Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Основные классы ДНК-зависимых РНКП 6
2.2. Бактериальная ДНК-зависимая РНКП 9
2.3. Рентгеноструктурный анализ бактериальной РНКП 13
2.4. Модель элонгационного комплекса бактериальной РНКП 17
2.5. Каталитические активности бактериальной РНКП
2.5.1. Структура активного центра РНКП 21
2.5.2. Цикл добавления нуклеотида. Конформационные состояния активного центра РНКП 23
2.5.3. Структурные элементы активного центра, вовлеченные в транслокацию 25
2.6. Конформационная динамика активного центра РНКП в ЭК
2.6.1. ТранслокацияРНКПи ее возлюжныемеханимы 27
2.6.2. Механизм транслокации для бактериального ЭК
по модели «Броуновского храповика» 32
2.7. Механизмы загрузки субстрата в активный центр РНКП 35
2.8. Точность РНКП в процессе транскрипции 37
3. Результаты и обсуждение
3.1. Получение и характеристика элонгационных комплексов, имеющих определенное конформационное состояние 43
3.2. Механизм ингибирующего действия антибиотика стрептолидигина 59
3.3. Механизм ошибочного включения нуклеотида в транскрипт, обусловленного «выпетливанием» транскрибируемой цепи ДНК в области активного центра 66
3.4. Определение участка плавления ДНК дуплекса. в области активного центра бактериальной РНКП 78
4. Материалы и методы
4.1. Материалы и реагенты 87
4.2. Методы 96
Выводы 112
Сокращения и обозначения 113
Список литературы 115
- Рентгеноструктурный анализ бактериальной РНКП
- Цикл добавления нуклеотида. Конформационные состояния активного центра РНКП
- Механизм ингибирующего действия антибиотика стрептолидигина
- Определение участка плавления ДНК дуплекса. в области активного центра бактериальной РНКП
Введение к работе
ДНК-зависимые РНК полимеразы (РНКП), катализирующие синтез матричной РНК, являются ключевыми ферментами в экспрессии генетической информации у всех живых организмов. Среди ферментов этого класса выделяют односубъединичные РНКП бактериофагов и митохондрий и многосубъединичные РНКП хлоропластов, прокариотических и эукариотических организмов. Несмотря на отличие односубъединичных и многосубъединичных РНКП, особенно в структурной организации, они используют общий механизм катализа (нуклеофильное замещение), основанный на присутствии двух ионов Mg в активном центре фермента; достигают практически полной процессивности в элонгационной фазе, формируя РНК-ДНК гибрид одинаковой длины; имеют сходство в механизмах биохимических процессов инициации, элонгации и терминации синтеза РНК. Наиболее охарактеризованной и изученной является односубъединичная РНКП бактериофага Т7 (Т7 РНКП). В силу некоторых общих закономерностей модели транскрипционных процессов, полученные для Т7 РНКП, могут быть рассмотрены для многосубъединичных РНКП.
Многосубъединичные РНКП ответственны за синтез практически всех клеточных РНК. Аминокислотные последовательности полипептидов многосубъединичных РНКП содержат большое число консервативных областей, а данные кристаллографических исследований демонстрируют сходство пространственной организации. Особенно высокая степень гомологии наблюдается в области активных центров, что отражает аналогичность их функционирования во всех многосубъединичных РНКП. Более простое строение бактериальных РНКП (6 субъединиц) по сравнению с эукариотическими, содержащими до 17 субъединиц (в случае РНКП III), делает первые прекрасной моделью для изучения- клеточных РНКП в целом. Поскольку структура белка определяет его функцию, структурный анализ многосубъединичных РНКП, среди которых известны высокоразрешенные
кристаллические структуры кор-фермента T.aquaticus [3], холофермента T.thermophilus [34], дрожжевой РНКП II и ее элонгационных комплексов (ЭК) [41, 92, 101, 117-120], а также комплексов РНКП с различными антибиотиками и транскрипционными факторами [103, 158, 159, 164, 198, 199], вместе с данными биохимических, биофизических и генетических исследований позволяют предположить возможные механизмы функционирования.
