Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Классы сайт-специфических дезоксирибонуклеаз 13
1.2. Хоминг-эндонуклеазы как особый класс ферментов 14
1.3. ОЕС хоминг-эндонуклеаз І являются мобильными генетическими элементами 23
1.4. Хоминг-эндонуклеазы фага Т4 25
1.4.1. Семейство бактериофагов Т4-типа на примере бактериофага Т4 25
1.4.1.1. Классификация фагов Т4-типа. Исключение фагом Т4 близкородственных фагов 25
1.4.1.2. Особенности структуры ДНК бактериофага Т4 29
1.4.1.3. Особенности развития бактериофага Т4 31
1.4.2. Кодируемые нитронами хоминг-эндонуклеазы фага Т4 36
1.4.3. Хоминг-эндонуклеазы фага Т4 внеинтронной локализации 37
1.4.4. Транскрипция кластера генов тРНК бактериофага Т4 41
1.4.5. Регуляция экспрессии генов хоминг-эндонуклеаз фагаТ4 42
1.5. Практическое применение хоминг-эндонуклеаз 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Материалы 49
2.1.1. Штаммы бактерий и бактериофаги 49
2.1.2. Плазмидные вектора и рекомбинантные плазмиды 51
2.1.3. Праймеры 57
2.1.4. Среды, основные буферы и растворы 59
2.1.5. Материалы и реактивы 63
2.2. Методы исследования 64
2.2.1. Получение плазмидной ДНК и определение ее концентрации 64
2.2.2. Получение геномной ДНК 66
2.2.3. Получение компетентных клеток Е. coli и трансформация 67
2.2.4. Получение электрокомпетентных клеток Pseudomonas и электропорацня 68
2.2.5. Полимеразная цепная реакция (ПНР) 68
2.2.6. Гидролиз ДНК эндонуклеазами и лигирование фрагментов ДНК 69
2.2.7. Конструирование плазмид и секвенирование ДНК 70
2.2.8. Анализ рекомбинантных клонов 70
2.2.9. Электрофоретическое разделение ДНК 71
2.2.10. Электрофорез белков в ПААГ 72
2.2.11. Экспрессия ОРС segB 72
2.2.12. Очистка эндонуклеазы SegB и определение концентрации белка 73
2.2.13. Определение эндонуклеазной активности SegB in vitro 73
2.2.14. Определение точек расщепления и границ сайта узнавания SegB 74
2.2.15. Конструирование бактериофага B20Ase,gB 75
2.2.16.' Получение Т-четных бактериофагов и титрование 75
2.2.17. Очистка Т-четных бактериофагов равновесным ультрацентрифугированием в градиенте CsCl 76
2.2.18. Скрещивание бактериофагов и анализ потомства 76
2.2.19. ДНК-ДНК гибридизация (гибридизация по Саузерну) 77
2.2.28. Программное обеспечение 79
2.2.29. Конъюгативный перенос плазмид 79
2.2.30. Введение ОРС segB и segD в хромосому штамма PAOl P. aeruginosa и segD в хромосому штамма Q8rl-96 P. Jluorescens 81
2.2.31. Экспрессия генов segB и segD в клетках штаммов YAOsegB и VAOsegD
P. aeruginosa 81
2.2.32. Внесение делеций в хромосому штаммов ^AOsegB[phzS::Tc] и PAOsegD[phzS::Tc] P. aeruginosa 82
2.2.33. Измерение частоты возникновения спонтанньк мутаций в штаммах РА01 и Aeruginosa 82
2.2.34. Фенотипический анализ штамма Q8rl-96 P. Jluorescens и полученных на его основе мутантов 83
2.2.34.1. Приготовление культуры и ее тестирование 83
2.2.34.2. Проведение морфологического сравнения колоний 83
2.2.34.3. Анализ способности клеток использовать в качестве источников углерода различные соединения 83
2.2.34.4. Измерение кинетических параметров роста 83
2.2.34.5. Анализ способности продуцировать сидерофоры и экзопротеазу 84
2.2.34.6. Анализ способности продуцировать 2,4-диацетилфлороглюцинол 84
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение..- 85
3.1. Поиск сайта гидролиза для эндонуклеазы SegB в популяции Т-четных бактериофагов 85
3.2. Определение структуры кластера генов тРНК фагов RBI, RB3 и T2L 86
3.3. Ген segB кодирует сайт-специфическую эндонуклеазу 90
3.4. Биохимические особенности эндонуклеазы SegB 91
3.5. Предпочтительный сайт расщепления SegB находится в последовательности гена тРНК^" Т-четных фагов 98
3.6. Определение точек гидролиза и границ сайта узнавания SegB в области гена тРНКАя1фага,Г2Ь 99
3.7. Определение точек расщепления эндонуклеазой SegB в последовательностях отдельных генов тРНК фага T2L и реконструирование сайтов узнавания 102
3.8. Анализ специфичности SegB на гликозилированной ДНК фагов Т4 и T2L 105
3.9. Эндонуклеаза SegB инициирует нереципрокный генетический обмен между бактериофагами Т4 и Т2 109
ЗЛО. Изучение возможности использования SegB для направленного введения мутаций в геном бактерии рода Pseudomonas 114
3.10.1. Специфичность SegB при гидролизе геномной ДНК бактерий P. aeruginosa иЕ. coli 114
3.10.2. Разработка системы направленного мутагенеза с использованием. хоминг-эндонуклеазы SegB или SegD и тестирование ее в штамме PAOl P. aeruginosa 116
3.10.3. Внесение делеции в геном P. aeruginosa штаммов VAOsegB\phzS::Tc] и PAOsegD\phzS::Tc] за счет внутрихромосомной рекомбинации, инициируемой эндонуклеазами SegB или SegD 124
3.11. Тестирование системы Seg-индуцированного направленного мутагенеза с использованием эндонуклеазы SegD в штамме Q8rl-96 P.fluorescens 128
Заключение 133
Выводы 136
Список литературы
- ОЕС хоминг-эндонуклеаз І являются мобильными генетическими элементами
- Получение плазмидной ДНК и определение ее концентрации
- Определение эндонуклеазной активности SegB in vitro
- Биохимические особенности эндонуклеазы SegB
Введение к работе
Хоминг-эндонуклеазы являются сайт-специфическими дезоксирибонуклеазами, особенность которых заключается в способности этих ферментов узнавать протяженные (от 12 до 40 п.н.), вырожденные и асимметричные последовательности. На основе присутствия в структуре хоминг-эндонуклеаз определенных консервативных аминокислотных мотивов их разделяют на четыре семейства: LAGLIDADG, His-Cys, GIY-YIG и H-N-H (Belfort and Roberts, 1997; Stoddard, 2005), наиболее изученными из которых являются первые два семейства.
