Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Семейство Т-четные бактериофаги 8
1.1.1. Классификация бактериофагов Т4-типа 8'
1.1.2. Классические Т-четные бактериофаги 9
1.1.3. Явление частичного исключения маркеров у Т-четных фагов 10
1.2. Бактериофаг Т4 11
1.2.1. Особенности структуры и развития бактериофага Т4 11
1.2.2. Рекомбинация у бактериофага Т4. SPC-модель рекомбинации 15
1.3. Хоминг-эндонуклеазы как особый класс ферментов 18
1.3.1. Общая характеристика хоминг-эндонуклеаз 18
1.3.2. Характеристика отдельных семейств хоминг-эндонуклеаз 21
1.3.3. Хоминг-эндонуклеазы фага Т4 26
1.3.4. Молекулярные механизмы хоминга..'. 31
1.3.5. Использование хоминг-эндонуклеаз в научных и практических целях 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 36
2.2. Материалы 36
2.1.1. Среды, основные буферы и растворы 36
2.1.2. Материалы и реактивы 38
2.1.3. Штаммы бактерий и бактериофаги 39
2.1.4. Олигонуклеотиды 41
2.1.5. Плазмидные вектора 41
2.3. Методы исследования 42
2.2.1. Получение компетентных клеток Е. coli и трансформация 42
2.2.2. Получение плазмидной ДНК и определение ее концентрации 43
2.2.3. Получение Т-четных бактериофагов ." 44
2.2.4. Получение фага ХСЕ6 45
2.2.5. Очистка Т-четных бактериофагов равновесным центрифугированием в градиенте CsCl 46
2.1.1. Получение геномной ДНК бактериофагов и бактерий 46
2.2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 47
2.2.7. Гидролиз ДНК эндонуклеазами и лигирование фрагментов ДНК 47
2.2.8. Конструирование плазмид и секвенирование ДНК 48
2.2.9. Анализ рекомбинантных клонов 49
2.2.10. Электрофорез ДНК 50
2.2.11. ДНК-ДНК гибридизация (по Саузерну) 50
2.2.12. Электрофорез белков и определение концентрации белка 51
2.2.13. Экспрессия гена segC и получение препарата белка SegC 51
2.2.14. Получение экстрактов клеток Е. coli, инфицированных фагом Т4 52
2.2.15. Определение эндонуклеазной активности SegC 52
2.2.16. Определение точек расщепления SegC 53
2.2.17. Получение рекомбинатных бактериофагов 53
2.2.18. Скрещивание бактериофагов и анализ потомства 54
ГЛАВА 3. Результаты исследования 57
ГЕН SEGC ФАГА Т4 кодирует хоминг-эндонуклеазу 57
3.1. Анализ области генов 5 - 6 у Т-четных бактериофагов 57
3.2. Ген segC кодирует сайт-специфическую эндонуклеазу 57
3.3. Сайт гидролиза эндонуклеазы SegC в фаге T2L находится непосредственно в сайте инсерции собственной ОРС 61
3.4. SegC активен на модифицированной ДНК Т-четных фагов 61
3.5. Эндонуклеаза SegC инициирует хоминг собственного гена при скрещивании Т4 и T2L 64
Разработка модели и анализ segc-инициируемой рекомбинации вг#-локусет4 67
3.6. Создание модели рекомбинации, основанной на внесении SegC сайт-специфического двунитевого разрыва в гЯ-локус 67
3.7. Зависимость ДНР-инициируемой рекомбинации от расстояния 69
3.8. Сравнение рекомбинации справа и слева от ДНР 71
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 74
ГЕН SEGC ФАГА Т4 кодирует хоминг-эндонуклеазу 74
SegC-инициируемая рекомбинация в r/7-локусе Т4 77
Выводы 80
Список литературы 81
- Классические Т-четные бактериофаги
- Рекомбинация у бактериофага Т4. SPC-модель рекомбинации
- Получение компетентных клеток Е. coli и трансформация
- Сайт гидролиза эндонуклеазы SegC в фаге T2L находится непосредственно в сайте инсерции собственной ОРС
Введение к работе
Хоминг-эндонуклеазы являются особым классом сайт-специфических эндодезоксирибонуклеаз. Первоначально, открытые рамки считывания (ОРС) хоминг-эндонуклеаз были обнаружены в митохондриальных геномах дрожжей в составе мобильных интронов группы I, которые способны перемещаться в безинтронный аллель (явление получило название хоминг, от англ. homing — возвращение домой). Как оказалось, мобильность интронов группы I обусловлена кодируемыми ими сайт-специфическими эндонуклеазами, которые способны дифференцированно узнавать безинтронный аллель и вносить в него разрыв. Репарация поврежденной» молекулы осуществляется по интактной ДНК интрон-содержащего аллеля, что приводит к генной конверсии - замещению безинтронного аллеля интрон-содержащим. В настоящее время известно, что, в дополнение к интронам, хоминг-эндонуклеазы также кодируются интеинами и свободностоящими генами, и распространены- во всех биологических царствах.
