютерный анализ upstream-областей изучаемых генов выявил перед 16 из них предполагаемые места связывания 10 различных регуляторов E.coli. Кроме того, в регуляторной области двух исследуемых генов были обнаружены возможные места связывания неохарактризованных на данный момент регуляторных белков.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на VIII-ой Международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 17-21 мая 2004г.); Смотре-конкурсе работ сотрудников АГРИ (Москва, 14-18 июня 2004 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано пять печатных работ, из них одна в отечественном журнале, одно тезисное сообщение в материалах научной конференции и три патента.
Структура работы. Диссертация изложена на стр. печатного текста,
включая 17 рисунков и 12 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы по теме, описания методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, выводов и списка цитированной литературы (119 наименований).
Похожие диссертации на Поиск новых генов Escherichia Coli, участвующих в экспорте аминокислот