В процессе транскрипции выделяют три этапа: 1) инициацию, характеризующуюся связыванием РНКП с промотором, абортивным синтезом и началом образования РНК-транскрипта; 2) элонгацию, в ходе которой происходит формирование стабильного элонгационного комплекса (ЭК), в состав которого входят кор-фермент РНКП, молекула транскрибируемой ДНК, образующийся РНК-транскрипт, и процессивный синтез РНК; 3) терминацию, завершающую синтез РНК-транскрипта и приводящую к диссоциации ЭК. Взаимодействия РНКП с различными сигнальными последовательностями-нуклеиновых кислот и (или) вспомогательными транскрипционными факторами контролируют транскрипцию, регулируя экспресию генов. Синтез РНК осуществляется, главным образом, на этапе элонгации в результате многократно повторяемого цикла добавления нуклеотида, (ЦЦН); представленного последовательными стадиями: связывания субстрата NTP в активном центре РНКП, катализа - включения NMP в транскрипт и транслокации фермента, которые сопровождаются конформационными изменениями ЭК. При транслокации РНКП перемещается по транскрибируемой цепи молекулы ДНК, что позволяет рассматривать поступательное движение фермента как работу молекулярного мотора, функционирование которого основано либо на броуновском и собственном тепловом движении, либо на действии движущей силы, которая, в данном случае, может быть представлена реализацией энергии расщепления высокоэнергетической связи в молекуле субстрата NTP путем преобразования конформационного состояния РНКП (ЭК). Прямых доказательств, свидетельствующих в пользу той или иной
причины транслокации, пока не получено. Кроме полимеразной активности для РНКП1 характерны способность к пирофосфоролизу - процессу, обратному образованию фосфодиэфирной связи, собственная 3'-5'-экзонуклеазная активность и, индуцируемая транскрипт-расщепляющими факторами, эндонуклеазная активность. Архитектура РНКП и наличие подвижных структурных элементов, определяющих способность фермента к конформационным изменениям, обеспечивают осуществление этих процессов. Вследствие отсутствия структурных данных для каждой из возможных конформаций ЭК, на основании имеющихся фактов функциональное значение структурных элементов можно пока только предположить, хотя роль некоторых из них была продемонстрирована с помощью биохимических экспериментов с использованием мутантных форм РНКП.
В свете современных представлений об элонгации остаются неясными детальный ход событий ЦДН, полная картина конформационных изменений, претерпеваемых ЭК, и их взаимосвязь с биохимическими процессами, природа сил, вызывающих транслокацию, а также то, каким образом корректный NTP узнаетсяРНКП и доставляется в активный центр, как обеспечивается?точность воспроизведения последовательности транскрибируемой ДНК в РНК-транскрипте, что является причиной ошибок, продуцируемых РНКП, и возможна- ли их корректировка. Многие из этих аспектов остаются неизученными или недостаточно изученными, прямые доказательства предполагаемых механизмов, как правило, отсутствуют, в связи с чем в литературе часто приводятся несколько альтернативных моделей одного и того же процесса. Таким образом, для получения исчерпывающей картины функционирования РНКП, необходимо детальное изучение каждого элементарного шага катализируемых ею реакций.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Рентгеноструктурный анализ бактериальной РНКП
Известно, что структура белка определяет его функцию, таким образом, исследование структуры РНКП дает возможность глубже взглянуть на природу транскрипционного процесса и понять основы функционирования фермента. Одним из наиболее информативных методов получения данных об организации РНКП и транскрипционных комплексов на сегодняшний день является рентгеноструктурный анализ (РСА), позволяющий определять строение кристаллов с разрешением до 2 А [35].