Интерес к хоминг-эндонуклеазам обусловлен их структурно-функциональными особенностями. Отличительной чертой хоминг-эндонуклеаз является способность узнавать протяженные (от 12 до 40 п.н.) вырожденные последовательности за счет образования большого числа специфических и неспецифических контактов с ДНК по всей длине сайта узнавания. Как следствие, практически каждаяіхоминг-зндонуклеаза узнает уникальную последовательность ДНК. Структурные и биохимические исследования этих ферментов не только расширяют границы наших представлений о природе ДНК-белковых взаимодействий, но и служат основой для создания эндонуклеаз с заданной специфичностью. Не менее интересны хоминг-эндонуклеазы с точки зрения познания эволюционных механизмов. Как правило, эти ферменты с высокой эффективностью инициируют генетический обмен между близкородственными видами, и, таким образом, участвуют в горизонтальном переносе генетической информации. Бактериофаги, в частности Т-четные, являются удобной моделью для изучения роли хоминг-эндонуклеаз в эволюции. Так, сравнительно небольшой геном фага Т4 (около 169 т.п.н.) содержит, по меньшей мере, 14 генов хоминг-эндонуклеаз, тогда как в родственных ему Т-четных фагах они встречаются редко. Считается, что хоминг-эндонуклеазы ответственны за так называемое явление исключения маркеров — преимущественное наследование маркеров Т4 при скрещивании фагов Т4 и Т2. При этом потомство, унаследовавшее маркеры Т2, является практически полностью рекомбинантным. По-видимому, хоминг-эндонуклеазы могут являться существенным фактором эволюции фагов.
Хоминг-эндонуклеазы могут выступать в роли не только объекта, но и инструмента исследований. В частности, они могут использоваться для изучения механизмов репарации двунитевых разрывов (ДНР) ДНК. ДНР в ДНК могут возникать случайно под действием повреждающих агентов, а также программироваться клеткой (например, при перестройке иммуноглобулиновых генов, переключении1 типа спаривания: у дрожжей, хоминге, мейотической рекомбинации). Неспособность репарировать ДНР'приводит к нестабильности генома-или гибели клетки. Основной путь репарации ДНР основывается на гомологичной рекомбинации. В классической молекулярной генетике исследования рекомбинации базировались на анализе совокупности случайных рекомбинационных событий. Использование модельной системы с детерминированной точкой ДНР в ДНК значительно упрощает анализ и интерпретацию результатов генетических экспериментов. Использование хоминг-эндонуклеаз позволяет создатьтакую систему за счет способности этих ферментов узнавать протяженные редко встречаемые последовательности ДНК.
Бактериофаг Т4 представляет собой удобную модель.для изучения рекомбинации. Т4, классический объект молекулярной биологии и генетики; является одним из наиболее изученных организмов. У этого фага имеется собственный репликационный* и рекомбинационный аппарат, который охарактеризован, биохимически. В высокой степени развита генетика. Т4. Кроме того, Т4 имеет собственные хоминг-эндонуклеазы, а значит его геном адаптирован к их действию.
Цели и задачи исследования.
Основная цель данной работы заключалась в изучении способности эндонуклеазы SegC инициировать-генетический обмен между Т-четными, бактериофагами, а также в разработке на основе эндонуклеазы SegC экспериментальной модели для* изучения механизмов репарации двунитевого разрыва у фага Т4.
В соответствии с целью работы были поставлены'следующие задачи:
Проанализировать область генов 5 - 6 у Т-четных бактериофагов с целью поиска сайта гидролиза SegC;
Получить препарат SegC и охарактеризовать его нуклеазную активность;
Локализовать предпочтительный сайт гидролиза SegC;
Изучить, способность SegC инициировать генетический обмен между Т-четными бактериофагами в области генов 5-6;
Создать на основе эндонуклеазы SegC и системы генетического анализа рекомбинации в гЯ-локусе Т4 модель для изучения рекомбинации, инициируемой ДНР;
Проанализировать в модельной системе зависимость частоты рекомбинации. от расстояния от ДНР; сравнить рекомбинацию слева и справа от ДНР:
Научная новизна работы.