Гены, кодирующие хоминг-эндонуклеазы, как правило, являются несущественными "эгоистичными" генами и кодируются открытыми рамками считывания (ОРС), находящимися внутри интронов, интеинов, а также в межгенных областях, и найдены как у эукариот (в основном грибов) и прокариот, так и у архей и вирусов (Stoddard, 2005). Основная функция этих генов заключается в обеспечении распространения тех элементов, в которых они находятся, или собственных ОРС, в случае свободностоящих генов. Впервые этот феномен был открыт при изучении интрона СО митохондриального гена 21S рРНК Saccharomyces cerevisiae (Dujon, 1980). При смешивании со "- и со +-штаммов наблюдалась нереципроктная конверсия со ' в со (Coen et al., 1970). Позже было установлено, что для конверсии необходим двухцепочечный разрыв в со "-аллеле, который вносится эндонуклеазой I-Scel, кодируемой со +-аллелем (Jacquier and Dujon, 1985; Macreadie et al., 1985; Zinn and Butow, 1985; Colleaux et al., 1986). Рекомбинационно-зависимая репарация двухцепочечного разрыва происходит с использованием интрон-содрежащей цепи в качестве матрицы. В результате, интрон встраивается в свой собственный сайт инсерции — сайт хоминга, что приводит к его доминантному наследованию. Этот процесс был назван хомингом (от англ. homing — "возвращение домой"), а инициирующие его ферменты - хоминг-эндонуклеазами. В дальнейшем, для большинства интронов I группы была показано, что их перемещение зависит от экспрессии генов, кодирующих хоминг-эндонуклеазы (Lambowitz and Belfort, 1993; Loizos et al., 1994). Известны примеры (I-Hmul и I-HmuII), когда хоминг инициируется внесением одно-, а не двухцепочечного разрыва в ДНК, однако точный механизм этого процесса пока не установлен (Landthaler et al., 2004).
Лишь для некоторых эндонуклеазных генов отмечено, что кодируемые ими ферменты, помимо хоминга, задействованы и в других молекулярно-биологических процессах. Например, НО-эндонуклеаза участвует в переключении типа спаривания у
дрожжей, а интронкодируемая матураза I-Anil, схожая с хоминг-эндонуклеазами, участвует в сплайсинге интрона (Weiffenbach and Haber, 1985; Geese et al., 2003).
Наибольшее количество генов, кодирующих хоминг-эндонуклеазы, обнаружено в геномах бактериофагов (Edgell et al., 2000). Так, у бактериофага Т5 среди 162 предполагаемых ОРС, по крайней мере, 9 кодируют хоминг-эндонуклеазы (асе. no AY543070), а у фага Т4 из 289 - 14 (Miller et al., 2003). Из хоминг-эндонуклеаз, кодируемых фагом Т5, в настоящее время охарактеризовано только три фермента: F-Tfll, F-TflII и F-TflIV, относящихся к H-N-H-семейству (Акуленко и др., 2004). Из 14 генов фага Т4 два были обнаружены в самосплайсирующихся интронах I группы. Эти ОРС кодируют функционально активные сайт-специфические эндонуклеазы I-TevI и I-TevII, относящиеся к GIY-YIG-семейству. Остальные 12 являются свободностоящими генами, кодирующими группу Seg-белков (А, В, С, D, Е, F и G) и предполагаемых Mob-белков (А, В, С, D и Е), относящихся к GIY-YIG- и H-N-H-семейству, соответственно (Sharma et al., 1992; Miller et al., 2003). Mob-белки в настоящее время не изучены, а наиболее изученными Seg-белками являются SegA, SegE, SegF -- и SegG (Sharma and Hinton, 1994, Kadyrov et al., 1996a; Belle et al., 2002; Liu et al., 2003).
В1 настоящее время* продолжается обсуждение факта, наличия^ такого количества "эгоистичных" генов в геноме фагов в связи с их возможной функциональной ролью. В частности, Белле с соавт. было высказано предположение, что явление исключения большинства генетических маркеров T2L, наблюдаемое в смешанных инфекциях с Т4, является совместным результатом действия хоминг-эндонуклеаз фага Т4 (Belle et al., 2002). Возможно, что одним из объяснений наличия 14 "эгоистичных" генов хоминг-эндонуклеаз в сравнительно небольшом геноме фага Т4 (166 т.п.н.) является приобретение фагом Т4 эволюционного преимущества перед родственными фагами.