Высокоразрешенные структуры бактериальных РНКП были получены методом РСА для кор-фермента Thermns aquaticus ( с разрешением 3,3 А) [3] и холо-фермента Thermits thermophilus (с разрешением 2.6 А) [34]. Для РНКП E.coli, к сожалению, не существует подобной достаточно детальной структуры, однако, структура РНКП E.coli с разрешением 15 А была определена методом криоэлектронной микроскопии и «наложена» на структуру кор-фермента Thermus aquaticus, что выявило их близкое соответствие [76]. В силу высокой гомологии аминокислотных последовательностей и структурного сходства многочисленные данные биохимических экспериментов и имеющиеся результаты,кристаллографических исследований для РНКП Elcoli и структуры РНКП Т.aquaticus , и Т.thermophilus используются в совокупности для характеристики бактериальных РНКП [77]. Следует заметить,- что структура более высокого разрешения для холо-фермента РНКП T.thermophilus существенно улучшает атомную модель кор-фермента, предложенную ранее для РНКП T.aquaticus. Обобщая имеющиеся данные, организация кор-фермента бактериальной РНКП на сегодняшний день представляется следующим образом.
Размер кор-фермента бактериальной РНКП составляет 150x115x110 А [77]. Ее форма напоминает клешню краба (Рис.2), основной массив которой сформирован субъединицами: р , образующей одну из частей клешни - будем называть ее верхней, и Р - другая часть клешни, нижняя. Внутри клешни находится глубокая полость, достигающая 27 А в ширину и называемая главным каналом РНКП, поверхность которого «выстлана» позитивно заряженными аминокислотными остатками, в то время как наружная поверхность взаимодействующих Р и Р субъединиц большей частью заряжена негативно [78]. со-субъединица «обернута» вокруг С-концевой части р -субъединицы и взаимодействует с консервативными участками D и G этой субъединицы [17]. N-концевые домены (NTD) сс-димера расположены на поверхности фермента с противоположной стороны от «входа» в главный канал. С-концевые домены (CTD) а-субъединиц и линкеры в структурах РНКП неупорядочены [3, 78, 79]. Структура aCTD была получена для изолированного домена aCTD из E.coli с помощью ЯМР [82] и методом PC А с разрешением 3.1 А при сокристаллизации aCTD E.coli с белком активатором катаболизма САР и UP-элементом [81]. Эти структуры показали, что aCTD - компактно сложенный домен с одной нестандартной спиралью и четырьмя a-спиралями, образующими два мотива спираль-шпилька-спираль (HhH), характерный для представителей HhH семейства ДНК-связывающих белков (это семейство характеризуется наличием двух антипараллельных ос-спиралей, соединенных шпилькой [91]). Во время инициации транскрипции otCTD взаимодействует с UP-элементом ДНК, такими активаторами транскрипции, как САР [111], и, вероятно, с областью 4 ст-субъединицы [112]. Линкер, соединяющий aCTD и aNTD, неструктурирован [80], предположительно, его длина составляет 43 А, что соответствует 14 аминокислотам, наблюдаемым в линкере E.coli [77].