В данной работе описана новая сайт-специфическая эндонуклеаза SegC,
относящаяся к GIY-YIG-семейству хоминг-эндонуклеаз. Фермент способен
гидролизовать как немодифицированную ДНК, так и природную ДНК Т-четных фагов, содержащую гликозилированные остатки гидроксиметилцитозина. Предпочтительный сайт гидролиза SegC обнаружен в области генов 5 — 6 фага T2L, в котором отсутствует ген segC. Показано, что SegC расщепляет ДНК T2L непосредственно в сайте инсерции собственного гена, что ранее считалось особенностью, присущей исключительно интрон-кодируемым эндонуклеазам. Установлено, что SegC в скрещиваниях Т4 и T2L инициирует генетический обмен между этими фагами в области генов 5 — 6, что сопровождается генной конверсией в этой области - замещением безнуклеазного аллеля T2L на jegC-содержащий аллель Т4. Полученные данные свидетельствуют в пользу гипотезы, что именно хоминг-эндонуклеазы ответственны за явление исключения* маркеров, наблюдаемое в скрещиваниях Т4 и T2L.
Создана модельная система для изучения рекомбинации, инициируемой* ДНР вгІІ-локусе фага Т4. Положение разрыва определяется эндонуклеазой SegC, сайт которой-помещен в начало гена гІІВ. Анализ рекомбинации слева и справа от точки разрыва показал равную и симметричную инициацию рекомбинации каждым концом разорванной хромосомы. Исследована зависимость частоты рекомбинации от расстояния на участке, расположенном на расстоянии 12 - 2100 п.н. от ДНР в сериях двух- и трехфакторных скрещиваний. Полученные результаты подтверждают основные предсказания SPC (splice/patch coupling) модели рекомбинации.
Научно-практическая ценность.
Полученные в данной работе результаты имеют в основном фундаментальное значение, однако некоторые из них могут найти практическое применение. Описанная в данном исследовании эндонуклеаза SegC может быть использована для создания эндонуклеаз с заданной специфичностью. Разработанная модель рекомбинации в rll-локусе может использоваться для изучения механизмов репарации ДНР.
Классические Т-четные бактериофаги
Классическими представителями семейства Т-четных фагов, кроме Т4, являются бактериофаги Т2 и Т6. Эти фаги имеют не только практически идентичную Т4 морфологию частицы, но и проявляют высокую гомологию ДНК. К настоящему времени полная последовательность генома установлена только для Т4 (GenBank GI: 11079640). Поэтому современное представление о родстве классических Т-четных фагов формируется, преимущественно из ранних исследований.
Большинство генов, идентифицированных в Т2 и Т6, гомологичны генам Т4, так же как порядок генов и расстояния между ними близки у всех трех фагов (Russel, 1974). За небольшим исключением, продукты гомологичных генов этих фагов взаимозаменяемы, и гибридные гены, образуемые при рекомбинации между фагами, являются функционально активными. Тем не менее, из ранних работ по исследованию ДНК этих- фагов очевидны некоторые принципиальные различия между ними. Так, в экспериментах по гибридизации ДНК Т-четных фагов (Cowie et al.) было показано, что 91,4% меченой ДНК фага Т2 гибридизуется с ДНК фага Т4, в то же время, только 82,1% меченой ДНК фага Т4 гибридизуется с ДНК фага Т2. Аналогично, для гибридизации Т2/Т6, Т6/Т2, Т4/Т6 и Т6/Т4 получены значения 94,7%, 87,0%, 83,2% и 84,7%, соответственно. Из этого был сделан выводы о том, что генетическое родство фагов Т2 и Т6 между собой больше, чем с Т4. Более того, кроме наличия негомологичных генов, у Т4, в сравнении с Т2 и Т6, имеются вставки последовательностей, которые отсутствуют у последних. Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными Ким и Дэвидсон при исследовании под электронным микроскопом гетеродуплексов ДНК Т2, Т4 и Т6 (Kim and Davidson, 1974). Они установили, что размер генома Т4 приблизительно на 6 и 2 т.п.н. больше, чем соответственно у Т2 и Т6. При этом наибольшая гомология между тремя фагами наблюдалась в области поздних генов, а наибольшее различие - в области генов хвостовых фибрилл (гены 37 и 38), что подтверждалось данными генетических исследований (Russel, 1974).