Настоящая работа посвящена изучению хоминг-эндонуклеазы SegB бактериофага Т4. Ген segB располагается в несущественной для развития-фага Т4 области генов тРНК между I и II подкластерами (Fukada and Abelson, 1980). Предположение о том, что ген segB бактериофага Т4 кодирует сайт-специфическую эндонуклеазу было высказано в работе Шарма с соавт. (Sharma et al., 1992). Кадыровым и Крюковым из нашей лаборатории было установлено, что ОРС segB имеет длину 666 п.н. (GenBank, асе. no Z69338).
Цель и задачи исследованиия;.
Цель данной работы заключалась в изучении свойств; эндонуклеазы SegB: бактериофага Т4, ее роли в генетическом обмене между Т-четными;бактериофагами, а также возможности использования SegB для направленного введения мутаций в геном бактерии рода Pseudomonas.
В соответствии^ с целью работы были поставлены следующие задачи: проанализировать структуру кластеров генов тРНК у Т-четных бактериофагов, с целью поиска сайта гидролиза SegB;
получить очищенный препарат SegB и? охарактеризовать биохимические свойства белка;
установить предпочтительньш сайт гидролиза SegB и охарактеризовать особенности взаимодействия фермента с ДІЖ;
изучить возможную роль SegB в генетическом обмене между Т-четными бактериофагами в области генов тРНК;
проанализировать частоту^ встречаемости сайтов SegB в геномах бактерий 1 coli и Р! aeruginosa, а также способность эндонуклеаз SegB и і SegD узнавать искусственно введенные собственные сайты в геноме P. aeruginosa;
изучить, способность эндонуклеаз SegB; и SegD стимулировать рекомбинацию в бактериях рода Pseudomonas и разработать на их основе систему направленного внесения мутаций в геном этих бактерий.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института-биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина РАН;
Научная новизна работы.
Полученные в настоящей работе данные о свойствах хоминг-эндонуклеазы SegB расширяют наши знания о хоминг-эндонуклеазах, принадлежащих к мало изученному GIY-YIG-семейству.
При поиске сайта гидролиза SegB > была определена структура ранее не изученного кластера генов тРНК фагов RBI, RB3 и T2L. В отличие от Т4, у этих фагов отсутствует ген segB и фланкирующие его гены тРНК, которые замещены генами, кодирующими тРНКМе1, тРНКТуг, тРНК^" и изоакцепторную тРНК^. Кроме того, у бактериофага T2L найдены две ОРС trna.l и trna.2 неизвестной функции.
Охарактеризован новый фермент — хоминг-эндонуклеаза SegB, которая является Mg -зависимой сайт-специфической эндонуклеазой и обладает ярко выраженной иерархией в узнавании сайтов. Предпочтительный сайт узнавания обнаружен в гене тРНК^" фага T2L, а менее предпочтительные — во всех остальных генах тРНК T2L. Показано, что сайт узнавания SegB является протяженным (27 п.н.), асимметричным и вырожденным. Существенным элементом узнавания SegB- является- последовательность RGTTCRANYCY, кодирующая консервативный элемент Тц/С-ветви тРНК, а последовательность CCR позиционирует точку разрыва.
На основе полученных результатов о характере взаимодействия SegB с субстратом, а также анализа аминокислотной последовательности (база данных Pfam; Sitbon and Pietrokovski, 2003), было выдвинуто предположение, что структурная организация белка, а также характер узнавания и гидролиза ДНК, укладывается в модель, предложенную для I-Tevl. По-видимому, также как и I-TevI, SegB состоит из N-концевого каталитического и С-концевого ДНК-связывающего доменов. В пользу того, что домены связаны между собой гибким линкером, свидетельствует способность SegB смещать основную точку разрыва относительно нахождения CCR.
По-видимому, фермент узнает ДНК по малой бороздке, т.к. природные модификации ДНК Т-четных фагов (гликозилирование и оксиметилирование) не влияют на специфичность и эффективность гидролиза SegB.
Установлено, что ген segB фага Т4 является "мобильным эндонуклеазным геном", который обеспечивает генетический обмен между фагами Т4 и T2L в процессе генной конверсии.
Предложен способ регуляции экспрессии гена segB на уровне трансляции, которая объясняет механизм защиты фага Т4 от кодируемых им эндонуклеаз с вырожденным сайтом узнавания.
Научно-практическое значение работы.
Данные о сайте узнавания и о двухдоменной организации SegB могут быть полезны при создании новых эндонуклеаз с заданной специфичностью.
SegB также можно использовать для получения больших фрагментов ДНК, например, с целью их последующего клонирования.
Разработана эффективная система SegD-индуцируемого направленного мутагенеза in vivo в бактериях рода Pseudomonas, которая существенно упрощает процедуру получения мутантов и может быть применена при исследовании функций генов этих бактерий, а также при конструировании штаммов с заданными свойствами.
Полученные в работе результаты могут послужить основой для дальнейшего развития созданной системы и ее адаптации для других бактерий.
Высоко специфичная эндонуклеаза SegD может быть использована для работы с прокариотическими геномами, в частности для внесения делеций в хромосому Pseudomonas.
ОЕС хоминг-эндонуклеаз І являются мобильными генетическими элементами
Как уже упоминалось выше, большинство нуклеазных генов считают молекулярными "эгоистичными" элементами, поскольку основная функция кодируемых ими ферментов заключается в обеспечении хоминга собственного гена - процесса репликативного перемещения гена эндонуклеазы и фланкирующих его последовательностей в гомологичную аллель, в которой данная последовательность отсутствует.