На внешней поверхности РНКП присутствуют два Zn -связывающих элемента (цинковые пальцы): ZBD (Zn I), формируемый аминокислотными остатками области А р -субъединицы, не имеет вторичной структуры и складывается в U-образную структуру, где 2 длинные петли связывают один ион Zn (предполагаемая роль ZBD в холо-ферменте - связывание РНКП с промотором) [34]; и домен Zn2+II, включающий 4 цистеиновых остатка из областей F и G Р -субъединицы, - вероятно, он участвует в сборке Р -субъединицы [3, 113]. Часть фермента, образованная aNTD, со и участками (3, Р -субъединиц вблизи активного центра, формирует неподвижную составляющую кор-фермента; четыре других модуля, выделяемых в структуре фермента: большой Р -зажим (clamp) Р -субъединицы, два подвижных домена Р-субъединицы, называемых pi (lobe) и pll (protrusion), и заслонка р-субъединицы (flap), закрывающая канал выхода РНК, относятся к мобильным элементам. Высоко консервативный среди всех многосубъединичных РНКП главный канал содержит структурные элементы, необходимые для катализа, поддержания определенной конфигурации и взаимодействия нуклеинововых кислот (нуклеиновокислотный скаффолд) в области активного центра. Активный центр располагается в основании главного канала и содержит каталитический Mg I, хелатируемый тремя консервативными остатками Asp мотива NADFDGD р -субъединицы
Цикл добавления нуклеотида. Конформационные состояния активного центра РНКП
РНКП, разделяя цепи транскрибируемой ДІЖ и синтезируя РНК, перемещается вдоль ДНК матрицы. Кинетические и энергетические характеристики поступательного движение фермента были исследованы в работах [144, 135]. Этот процесс включает гидролиз высокоэнергетических связей субстратов - NTP, энергия которых может быть использована для функционирования фермента. Химическая энергия ковалентных связей субстратов является основной формой «энергетического питания» молекул. Для передачи энергии и ее преобразования макромолекулы могут использовать: а) энергию нековалентных взаимодействий с субстратами и другими лигандами; б) свободную энергию катализируемых ими химических реакций; в) гибкость (множественность конформаций) одноцепочечных участков линейных биополимеров (белков и/или нуклеиновых кислот); г) возможность существования ограниченного числа альтернативных конформаций глобулярных (компактно свернутых) структур; д) фиксацию одной из альтернативных конформаций присоединяемым лигандом; е) диссоциацию и реассоциацию лиганда в зависимости от конформационного состояния макромолекулы или ее домена; ж) броуновское движение и тепловые движения макромолекулярных блоков как импульсы для механических перемещений. В основе движения РНКП лежат индуцируемые изменения сродства фермента и передвигаемого РНК-ДНК дуплекса друг к другу. На молекулярном уровне имеется два способа изменения взаимного сродства, т.е. энергии взаимодействия, макромолекул или их комплексов: 1) с помощью химической реакции в пределах одной макромолекулы или комплекса, которая прямо или косвенно приведет к изменению контактов с партнером; 2) присоединение лиганда, которое тоже, прямо или косвенно, индуцирует изменение поверхности контакта с партнером. В обоих случаях изменение сродства достигается за счет энергетического вклада реакции, индуцирующей это изменение - либо ковалентной химической реакции, либо нековалентной реакции взаимодействия с лигандом. В случае РНКП, химическая реакция, приводящая к замене свободного З -ОН концевой рибозы РНК на фосфодиэфирную связь и добавлению нового нуклеотида, очевидно, нарушает прежние контакты активного центра с РНК-ДНК гибридом, уменьшая их взаимное сродство. В то же время, усиливается сродство активного центра к новому 3 -концу РНК, в результате, РНКП из положения с меньшим сродством к РНК-ДНК гибриду перешагивает в положение с большим сродством к нему [143].
Преобразование химической энергии и пошаговое поступательное движение РНКП вдоль транскрибируемой матрицы позволяет рассматривать фермент как молекулярную машину (мотор) [143, 144]. Механизм, с помощью которого РНКП осуществляет и контролирует транслокацию вдоль ДНК-матрицы, недостаточно ясен, но он удовлетворяет одной из двух моделей функционирования молекулярного мотора, которые определяются движущей силой процесса. Модель «броуновского храповика» (Brownian ratchet) предполагает использование броуновского и собственного теплового движения молекул в работе мотора, направляемого энергией химических реакций. В модели «силового толчка» (Power stroke) основной составляющей в функционировании мотора является химическая энергия [145].