Явление частичного исключения маркеров у Т-четных фагов Первоначально, при изучении наследования генетических детерминант хозяйской специфичности потомством смешанных инфекций было показано, что происходит частичное исключение фагом Т4 фага Т2 (Delbriick, 1945; Streisinger and Weigle, 1956). Позже было установлено, что это явление носит более сложный характер. Наиболее детально явление частичного исключения было исследовано Расселл и Хаски (Russell and Huskey, 1974). В своей работе они проанализировали для 35-ти различных Т-четных фагов, в том числе классических Т-четных и RB-фагов, как наследуются их генетические детерминанты в смешанных инфекциях двух различных фагов. Наиболее подробно бьша изучена смешанная инфекция Т4 и Т2, где было проанализировано наследование около 70 генетических детерминант. В тех случаях, когда инфицирующие фаги различались между собой относительно слабо (например, в случае фагов Т2 и Т6), генетические маркеры обоих родителей достаточно эффективно наследовались потомством. При этом наблюдалось незначительное доминирование одного фага (Т6) над другим (Т2), и мягкое исключающее действие доминирующего фага могло быть направлено против локализованных детерминант исключаемого фагового генома. При увеличенит различий между инфицирующими фагами, как в случае Т2 и Т4, исключающее действие бьшо заметно и более очевидно направлено против локализованных детерминант. В случае і-наибольших различий между фагами, как, например, между фагами RB69 и классическими Т-четными, маркеры исключаемого фага (Т2, Т4 и Т6) практически отсутствовали в потомстве. Наиболее интересными оказались результаты скрещиваний Т4 и Т2. Маркеры фага Т2 исключаются в потомстве, но в различной степени. Большинство маркеров наследуются с частотой 10 - 30%, тогда как некоторые маркеры исключаются практически полностью и доля в потомстве составляет 1 - 3%. Стоит отметить, что потомство, наследовавшее Т2-маркеры, полностью являлось рекомбинантным. Авторы предположили, что, скорее всего, несколько генов, Т4 действует на чувствительные к исключению детерминанты в геноме Т2, расположенные преимущественно в области ранних генов. Способность к исключению Т2 не зависела ни от одного существенного для развития гена Т4. Из работ других авторов следовало, что исключение маркеров не зависело от различий в характере и степени гликозилирования ДНК этих фагов (Pees, 1970; Pees and de Groot, 1970). Они установили, что гены Т4, ответственные за исключение, картировались рядом с исключаемой детерминантой (Pees and de Groot, 1975). В дополнение к этому, Ким и Девидсон обнаружили (Kim and Davidson, 1974), что в гетеродуплексах ДНК Т4 и Т2 имеются петли, свидетельствующие о небольших вставках в Т4, по сравнению с Т2, кроме того, наблюдалась корреляция между положением петель в Т4 и локализацией в Т2 чувствительных к исключению детерминант. На основе этих данных, Рассел и Хаски предложили механизм для объяснения явления локального исключения маркеров (Russel and Huskey, 1974). Суть предположения заключалась в том, что фаг Т4 произошел от Т2-подобного предшественника за счет встраивания небольших ДНК-элементов. Эти элементы кодируют сайт-специфические нуклеазы, способные узнавать последовательности чувствительных к исключению детерминант. Само встраивание привело к нарушению чувствительного к исключению сайта в Т4. Это блестящее предположение нашло подтверждение после открытия у Т4 хоминг-эндонуклеаз. Их исследования показали, что, по-крайней мере в ряде случаев, именно они ответственны за локальное исключение маркеров Т2 при коинфекции с Т4 (см. раздел «Хоминг-эндонуклеазы фага Т4»),
Рекомбинация у бактериофага Т4. SPC-модель рекомбинации
Семейство LAGLIDADG. Первая обнаруженная и охарактеризованная интрон-кодируемая хоминг-эндонуклеаза, I-Scel (кодируется митохондриальным интроном гена 21S рРНК S. cerevisiae), относится к семейству LAGLIDADG (Colleaux at al., 1986). В настоящее время это семейство является наиболее многочисленным (включает более 200 представителей) и изученным. LAGLIDADG-эндонукелазы широко распространены и обнаружены в археях, митохондриях дрожжей, грибов и простейших, а также в хлоропластах растений и водорослей (Dalgaard et al., 1997). Эндонуклеазы этого семейства, как правило, кодируются нитронами и интеинами. Практически уникальным исключением является хоминг-эндонуклеаза НО S. cerevisiae. Она кодируется свободностоящим геном, локализованным в хромосоме, и отвечает за переключение типа спаривания у дрожжей (Kostriken et al., 1983). Стоит отметить, что мотив LAGLIDADG также обнаружен в матуразах, интрон-кодируемых ферментах, участвующих в сплайсинге интрон-содержащей РНК (Caprara and Warning, 2005). Представители семейства LAGLIDADG разделяются на две группы - те, которые имеют одну или две копии консервативного