Для описания механизма хоминга была применена модель репарации двухцепочечного разрыва (Szostac et al,1983), которая включает в себя следующие основные этапы: а) эндонуклеаза вносит двухцепочечный разрыв в ДНК реципиентной аллели, не содержащей ген эндонуклеазы; б) экзонуклеазы деградируют ДНК в месте разрьша до гомологичной с донорным аллелем последовательности, что приводит к образованию двухцепочечной "бреши" и З -выступающих концов; этот этап объясняет факт соконверсии фланкирующих ОРС последовательностей; в) рекомбиназы взаимодействуют с З -концом реципиентной ДНК и внедряют его в донорный дуплекс, что вызывает "плавление" последнего и образование D-петли; г) внедрившийся З -конец функционирует как праймер в процессе репаративного синтеза ДНК с использованием цепи, содержащей последовательность гена эндонуклеазы в качестве матрицы; д) после достройки "бреши" донор-реципиентный дуплекс разделяется, что может сопровождаться кроссинговером и приводить к появлению двух дуплексов, содержащих эндонуклеазу (Lambowitz and Belfort, 1993).
Позже, при изучении хоминга интрона td фага Т4 Мюллером с соавт. было сделано заключение, что хоминг может проходить во время рекомбинационно-зависимой репликации фага несколькими путями, описываемыми моделью репарации двухцепочечного разрьша, моделью с вовлечением неидентифицированной топоизомеразной активности, а также моделью одноцепочечного отжига-синтеза (Mueller et al., 1996). Все эти модели различаются лишь конечными стадиями (рис. 2).
В модели репарации двухцепочечного разрыва (DSBR) разделение донор-реципиентного дуплекса вызвано функционированием резолвазы. В топоизомеразной модели (TM) (Thaler et al., 1987; McGill et al., 1989; Hastings, 1992) миграция двух точек перекреста цепей друг к другу приводит к разделению донор-реципиентного дуплекса и обеспечивается топоизомеразой, релаксирующей позитивные витки между двумя точками миграции цепей. В модели одноцепочечного отжига-синтеза (SDSA) донор-реципиентный дуплекс вообще не образуется, т.к. после формирования D-петли происходит синтез только одной из цепей ДНК реципиента по матрице донора, а вторая цепь ДНК реципиента синтезируется по комплементарной новосинтезированной цепи (Lin et а!., 1984).
Джорджем и Крузером была предложена еще одна модель репарации двухцепочечного разрыва, отличная от модели, предложенной Шостаком, — модель экстенсивной хромосомной репликации (ECR), по которой также может проходить хоминг (George and Kreuzer, 1996). В зависимости от места локализации ОРС эндонуклеазы, фланкирующими ОРС последовательностями могут являться последовательности интрона, интеина или близлежащих генов. Соответственно, при перемещении ОРС эндонуклеазы происходит соконверсия и этих последовательностей, которые таким образом приобретают мобильность.
Кажется очевидным функционирование хоминг-эндонуклеазы и интрона как одной единицы. Однако в литературе описаны случаи, когда мобильность интронов I группы обусловлена и не зависящим от хоминг-эндонуклеаз механизмом "обратного сплайсинга" (Birgsdottir and Johansen, 2005) и, с другой стороны, показана способность хоминг-эндонуклеаз перемещаться независимо от интрона (Haugen et al., 2005). Поэтому весьма вероятно, что эволюция каждого из этих элементов происходит как по отдельности, так и в виде одной функциональной. единицы. В природе обнаружено большое количество как полноразмерных, так и неполноразмерных ОРС хоминг-эндонуклеаз с нарушенной функцией, а также гомологичные ОРС нуклеаз в неродственных организмах. В существующей на сегодняшний1 день модели "цикла хоминга" включены процессы как приобретения эндонуклеазного гена в процессе эволюции, так и его потери под воздействием пока еще неопределенных внешних факторов (Gogarten and Hilario, 2006). Однако пока не существует четкого представления об эволюции этих "эгоистических" элементов и селективных силах, действующих на молекулярном уровне. Т4-типа. Исключение фагом Т4 близкородственных фагов
Бактериофаги Т4-типа были впервые описаны в 1945 году (Demerec and Fano, 1945) и являются многочисленной группой, представители которой занимают широкие экологические ниши от пищеварительного канала животных до открытого океана (Miller et al., 2003). Их хозяевами служат представители групп Enterobacteria, Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas и Vibrio (Ackermann and Krisch, 1997).
В литературе описано более 140 бактериофагов, чья морфология сходна с морфологией бактериофага Т4 (Ackermann and Krisch, 1997). Первоначально, фаги были классифицированы как Т4-типа исключительно на основе морфологического критерия. Все они имеют схожую с Т4 умеренно удлиненную структуру головки, а сокращающиеся хвосты заканчиваются сложной структурой базовой пластинки с 6 длинными, изгибающимися хвостовыми нитями, расходящимися от нее. Затем были проверены генетические расхождения некоторых фагов Т4-типа (Miller and Jozwik, 1990; Selick et al., 1993; Repoila et al., 1994; Kutter et al., 1995; Monod et al., 1997; Tetart et al., 2001; Desplats et al., 2002) и с помощью геномной гибридизации было показано, что ДНК фагов Т4 и Т4-типа значительно отличается (Monod et al., 1997).