Имеющиеся на сегодняшний день экспериментальные данные для бактериальных ЭК свидетельствуют в пользу «броуновского храповика», где тепловые флуктуации РНКП стабилизируются связыванием с субстратным NTP, а дальнейшее образование фосфодиэфирной связи задает направление хаотичным колебаниям РНКП, что приводит к перемещению фермента по ДНК-матрице. «Броуновский храповик» стационарного типа впервые был предложен для Т7 РНКП при анализе кинетических данных [133], эта модель объяснила огромный разброс значений видимых констант связывания NTP (Кь) в ходе элонгационного процесса, зависящих от данного конкретного момента времени и от транскрибируемой нуклеотидной последовательности. С помощью мутантных РНКП E.coli с заменами в TL, используя футпринтинг и кросслинки, была построена модель «броуновского храповика» для ЭК бактериальной РНКП (описана ниже) [134].
С целью построения модели транслокации фермента был проведен математический анализ данных по «одноактному» присоединению субстрата [135]. Экспериментальная система представляла собой устройство из двух независимых оптических ловушек, лазерный луч одной из которых фокусировался на шарике, присоединенном к концу ДНК, а лазерный луч другой — на шарике, присоединенном к РНКП. Система помещалась в гелевую атмосферу с целью минимизации случайных конвекционных потоков, а специально разработанный пассивный силовой зажим, наложенный на шарик с РНКП, придавал жесткость гантелеподобной конструкции (шарик-ДНК-РНКП-шарик). По перемещению шарика с РНКП следили за поведением фермента. Анализ зависимости скорости РНКП от воздействия внешних сил при различных концентрациях NTP (до насыщенной) показал, что полученные результаты удовлетворяют модели «броуновского храповика». На основании данных эксперимента предположили, что в ходе элонгации периодически происходит структурная изомеризация РНКП из «открытой» конформации в «закрытую», где транслокация, вероятно, блокирована; обратный переход РНКП в «открытое» состояние облегчается энергией, освобождаемой при катализе, что предшествует началу нового ЦДН; подобная изомеризация может приводить к перестройкам доменов РНКП, которые, в свою очередь, изменяют расстояние между ДНК и определенными элементами в РНКП [160], участвующими, например, в разделении цепей входящего ДНК-дуплекса.
Механизм ингибирующего действия антибиотика стрептолидигина
При 2 мин инкубации ЭК 16 с СТР наблюдалось включение субстрата в транскрипт и образование 17 нуклеотидной РНК с одновременным появлением продукта гидролиза последней, динуклеотида pUpC (Рис.24, дорожка 4), количество которого увеличивалось на протяжении 40 мин инкубации (Рис.24, дорожка 4-7). 17 нуклеотидная РНК полностью гидролизовалась до 15 нуклеотидной. В ЭК 16, в свою очередь, на протяжении 40 мин. в ТБ не наблюдалось какой-либо нуклеазной активности (Рис.24, дорожка 8-11), что согласуется с результатами инкубации в ТБ иммобилизованного на стрептавидин-агарозе ЭК 16, полученного при «шагании» РНКП на скаффолде R14/TSlb/NTl, с 5 -Р32-меченным РНК-праймером (Рис.22, дорожки 7-9). Таким образом, при добавлении субстрата к ЭК 16 с РНК-ДНК гибридом 10 п.н. происходило удлинение РНК-праймера и последующее отщепление от 3 -конца образующегося транскрипта 2 нуклеотидов. Наблюдаемый гидролиз РНК в ЭК 17 при 60С являлся следствием собственной эндонуклеазной активности РНКП T.thermophilus, что, вероятно, могло бы быть одним из проявлений механизмов, обеспечивающих точность транскрипционного процесса, в частности, предотвращения образования гиперудлиненного РНК-ДНК дуплекса, вызывающего дестабилизацию в бактериальных и эукариотических ЭК [186].