мотива. Эндонуклеазы, имеющие одну копию мотива LAGLIDADG, например I-Crel и I-Ceul (Wang et al., 1997; Turmel et al., 1997), активны в виде гомодимера и узнают палиндромную или псевдопалиндромную последовательность ДНК. Ферменты с двумя копиями этого мотива, как, например, PI-SceI (Christ et al., 1999), действуют в виде мономера, и их сайты узнавания не обладают симметрией. В настоящее время определены структуры для представителей обеих групп LAGLIDADG-эндонуклеаз: шесть ферментов были закристаллизованы в комплексе с ДНК-субстратом, а также два без него (для обзора см. Stoddard, 2005). Эндонуклеазы, активные в виде гомодимеров, как например, I-Crel (Jurica et al., 1997; Heath et al., 1998), в комплексе с ДНК формируют структуру, которая обладает симметрией 2-го порядка. Мономерные формы ферментов с 2-мя консервативными мотивами, например, I-Anil (Bolduc et al., 2003), формируют на ДНК-субстрате псевдосимметричную структуру, очень напоминающую структуру димеров. В обеих группах LAGLIDADG-эндонуклеаз, каждый консервативный мотив участвует в формировании одного активного сайта, ответственного за гидролиз одной из цепей ДНК. Интеин-кодируемые хоминг-эндонуклеазы, кроме собственно эндонуклеазного домена, содержат домен, ответственный за сплайсинг белковой молекулы. Домен, ответственный за сплайсинг, так же может участвовать в формировании комплекса с ДНК-субстратом. Так, для PI-SceI (сайт связывания полноразмерного фермента составляет 31 п.н.) показано, что нуклеазный домен сам по себе проявляет относительно слабое неспецифическое связывание с ДНК (Gimble and Wang, 1996; Wende et al, 1996; He et al., 1998). Интеин-сплайсирующий домен отвечает за первичное связывание с последовательностью на 5 -конце сайта. Это приводит к изгибанию ДНК на 65 и позволяет нуклеазному домену образовать контакты с последовательностью на 3 -конце сайта.
Семейство H-N-H. Хоминг-эндонуклеазы, содержащие мотив H-N-H, кодируются нитронами I и II группы, интеинами и свободностоящими генами. Мотив H-N-H имеет широкое распространение и обнаружен у нуклеаз других классов, включая неспецифические нуклеазы грибов и бактерий,- например колицины Е2, Е7 - Е9, транспозазы, эндонуклеазы рестрикции (например, Kpnl, МсгА - метилцитозин-специфичная эндонуклеаза рестрикции из Е. coli), бактериальные ферменты, участвующие в репарации ДНК (Snub et al., 1994; Gorbalenya, 1994; Mehta et al., 2004). Предложено разделение H-N-H семейства нуклеаз на 8 подгрупп в зависимости от последовательности самого H-N-H-кора, который охватывает участок белка длиной 30 — 33 а.о., а также наличия или отсутствия уникальных фланкирующих последовательностей (Mehta et al., 2004). Хоминг-эндонуклеазы семейства H-N-H могут вносить в ДНК-мишень, как однонитевые, так и двунитевые разрывы. Показано, что нуклеазы этого семейства активны на ДНК как в виде мономеров, так и гомодимеров. При этом, если способность вносить в ДНК-субстрат однонитевые разрывы коррелирует с мономерной формой фермента, то способность вносить двунитевые разрывы не обозначает образование эндонуклеазой димера. Так, например, хоминг-эндонуклеазы I-Cmoel и IevIII обе вносят в свои ДНК-субстраты двунитевые разрывы, при этом первая образует комплекс с ДНК в мономерной форме, тогда как вторая активна в виде гомодимера (Drouin et al., 2000; Robbins et al., 2007). Способность к димеризации была предположена для хоминг-эндонуклеазы FfllV фага Т5, которая вносит двунитевые разрывы в последовательность, являющуюся псевдопалиндромом (Акуленко и др., 2004). Тем не менее, сайт хоминг-эндонуклеазы IevIII, которая активна в виде гомодимера, не является палиндромом, и точки разрыва расположены асимметрично относительно сайта узнавания (Robbins et al., 2007). В настоящее время установлена структура интрон-кодируемой хоминг-эндонуклеазы I-Hmul бактериофага SP01 В. subtilis в комплексе с ДНК-субстратом (Shen et al., 2004). I-Hmul имеет чрезвычайно вытянутую форму с серией отдельных последовательно расположенных структурных доменов и мотивов, распределенных вдоль всей ДНК-мишени. I-Hmul изгибает ДНК на угол -40 на расстоянии 4-5 п.н. от точки расщепления ДНК. Авторы постулируют, что в структуре фермента можно вьщелить два домена: N-концевой, имеющий ДНК связывающий участок, подобный тому, что обнаружен у I-Ppol (относится к семейству His-Cys), и активный сайт (содержит H-N-H/N мотив), структура которого подобна колицинам; а также С-концевой ДНК-связывающий домен. Подобная двухдоменная организация, т.е. наличие N-концевого каталитического и С-концевого ДНК-связывающего домена, предложена для хоминг-эндонуклеазы IevIII колифага RB3 (Robbins et al., 2007). Это предположение авторы делают исходя из результатов экспериментов по ограниченному протеолизу и анализу ДНК-связывающих свойств делеционных вариантов фермента.