Наиболее консервативными генами в дивергировавших фагах Т4-типа являются гены, кодирующие структурные белки фага (Monod et al., 1997), а также большинство существенных генов, участвующих в жизненном цикле фага Т4 (Desplats and Krisch, 2003). На основе сравнения последовательности трех основных вирусных структурных белков gpl8, gpl9 (структурные белки отростка) и gp23 (структурный белок капсида), фаги Т4-типа разделяют на четыре подгруппы с возрастающим расхождением от Т4: Т-четные (Т2, Т6, большинство RB фагов, изолированных из растений и др.), псевдо-Т-четные (RB42, RB43, RB49 и 44RR), шизо-Т-четные (KVP20 и KVP40) и экзо-Т-четные (S-PM2, S-PWM3) (Desplats and Krisch, 2003; Tetart et al., 2001). Различия между Т-четными фагами составляют около 5 — 15%, в то время как у псевдо-Т-четных фагов только 10% ДНК гибридизуется в жестких условиях с ДНК Т4. Геномы шизо-Т-четных фагов больше генома Т4 приблизительно на 80 т.п.н. (Tetart et al., 2001), а экзо-Т-четные фаги генетически очень сильно отличаются от трех других групп фагов (Hambly et al., 2001). Промежуточное положение занимают "химерные" бактериофаги, такие как Tula, RB69 и SV14, которые имеют частичное сходство с Т-четными и псевдо-Т-четными фагами, что говорит о процессах генетического обмена, происходящих внутри семейства Т-четных фагов. Увеличивающееся разнообразие подгрупп фагов Т4-типа также коррелирует с увеличивающимся филогенетическим расстоянием их хозяев от Е. coli.
Получение плазмидной ДНК и определение ее концентрации
Клетки Pseudomonas выращивали на чашке с LB-агаром при 28 С в течение 12 ч. 150 - 200 мг биомассы трижды отмывали 2 мл охлажденного 10% глицерина при 4 С с последующим центрифугированием ("Эппендорф", модель "miniSpin", 5000 об/мин, 4 С, 3 мин). Осадок ресуспендировали в 100 мкл 10% глицерина, фасовали в мини-пробирки по 50 мкл и хранили при -70 С.
Для электропорации к 50 мкл компетентных клеткок добавляли 100 нг плазмиды и переносили в 1 мм кювету для-электропорации. Электропорацию проводили при режиме 17,5 кВ/Ісм и 12,5 кВ/1см для P. aeruginosa и P.fluorescens, соответственно, на приборе MicroPulser, затем добавляли 1 мл LB и растили в течение 2 ч при 30 С. Затем 1/10 часть клеток высевали на LB-arap, содержащий селективный антибиотик.
ПНР проводили в 50 мкл смеси, содержащей 50 мМ КС1, 10 мМ трис-HCl (рН 8,3), 1,5 мМ MgCb, 200 мкМ каждого из dNTP, 0,5 мкМ 5 - и З -концевых праймеров, 10 нг матричной ДНК плазмиды, 6% ДМСО (при проведении ПНР на GC-богатых матрицах), 1-2 ед. ДНК-полимеразы Tag, Bio-X-Act или ACCUSIME. После предварительной денатурации при 94 С в течение 3 мин следовали 30 циклов: денатурация - 94 С, 20 с; отжиг — 10 с при температуре, равной температуре отжига используемых в данной реакции 5 - и 3 - концевых праймеров; синтез (элонгация) — 72 С, в течение времени, выбиранного в зависимости от размера ситезируемого фрагмента, из расчета 1000 п.н./мин. При анализе клонов бактерий небольшое количество клеток суспендировали непосредственно в ПЦР-смеси, при проведении реакции с фагами в смесь добавляли 0,5 мкл суспензии фагов. .
Гидролиз плазмидной, фаговой ДНК, а также НЦР-фрагментов. Для гидролиза плазмидной, фаговой ДНК, а также ПЦР-фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции использовались буферы, рекомендуемые фирмами-поставщиками. Количество фермента для каждой реакции рассчитывали с учетом количества сайтов на ДНК фага X, а также соотношения длины целевой и фаговой ДНК. Как правило, для гидролиза использовали 4-кратный избыток фермента. При гидролизе ДНК фагов рестриктазой EcoRI использовали "буфер для! проявления специфической активности EcoRI" из расчета 13 ед. фермента на 1 мкг ДНК и "буфер для Проявления неспецифической активности EcoRI" из расчета 43 ед. фермента на 1 мкг ДНК. Для. изучения эффективности гидролиза эндонуклеазой SegB ДНК бактериофагов,: 0,5 мкг интактной или гидролизованной эндонуклеазой рестрикции Smil ДНК бактериофагов!инкубировали с 0,2 - 6 ед. SegBmpn 30 С в течение 1 ч. Для определения размера фрагментов ДНК использовали маркеры ШіпсШІ и "MassRuler DNA Ladder".
Гидролиз геномной ДНК, содержащейся в агарозных блок-вставоках. 1/8 блок-вставки, (около 0,5 мкг ДНК) помещали в мини-пробирки и выдерживали в течение 2 ч в 0,5 мл 0,1х "промывочного буфера" для понижения концентрации ЭДТА. Затем бок-вставку уравновешивали в=200 мкл "буфера для гидролиза" в течение 1ч при комнатной температуре, после чего буфер удаляли, и проводили гидролиз ДНК в 100 мкл реакционной смеси в течение 4 ч. Реакцию гидролиза останавливали выдерживанием блок-вставки в течение 30 мин в 0,5 мл "промывочного буфера".
Лигирование фрагментов ДНК. Для проведения лигирования использовали фрагменты, элюированные из геля /при помощи набора QIAquick Gel Extraction Kit. Реакцию лигирования проводили при 16 С в течение 14 - 16 ч в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 1х буфер для лигирования (содержание dATP в буфере должно быть не меньше 0,5 мМ), 50-100 нг ДНК вектора, 5-кратный молярный избыток клонируемого фрагмента ДНК и 1 - 2 ед. ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-лигазу инактивировали прогреванием при 65 С в течение 10 мин и далее лигазную смесь использовали для трансформации. При лигировании фрагментов по "тупым" концам, обработку вектора проводили щелочной Shrimp-фосфатазой, что позволяет удалить с 5 -концов вектора фосфор и препятствует лигированию вектора самого на себя. Для этого 50 нг гидролизованного вектора обрабатывали 1 ед. фосфатазы в течение 1 ч при 37 С, затем фермент инактивировали прогреванием в течение 20 мин при 65 С и полученную смесь использовали для лигирования. В этом случае при получении ПЦР-фрагмента использовали праймеры, 5 -концы которых были фосфорилированы полинуклеотидкиназой фага Т4. Для этого по 250 пикомолей каждого из праймеров обрабатывали в присутствии 10 ед. полинуклеотидкиназы фага Т4 и 1 мМ dATP в течение 1 ч при 37 С, затем фермент инактивировали прогреванием в течение 20 мин при 65 С и полученную смесь использовали для ПЦР.