Одной из поставленных задач в ходе исследования ЭК РНКП T.thermophilus являлась кристаллизация функционального ЭК с целью получения структуры методом рентгеноструктурного анализа. Для кристаллизации были выбраны пре-транслокационный ЭК 14 и посттранс локационный ЭК 15, поскольку входящий в их состав комплекс олигонуклеотидов наиболее близко соответствовал минимально необходимому для сборки стабильного, функционального ЭК и, вероятно, не принимал непосредственного участия в формировании упорядоченной структуры кристалла, определяя лишь кон формацию РНКП [99, 188]. Согласно данным экзонуклеазного расщепления (Рис.19), область скаффолда, соответствующая ДНК-дуплексу, размером 14 п.н., находится в канале входящего ДНК-дуплекса и полностью защищена РНКП от действия экзонуклеазы ЕхоШ, а 6 нуклеотидный участок
Гексагональные кристаллы пре-транслокационного ЭК 14 РНКП T.thermophilus. Б. Би-пирам и дальние кристаллы пост-транс локационного ЭК 15 РНКП T.thermophilus. одноцепочечной РНК располагается внутри канала выхода РНК [126]. Методом диффузии паров в «сидячей» капле (sitting drop vapor-diffusion technique), избегая использования буферных растворов с экстремальными рН и/или осадителей с высокой ионной силой для предотвращения диссоциации ЭК, были подобраны условия кристаллизации ЭК 14 и ЭК15. Образование больших гексагональных кристаллов пре-транслокационного ЭК 14 наблюдалось в присутствии осадителей, большая часть которых содержала PEG 4000 или PEG 8000 (Рис.25А); кристаллизации ЭК 15 в этих условиях не происходило, что являлось еще одним свидетельством различных конформационных состояний этих ЭК. Условия для кристаллизации ЭК 15 были найдены независимо. Большие пирамидоподобные кристаллы пост-транслокационного ЭК 15 формировались в присутствии таких спиртов, как изопропанол, 1,6-гександиол и 2-метил-2,4-пентандиол (Рис.25Б) и превосходили по качеству кристаллы пре-транслокационного ЭК 14. Кристаллы ЭК 15 были использованы для получения полного набора дифракции рентгеновских лучей при синхротронном излучении с разрешением 2.5 А и определения структуры ЭК бактериальной РНКП в пост-транслокационной конформации [187]. Механизм ингибирующего действия антибиотика стрептолидигина
Стрептолидигин (Stl) - антибиотик, производное 3-ацилтетрамовой кислоты, впервые выделенный из культуры клеток Streptomyces lydigus, специфически ингибирует бактериальные РНКП. Рис. 26. Участок связывания Stl в структуре холофермента РНКП T.thermophilus. Структурные элементы (3- (pSTLl loop - петля STL1; PSTL2 loop - петля STL2) и Р - (Bridge Helix - ВН; Trigger loop - TL) субъединиц показаны в виде ленточных диаграмм серого и зеленого цвета, соответственно. Молекула Stl изображена желтым цветом, полярные взаимодействия аминокислотных остатков P N792 (зеленый, показан выступающим с поверхности Bridge Helix) с остатком тетрамовой кислоты Stl (участок взаимодействия - синий) и PR548 (красный, показан выступающим с поверхности PSTLl loop) со стрептолольной группой Stl (участок взаимодействия - красный) показаны прерывистыми линиями. Нумерация аминокислотных остатков приведена для РНКП Е.СОІІ. На рисунке также отмечены активный центр (Active center) и местонахождение каталитического Mg2+(1) (Mg, красная сфера).
Исходя из данных кристаллической структуры комплекса холофермента РНКП T.thermophilus со Stl [159], антибиотик связывается с РНКП на расстоянии 20 А от активного центра фермента вдоль ВН, расположенного поперек главного канала РНКП между предполагаемым местонахождением РНК-ДНК гибрида и дуплексной ДНК (Рис.26). Во взаимодействиях со Stl участвуют аминокислотные остатки р- и Р -субъединиц РНКП, формирующие Stl-связывающий участок, образуемый двумя субдоменами (Рис.27).
Ван дер вальсовские взаимодействия показаны прерывистыми линиями, водородные связи - стрелками. Нумерация аминокислотных остатков приведена для РНКП E.coli. Для P N792 и РР567 в скобках приведена нумерация для аминокислотных остатков для РНКП T.thermophilm - D1090 и А447, соответственно.