Получение компетентных клеток Е. coli и трансформация
Кальциевый метод получения компетентных клеток Е. coli. Единичной колонией реципиентного штамма с однодневной чашки инокулировали 5 мл 2х YT и выращивали ночную культуру на роторной качалке при 37 С в течение 12 - 14 ч. Разбавленную в 100 раз ночную культуру инкубировали в 50 мл 2х YT при 37 С до ОД590 = 0,4. Далее все процедуры проводили при 4 С. Культуру охлаждали в течение 10 мин и центрифугировали (К-23, 3000 об/мин, 15 мин). Осадок ресуспендировали в 50 мл 0,1 М СаСЬ и инкубировали при 4 С в течение 30 мин. После центрифугирования (К-23, 3000 об/мин, 15 мин) клетки ресуспендировали в 5 мл 0,1 М СаСЬ, 20% глицерина (w/w). Компетентные клетки фасовали в мини-пробирки по 200 мкл и хранили при -70 С. Частота трансформации полученных компетентных клеток находится в диапазоне 5х Ю5 - 2х 106 клонов на 1 мкг ДНК.
Рубидиевый метод получения компетентных клеток Е. coli. Ночную культуру, полученную как описано в предыдущем методе, разбавляли в 100 раз и инкубировали в 100 мл SOC-среды при 37С до ОД590 = 0,4. Далее все процедуры проводили при 4 С. Культуру охлаждали в течение 15 мин и центрифугировали (К-23, 3000 об/мин, 15 мин). Осадок ресуспендировали в 0,4 объема Tfbl (в данном случае 40 мл) и охлаждали в течение 60 - 90 мин. После центрифугирования (К-23, 3000 об/мин, 15 мин) осадок ресуспендировали в 0,04 объема Tfbll. Компетентные клетки фасовали в мини-пробирки по 50-150 мкл и хранили при -70 С. Частота трансформации полученных компетентных клеток, как правило, находится в диапазоне 7x106-2x107 клонов на 1 мкг плазмидной ДНК.
Трансформация компетентных клеток Е. coli. К размороженным во льду непосредственно перед трансформацией компетентным клеткам добавляли 3 - 5 нг ДНК, перемешивали и инкубировали во льду в течение 60 мин. Тепловой шок проводили прогреванием клеток при 42 С в течение 1,5 мин. Клетки охлаждали во льду в течение 5 мин, добавляли 800 мкл 2х YT и инкубировали при 37 С в течение 60 мин. 100 мкл смеси высевали на подсушенные чашки Петри с агаризованной LB-средой, содержащей селективный антибиотик, и инкубировали при 37 С до появления единичных колоний.
Получение плазмидной ДНК щелочным лизисом. Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса с некоторыми модификациями. 100 мл среды 2х YT инокулировали колонией Е. coli, несущей плазмиду, и инкубировали на роторной качалке при 37 С в присутствии соответствующего антибиотика. Через 16 - 20 ч клетки осаждали центрифугированием (К-23, 6000 об/мин, 4 С, 15 мин). Полученный осадок ресуспендировали в 3,5 мл буфера I. Затем клетки лизировали добавлением 8 мл раствора II при плавном перемешивании и инкубировали при 4 С в течение 10 мин. К лизату добавляли 6 мл раствора Ш, встряхивали и охлаждали во льду в течение 15 мин. Лизат центрифугировали (J2-21, 18000 об/мин, 4 С, 20 мин). К полученному супернатанту добавляли 10,5 мл изопропанола, инкубировали при комнатной температуре 5 мин и центрифугировали (J2-21, 15000 об/мин, 10 С, 5 мин). Осадок промывали 2 мл 75% этилового спирта, подсушивали и растворяли в 900 мкл НгО. Раствор переносили в мини-пробирки. Осаждение РНК и хромосомной ДНК проводили путем добавления 50 мкл 1 М СаСЬ (до 25 мМ) и последующим центрифугированием ("Эппендорф", модель "miniSpin", 12000 об/мин, 1 мин). Плазмидную ДНК осаждали этанолом из полученного супернатанта с последующим растворением в 240 мкл ТЕ и инкубированием с 5 мкл РНКазы А (10 мг/мл) в течение 30 мин при 25 С. ДНК повторно осаждали 300 мкл охлажденного раствора, содержащего 13% ПЭГ, 1,6 М NaCl, с последующим центрифугированием ("Эппендорф", модель "miniSpin", 12000 об/мин, 5 мин). Осадок промывали 1 мл 75% этилового спирта, подсушивали и растворяли в 300 мкл НгО. Белки удаляли путем последовательной экстракции равными объемами фенола, фенол/хлороформа (1 : 1) и хлороформа ("Эппендорф", модель "miniSpin", 12000 об/мин, 5 мин). Для осаждения плазмидной ДНК к отобранной водной фазе добавляли 1/10 обьема З М ацетата Na и 2,5 объема 96% этанола или равный объем изопропанола. Смесь охлаждали (-70 С, 30 мин или -20 С, ночь) и центрифугировали ("Эппендорф", модель "miniSpin", 12000 об/мин, 5 мин). Осадок дважды промывали 75% этанолом, подсушивали и растворяли в нужном объеме НгО.