Все процедуры клонирования проводили стандартными методами (Sambrook et al., 1989). Секвенирование ДНК проводили в соответствии с протоколом к набору "DTCS" на автоматическом секвенаторе "CEQ2000XL DNA Analysis System". Матрицу для секвенирования готовили следующим образом: а) для секвенирования ПЦР-фрагментов 5 мкл ПЦР-смеси обрабатывали 1 ед. экзонуклеазы фага X и 2 ед. Shrimp-фосфатазы в течение 15 мин при 37 С и ферменты затем инактивировали в течение 15 мин при 85 С; б) для секвенирования плазмиды проводили ее никирование прогреванием в течение 5 мин при 86 С. Стандартная смесь объемом 10 мкл содержала: 6 мкл секвенирующей смеси из набора "DTCS", 1 мкл 5 мкМ праймера и 3 мкл ДНК (количество плазмиды в смеси зависит от ее размера и высчитывается по таблице, прилагаемой к набору). Далее проводили реакцию амплификации в течение 30 циклов: денатурация 95 С (или 96 С для GC - богатых матриц) — 20 с, отжиг 50 С — 20 с и элонгация 60 С — 4 мин. После этого к 10 мкл смеси добавляли 20 мкл Н2О, 3 мкл 3 М ацетата Na, 2 мкл 25 мМ ЭДТА и 1 мкл гликогена (20 мг/мл), перемешивали, добавляли 90 мкл холодного 96% спирта и центрифугировали в течение 15 мин при 12000 об/мин при 4 С. Осадок промывали 2 раза 76% этанолом, сушили влечение 20 мин в вакууме и растворяли в. 16 мкл формамида.
Определение эндонуклеазной активности SegB in vitro
Для вычисления физико-химических параметров белка использовали программу "ProtParam".
Для поиска известных доменов и мотивов в аминокислотной последовательности SegB использовали базу данных "Pfam" (http://pfam.sanger.ac.uk/).
Графическую обработку отсканированных изображений фотографий проводили в программе "OptiQuant v.3.0". Значение "% гидролиза" высчитывали как % яркости полосы от максимально яркой полосы, в качестве которой была использована контрольная проба, содержащая плазмиду pURBlsB, не обработанную SegB. Для построения графиков использовали программу "SigmaPlot Graph v.8.0".
Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили в программе "Kalignvu" (http://msa.cgb.ki.se/cgi-bin/msa.cgi). С помощью программы "BLAST" проводили поиск по базе данных "NCBI" последовательностей, гомологичных ОРС trna.1 и trna.2 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/); в базе данных "NCBI CDD" проводили поиск известных консервативных доменов (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdaVcdd.shtml). С помощью программы "Vienna RNA Secondary Structure Prediction" была предсказана и проанализирована вторичная структура фаговых PHKI, РНКП (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi).
С помощью программы "Mfold" было предсказано наличие шпильки перед ОРС 5eg5(ht ://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfolaVcgi-bin/ma-forml.cgi)
Для анализа полученных результатов при оценке продукции экзопротеазы, сидерофоров и DAPG, использовался программный пакет Statistica 6.0 (StatSoft Inc., http://www.statsoft.ru). При использовании статистических критериев во всех случаях уровень значимости р ограничивался пятипроцентным интервалом (р 0,05).
Скрещивание штаммов S17-1 Е. coli и РА01 P. aeruginosa. Мобилизирующий штамм S17-1 бактерии Е. coli трансформировали плазмидой pUTSBl(Dl), содержащей мутантный ген phzS, или Tcam-CTK\segB(D), содержащей ОРС segBQJ), высевали на среду, содержащую тетрациклин Тс (25 мг/мл), и растили при 37 С в течение 18 ч. Одновременно засевали 3 мл среды 2xYT единичной колонией P. aeruginosa и растили при 28 С в течение ночи на роторной качалке. Через 18 ч клетки Е. coli смывали 1 мл 2xYT. Ночную культуру РА01 и полученные после трансформации клетки S17-1 разводили до ОД590 = 0,4. Затем культуры смешивали в соотношении PAOl : S17-1 как 1 : 15, или 60 мкл РА01 и 900 мкл S17-1 и осаждали ("Эппендорф", модель "miniSpin", 12000 об/мин, 30 с). Клетки мягко суспендировали и растирали шпателем в лунке 6-луночного планшета Nunc (88 х 132). Скрещивание проводили на среде 2х YT, содержащей 0 — 100 мкМ ИПТГ, при 37 С в течение 12 ч. После скрещивания клетки смывали 1 мл 2х YT, 1/20 часть (50 — 75 мкл) высевали на Р1А-среду, содержащую Тс (125 мг/мл) и инкубировали при 37 С до появления индивидуальных колоний в течение двух дней. При анализе эффективности мутагенеза в гене phzS, 50 - 100 выросших колоний анализировали скринингом по устойчивости/чувствительности к Тс, СЬ и сахарозе. При введении ОРС segB(D) в хромосому PAOl, 20 выросших клонов пересевали на LB-среду, содержащую Тс (125 мг/мл) и анализировали с помощью ПЦР с праймерами 40 и 41, специфичными к гену let.