Первый субдомен, состоящий из петель р-субъединицы, STL1 (Р ) и STL2 (Р557 576), и N-концевого участка ВН (р 769-788), связывает стрептолольную группу Stl (здесь и далее нумерация аминокислотных остатков приведена для РНКП E.colU поскольку большая часть биохимических экспериментов и мутагенез были проведены с использованием данного фермента) посредством множественных гидрофобных взаимодействий. Второй субдомен, сформированный центральной частью ВН (р 789-795) и упорядоченной областью TL, образует немногочисленные контакты с одной из трех разветвленных групп тетрамовой кислоты. Остаток сахара не участвует в связывании с РНКП, более того, он конкурирует за пространство с неупорядоченной областью TL, которая может вытеснять его, противодействуя связыванию, и принимать более стабильную конформацию. В целом, предполагается, что аффинность Stl к РНКП определяется стрептолольной группой, поскольку остаток тетрамовой кислоты не образует высокоспецифичных контактов с поверхностью фермента. Анализ аминокислотных последовательностей областей, содержащих Stl-связывающие детерминанты, в (3- и Р -субъединицах бактериальных РНКП [159], показывает, что участок связывания Stl высоко консервативен, поэтому результаты исследования структуры РНКП T.thermophilus со Stl могут быть применимы к РНКП других бактериальных видов.
В подтверждение структурной модели и для определения функционального значения структурных элементов РНКП, взаимодействующих со Stl, были сконструирован ряд мутантных форм РНКП Е.соИ. В рд565"5680 РНКП Е.соИ четыре аминокислотных остатка петли STL2, участвующих в образовании гидрофобного стрептолол-связывающего кармана, были заменены на глицин; в (3К548ЛРНКП Е.соИ аргинин, образующий водородную связь со Stl, был замещен на аланин. Как и предполагалось, оба мутантных фермента оказались устойчивыми к действию Stl (Рис.28).
Определение участка плавления ДНК дуплекса. в области активного центра бактериальной РНКП
Материалы: фильтры 0.2 мкм (Nalgene); колонки для ВЭЖХ (GE Health): SP-Sepharose CL6B, Sepharose FF, Heparin-Sepharose, Superpose 6, Superdex 200, Mono Q, Mono S; суспензия агарозных шариков с иммобилизованным стрептавидином UltraLink Immobilized Streptavidin (Pierce); градиентные ПААГ 4-12% NuPAGE MES (Invitrogen); хроматографические колонки с сефадексом G50 для удаления NTP (Quick Spin G50, Roche ); коммерческие наборы: для выделения плазмидной ДНК QIAprep Miniprep (Qiagen), для направленного мутагенеза QuikChange Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), для экстракции фрагментов ДНК из агарозы Gel Extraction Kit (Qiagen).
Химические реактивы: 96% этанол, ацетон, н-бутанол, фенол, хлороформ, изоамиловый спирт, глицерин, 71% азотная кислота, ледяная уксусная кислота, 36% соляная кислота, гидроксид калия, ацетат калия, гидроксид натрия, сульфат аммония, сульфат магния, хлорид кальция, хлорид марганца, хлорид рубидия, хлорид натрия, ацетат натрия, пирофосфат натрия, додецилсульфат натрия (ДСН), борная кислота, трисгидроксиметиламинометан (Трис), этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), мочевина, N ,N -метиленбисакриламид (Бисакриламид), персульфат аммония, N,N,N ,N -тетраметилэтилендиамин (TEMED), фенилсульфонилфторид (PMSF), полиэтиленимин (Polymin Р) (Sigma); агар (Difco); триптон, дрожжевой экстракт (Fisher); изопропил-р-О-тиогалактопиранозид (ИГГТГ) (RPI); бензамидин, апротинин, леупептин, пепстатин (Roche); нуклеозидтрифосфаты АТР, СТР, GTP, UTP (GE Health); 2 -дезоксинуклеозидтрифосфаты dATP, dCTP, dGTP, ТТР (GE Health); З -дезоксинуклеозидтрифосфаты 3 -dATP, 3 -dCTP, 3 -dGTP, 3 -UTP (Trilink Biotech); негидролизуемые аналоги ATP -AMPcPP (Sigma), GTP - GMPcPP (Jena Scientific), UTP - UMPcPP (BIOLOG Life Science Institute); фотоактивируемый аналог UTP - 4-тио UTP (Trilink Biotech); радиоактивные NTP у P "-ATP (3000 Кюри/ммоль, 10 мКюри/ мл), a P32-NTP (800 Кюри/ммоль, 10 мКюри/ мл) (Perkin Elmer).