Получение плазмидной ДНК центрифугированием в градиенте CsCl. Выращивание культуры проводили в 300 мл среды, как описано выше. Клетки осаждали центрифугированием (К-23, 6000 об/мин, 4 С, 15 мин). Осадок ресуспендировали в 7 мл буфера I, при плавном помешивании добавляли 16 мл раствора II и инкубировали до полного лизиса при 4 С. К полученному лизату добавляли 12 мл раствора III, выдерживали в ледяной бане 15 мин и центрифугировали (J2-21, 18000 об/мин, 4 С, 20 мин). К супернатанту добавляли 0,6 объема изопропанола, инкубировали 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали (JA-21, 15000 об/мин, 10 С, 5 мин). Осадок растворяли в 2 мл НгО, добавляли 0,6 мл этидиум бромида (10 мг/мл) и 37,4 мл раствора CsCl (0,825 г/л). Полученный раствор запаивали в пробирки и центрифугировали (Beckman L5-50 В, 45000 об/мин, 15 С, 24 ч). После формирования градиента, нижнюю полосу, содержащую ДНК, помещали в отдельную пробирку. Этидиум бромид трижды экстрагировали насыщенным раствором изопропанола (равный объем изопропанола и 5 М NaCl). Полученный раствор разводили в три раза НгО, добавляли 0,6 объема изопропанола, инкубировали 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали (К-23, 8000 об/мин, 10 С, 30 мин). Осадок промывали 2 мл 75% этанола и растворяли в 0,5 мл НгО. Белки удаляли путем последовательной экстракции равными объемами фенол/хлороформа (1:1) и хлороформа ("Эппендорф", модель "MiniSpin", 12000 об/мин, 5 мин). Плазмидную ДНК осаждали спиртом из отобранной водной фазы и растворяли в 0,5 млНгО.
Определение концентрации ДНК. Концентрацию ДНК оценивали визуально с помощью электрофореза или спектрофотометрически (концентрацию ДНК высчитывали исходя из стандартного соотношения: при ОДгво = 1, концентрация ДНК в пробе составляет 50 мкг/мл).
Сайт гидролиза эндонуклеазы SegC в фаге T2L находится непосредственно в сайте инсерции собственной ОРС
Представлены радиоавтограммы участков «секвенирующих» гелей. На дорожках, обозначенных «-» и «+», представлены продукты реакции элонгации меченного праймера до и после инкубации с SegC, соответственно. G, А, Т и С - продукты секвенирующих реакций, полученные в присутствии соответствующих терминаторов. Справа представлены фрагменты последовательностей верхней и нижней цепей, где стрелками указано положение точек разрывов ДНК. Б. Представлена последовательность ДНК в области сайта гидролиза SegC. Точки разрыва в верхней и нижней цепях указаны стрелками. В. Выравнивание нуклеотидных последовательностей Т4, фланкирующих ОРС segC, и соответствующих последовательностей T2L. Красным выделены нуклеотиды, различающиеся в последовательностях 2-х фагов. Старт- и стоп- кодоны ОРС segC подчеркнуты. Точка разрыва в последовательности T2L указана стрелкой. собственными хоминг-эндонуклеазами? Геномные ДНК фагов были гидролизованы эндонуклеазой рестрикции Smil, которая нечувствительна к природной модификации ДНК Т-четных фагов, поскольку в последовательности ее сайта узнавания не содержатся остатки цитозина (5 -АТТТАААТ-3 ). Smil-гидролизаты обрабатывали эндонуклеазой SegC и разделяли продукты реакции при помощи гель-электрофореза в инверсионных полях. Согласно анализу последовательности, у Т4 межгенная область 5-6 находится в составе Smil-фрагмента длиной 10044 п.н., тогда как у Т42 длина фрагмента, содержащего данную область, составляет 9480 п.н. Картина гидролиза Smil ДНК фагов Т4 и Т42 соответствовала предсказанному расположению сайтов в геноме (рис. 12). После инкубации с SegC, видимых изменений в картине гидролиза Т4 не наблюдалось. В случае Т42, фрагмент, содержащий межгенную область 5-6, специфически расщеплялся