Скрещивание штаммов S17-1 Е. coli и Q8rl-96 P.fluorescens. Мобилизирующий штамм S17-1 бактерии Е. coli трансформировали плазмидой pUT7sDlAp-ssh, содержащей мутантный ген из ssh-локусов 85, 127, 53-1, 53-2, 61, или miniTn7 egD, содержащей ОРС segD. Затем клетки высевали на среду, содержащую канамицин Km (25 мг/мл) или гентамицин Gm (15 мг/мл), соответственно, растили при 37 С в течение 20 ч и смывали 1 мл LB. Одновременно на чашку с LB- или F-агаром высевали штамм Q8rl-96 P.fluorescens и растили при 28 С в течение 14 ч, после чего клетки Q8rl-96 засевали в 3 мл LB и растили при 28 С в течение 6 ч на роторной качалке. Далее 1 мл Q8rl-96 (ОД590 = 0,4) смешивали с 2 мл S17-1 (ОД590 = 0,4) и осаждали ("Эппендорф", модель "miniSpin", 12000 об/мин, 1 мин). Клетки суспендировали и растирали шпателем в лунке 6-луночного планшета Nunc (88 х 132). Скрещивание проводили на LB-arape, содержащем 5 мМ MgS04, 5 мМ СаС12 и 0 - 500 мкМ ИПТГ в течение 16 ч при 37 С. После скрещивания клетки смывали 1 мл LB, осаждали ("Эппендорф", модель "miniSpin", 12000 об/мин, 1 мин) и высевали на F-среду, содержащую рифампицин Rif (100 мг/мл) и Km (25 мг/мл) или Gm (15 мг/мл). Клетки растили при 28 С до появления индивидуальных колоний в течение двух дней. При анализе эффективности мутагенеза в локусах ssh, 48 выросших колоний перекалывали на LB-среду, содержащую Km (25 мг/мл) и анализировали с помощью ПЦР с праймерами, специфичными как к мутантному гену из ssh-локусов 85, 127, 53-1, 53-2 или 61 (праймеры 54 и 55; 56 и 57; 60 и 61; 62 и 63; 64 и 65, соответственно), так и к генам sac, Km, Ыа, расположенным на плазмиде (праймеры 66 и 67; 68 и 69; 70 и 71, соответственно). При введении ОРС segD в хромосому Q8rl-96 P. fluoresceins,, 20 выросших клонов перекалывали на LB-среду, содержащую Gm (15 мг/мл), и анализировали с помощью ПЦР с праймерами 74 и 75, специфичными к гену segD.
Введение ОРС segB и segD в хромосому штамма РА01 P. aeruginosa и segD в хромосому штамма Q8rl-96 P. fluorescens
Плазмиды mini-GTXl.segB(D) или mimTnlsegD конъюгативно переносили в штаммы PAOl P. aeruginosa или Q8rl-96 P. fluorescens, соответственно, как описано выше. После отбора клонов, в которых произошла сайт-специфическая рекомбинация, в случае P. aeruginosa проводили эксцизию векторной части плазмид из хромосом с сохранением последовательностей генов segD и lad в геноме, а в случае P. fluorescens проводили эксцизию генов segD и lad, но после проведения экспериментов по мутагенезу. Эксцизию векторных последовательностей из хромосом проводили с помощью дрожжевой Flp-рекомбиназы. Для этого электрокомпетентные, клетки полученных штаммов PAOminiCTXyeg2?(X ) или Q8rl-96-.yeg.D-85, -127, -53-1 и -53-2 трансформировали плазмидой pFLP2 или pFLPc, соответственно. В случае PAOminiCTXsegi?()) через 19 ч роста при 28 С чашки инкубировали в течение 1 ч при 42 С, затем снова при 28 С в течение 8 ч, тогда как в случае Q8rl-96-segD-85, -127, -53-1 и -53-2 клетки растили в течение двух дней при 28 С, что в обоих случаях вызьтало индукцию Flp-рекомбиназы. Среди клонов был проведен отбор клонов FAOsegB(D), не содержащих векторную часть плазмид, и Q8rl-96-85A, -127А, -53-1А и -53-2Д, не содержащих гены segD иіасі. Для этого, выросшие клоны P. aeruginosa скринировали при помощи ПЦР с праймерами, специфичными к гену tet (праймеры 40 и 41) и ОРС segD (праймеры 74 и 75), а клоны P. fluorescens только с праймерами, специфичными к ОРС segD (праймеры 74 и 75). В обоих случаях происходила 100% эксцизия последовательностей из хромосомы. Для элиминации плазмиды pFLP2 или pFLPc из клеток, единичные колонии были посеяны на LB-arap, содержащий 4% сахарозу.
Биохимические особенности эндонуклеазы SegB
Нуклеаза SegB является небольшим по размеру белком и состоит из 221 аминокислоты. Расчетная молекулярная масса SegB 26 кДа. Однако наличие на N-конце белка последовательности MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH, кодируемой вектором, увеличивает молекулярную массу белка до 28,3 кДа. Электрофоретическая подвижность очищенного SegB (-29 кДа) сравнима с расчетной (рис. 10, А). В то же время для других Seg-эндонуклеаз было отмечено расхождение теоретических и экспериментальных данных по их молекулярной массе. Так, вычисленная молекулярная масса SegD составляет 25,618 кДа, что на 3,618 кДа меньше величины, определенной на основании его электрофоретической подвижности, которая составила 28 кДа (магистерская диссертация, Колосов, 2001). Вычисленная молекулярная масса SegE составляет 22,966 кДа, определенная на основании его электрофоретической подвижности - 27,7 кДа, а оцененная с помощью гель-фильтрации на Сефакриле S-300 - 25 кДа (кандидатская диссертация, Кадыров, 1996). Расхождения в определении молеклярных масс Seg-эндонуклеаз связывают с высоким вычисленным pi, равным 10,1 и 9,7 для SegD и SegE, соответственно. SegB также обогащен положительно заряженными аминокислотами и изоэлектрическая точка SegB 9,43 сдвинута в щелочную область, но это не сказалось на его электрофоретической подвижности.
Чтобы определить биохимические свойства фермента, эндонуклеазную активность SegB тестировали in vitro при различных условиях. В качестве субстрата для анализа использовали линеаризованную по ЕсоЗП плазмиду pURBlsB, содержащую кластер генов тРНК фага RB1 с сайтом гидролиза SegB (см. "Материалы и методы").
При определении зависимости активности SegB от рН оценивали ферментативную активность в различных буферных системах в диапазоне рН от 5 до 10,5. В качестве буферных систем использовали MES буфер (рН 5,0 - 6,0), трис-HCl буфер (рН 7,0 - 9,5) и глицин-NaOH (рН 10 - 10,5). Эндонуклеаза SegB активна в широком диапазоне рН от 6,0 до 10,5 (рис. 11). При рН 5,0 гидролиз отсутствовал. С увеличением рН буфера активность фермента возрастала, и наибольшая скорость гидролиза субстратов достигалась в трис-HGl буфере при рН 8,0 - 9,0.
Результаты исследования влияния температуры на активность SegB представлены, на рис. 12. Максимальная активность SegB наблюдалась при 30 - 35 С. Уменьшение температуры реакционной смеси до 10 С выражается в 5-кратном падении ферментативной активности. При 50 С происходит потеря активности фермента, по-видимому, вследствие его температурной денатурации.
В этих и последующих рисунках, анализ эндонуклеазной активности SegB проводили, как описано в главе "Материалы и Методы".
Общей особенностью многих нуклеаз является использование связанных ионов металлов в качестве кофакторов. Поэтому было проверено влияние основных двухвалентных (Mg2+, Са2+, Mn2+, Zn2+) и моновалентных (Na+, К ) катионов на активность SegB (рис. 13 - 16). В отсутствие в реакционной смеси ионов Ме2+ активность SegB не обнаруживается (рис. 13, проба 2), что указывает на абсолютную необходимость двухвалентных катионов для протекания ферментативной реакции. Ионы Са2+ способны заменить ионы Mg в реакционном буфере, но эффективность гидролиза при этом снижается в 2,5 раза (рис. 13, проба 3), в то время как замена ионов Mg2+ на ионы Мп2+, наоборот, приводит к увеличению эффективности расщепления субстрата приблизительно в 2,6 раза (рис. 13, проба 6) и сопровождается появлением дополнительных участков расщепления. Ионы Zn в 10 мМ концентрации не способны активировать протекание реакции (рис. 13, проба 7).
Большинство эндонуклеаз предпочитают Mg в качестве кофактора для оптимального гидролиза (Cowan, 1998; Cowan, 2002). Для некоторых эндонуклеаз, например РІ-SceI и PI-PfUI, входящих в семейство LAGLIDADG, отмечено появление дополнительных участков расщепления в присутствии ионов Mn + в реакционной смеси (Gimble and Stephens, 1995; Komori et al., 1999a). Считается, что в присутствии Mn2+ происходит ослабление специфичности расщепления некоторых нуклеаз вследствие разницы в координационных сферах ионов Мп2+ и Mg2+, которые включены в обеспечение субстратной специфичности (Guhan and Muniyappa, 2003). Также возможно, что появление дополнительных участков расщепления в субстрате связано с повышением каталитической активности фермента при замене ионов Mg2+ на равное количество ионов Мп2+. Ускорение реакции расщепления может быть следствием лучшей способности ионов Мп уменьшать свободную энергию переходного состояния, образующегося при расщеплении фосфодиэфирной связи. (Galburt and Stoddard, 2002). Наоборот, при замене ионов Mg2+ на Са2+, количество расщепленного субстрата уменьшается (рис. 13, проба 3), что, по-видимому, происходит вследствие уменьшения скорости расщепления субстрата. При одновременном присутствии ионов Са и Mg в реакционной смеси, эффективность расщепления сравнима с таковой в присутствии только ионов Mg2+, из чего можно сделать вывод о большем сродстве ионов Mg2+ к активному центру фермента, чем ионов Са2+ (рис. 13, проба 5).
Считается, что большинство ДНК-гидролизующих ферментов являются Mg-зависимыми ферментами, поэтому была исследована зависимость активности SegB от концентрации этих ионов (рис. 14). Оптимальная концентрация ионов Mg2+ находится в пределах 9-15 мМ.
Для некоторых ферментов (EcoRV, эндонуклеаза V и др.) было показано, что в небольших концентрациях каталитически неактивные катионы могут усиливать расщепление, опосредованное другим катионом, например, Мп или Mg (Vipond et al., 1995; Feng et al., 2006). Поэтому мы проверили, не оказывают ли стимулирующее действие на SegB ионы Zn2+ в присутствии ионов Mg2+. Оказалось, что в присутствии в реакционной смеси 10 мМ ионов Mg2+ и 0,01 мМ ионов Zn2+, уже наблюдается понижение активности фермента примерно на 22%. В присутствии 0,05 мМ ионов Zn + активность SegB ингибируется на 96% (рис. 15).
Похожие диссертации на Свойства эндонуклеазы SegB бактериофага Т4 и ее роль в генетическом обмене между Т-четными бактериофагами