Анализ активности эндонуклеазы SegC на геномных ДНК фагов Т4В, Т42 и T2L, содержащих гликозилированные остатки гидроксиметилцитозина. ДНК бактериофагов предварительно была гидролизована Smil, а затем обработана SegC. Продукты гидролиза разделены при помощи электрофореза в инверсионных полях в 1% агарозном геле. Треугольниками отмечены Smil-фрагменты, которые содержат область генов 5-6; ромбами отмечены продукты гидролиза этих фрагментов эндонуклеазой SegC. Положение ДНК-маркеров отмечено стрелками в левой части рисунка, размеры маркеров приведены в т.п.н. эндонуклеазой SegC с образованием двух продуктов, размеры которых соответствовали расчетным - 5042 и 4438 п.н. Для T2L рассчитать размер Smil-фрагмента, который содержит область генов 5 - 6, не представлялось возможным, поскольку в фрагменте T2L ДНК, последовательность которого была установлена в данной работе, сайты этой эндонуклеазы рестрикции отсутствуют. Как видно из рисунка 12, общие картины гидролиза эндонуклеазой Smil ДНК фагов T2L и Т4 значительно отличаются друг от друга. После обработки Smil-гидролизата ДНК T2L эндонуклеазой SegC наблюдалось специфическое расщепление одного из фрагментов с образованием 2-х продуктов. При этом наблюдаемая картина гидролиза SegC для Т42 и T2L была сходной. А именно, размеры соответственно исходных фрагментов и продуктов их расщепления SegC для обоих фагов были практически одинаковы, насколько позволял оценить метод. Исходя из этого, можно предположить, что наблюдаемый в случае T2L специфический гидролиз эндонуклеазой SegC соответствует расщеплению в установленном ранее сайте в области генов 5 — 6. Это предположение было подтверждено при помощи гибридизации с ДНК-зондом к области генов 5 — 6, а также в экспериментах по удлинению праймера на природной ДНК T2L, обработанной эндонуклеазой SegC (данные не приводятся).
Таким образом, можно заключить, что природные модификации ДНК T2L и Т4 не препятствуют специфическому узнаванию и гидролизу эндонуклеазой SegC ДНК в ранее установленном сайте.
Прежде чем исследовать способна ли эндонуклеаза Se gC инициировать хоминг собственного гена, было проанализировано, экспрессируется ли ген segC при развитии Т4. Для этого экстракты клеток Е. coli, инфицированные Т4 или полученным в ходе этой работы фагом T4segCA (содержит делецию в ОРС segC, приводящую к сдвигу рамки считывания, см. главу «Материалы и методы») были протестированы на наличие специфической активности эндонуклеазы SegC. В качестве маркеров длин фрагментов использовали продукты гидролиза субстрата эндонуклеазой SegC in vitro. Результаты анализа (рис. 13) свидетельствуют, что сайт-специфическая нуклеазная активность, соответствующая активности эндонуклеазы SegC in vitro, наблюдалась только в экстрактах Т4-инфицированных клеток, тогда как отсутствовала в клетках, зараженных фагом с мутацией в гене segC. Эти данные свидетельствуют о том, что ген segC экспрессируется в ходе Т4-инфекции.
Данные об экспрессии гена segC в ходе Т4-инфекции, а также о способности SegC гидролизовать модифицированную ДНК Т-четных фагов создали предпосылки для изучения характера наследования segC в скрещиваниях Т4 и T2L. В начале был проанализирован характер наследования segC при скрещиваниях Т4 х T2L и T4segCA х T2L. Долю потомства, содержащего ген segC определяли при помощи гибридизации со специфическим ДНК-зондом к этому гену. При скрещивании T2L с Т4 дикого типа (таблица 3) около 99% потомства содержало ген segC, тогда как мутация в этом гене (скрещивание T4segCA и T2L) проявлялась в снижении его доли в потомстве до 72% (данные не приведены).
Похожие диссертации на Участие хоминг-эндонуклеазы SegC бактериофага Т4 в генетической рекомбинации у Т-четных бактериофагов