Растворы: 10 мг/мл бромистого этидия, 14.4 М Р-меркаптоэтанол (Р-МЭ), 1 М хлорид магния (Sigma); 4х LDS Sample Buffer (Invitrogen); 40% водные растворы Акриламид-Бисакриламид (19:1) и (37.5:1) (Amresco); для приготовления нижеперечисленных растворов использовалась дистиллированной вода или вода с многократной очисткой из установки PureLab Prima (Elga, UK). їх ТЕ: 10 мМ Трис-НСІ, 1 мМ ЭДТА рН 8.0 10% водный раствор Polymin Р рН 7.0 Растворы для работы с клетками 0.8 М водный раствор ИПТГ
Раствор TFB1: 30 мМ К(СН3СОО), 100 мМ RbCl, 10 мМ СаС12, 50 мМ МпС12, 15% глицерин рН 5.8 (доводится уксусной кислотой). Раствор TFB2: 10 мМ MOPS, 75 мМ СаС12, 10 мМ RbCl, 15% глицерин рН 6.5 (доводится 1 Н раствором КОН). Растворы для выделения белков
Ингибиторы протеаз: водный раствор 50 мг/мл бензамидин, 10 мг/мл апротинина в 0.01 М HEPES рН 8.0, водный раствор 10 мг/мл леупептина, 1 мг/мл пепстатина в этаноле; 0.1 М раствор PMSF в изопропаноле. Лизирующий буфер: 40 мМ Трис-НСІ рН 7.7, 100 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ Р-МЭ, 0.1 MMPMSF Буфер А: 20 мМ Трис-НСІ рН 7.7, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ Р-МЭ, 5% глицерин Буфер В: 20 мМ Трис-НСІ рН 7.7, 1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ р-МЭ, 5% глицерин
Промывочный буфер: 40 мМ Трис рН 7.7, 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ р-МЭ, 0.1 мМ PMSF, 1 мМ бензамидин Экстракционный буфер: 40 мМ Трис рН 7.7, 800 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ р-мэ Транскрипция in vitro Транскрипционные буфера (ТБ) для РНКП T.thermophilus: 40 мМ Трис-НС1 (рН 7.9 при 25С), 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 5 мМ Р-МЭ; для РНКПE.colh 20 мМ Трис-НСІ (рН 7.9 при 25С), 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 5 мМ р-МЭ; для дрожжевой РНКП II: 20 мМ Трис-НСІ (рН 7.9 при 25С), 40 мМ КС1, 5 мМ MgCl2,l мМ р-МЭ; для Т7 РНКП: 20 мМ Трис-НСІ (рН 7.9 при 25С), 10 мМ MgCl2, 5 мМ р-МЭ. 2х Стоп-буфер: 90% формамид, 50 мМ ЭДТА, 1 мг/мл ксиленцианол, 1 мг/мл бромфенол голубой
Растворы для гель-электрофореза 10х ТАЕ: 0.4 М Трис, 10 мМ ЭДТА, 11.4 мл/л ледяная уксусная кислота 10х ТВЕ: 0.89 М Трис, 0.89 М Борная кислота, 20 мМ ЭДТА, рН 8.0 5х Буфер для электрофореза по Лэммли: 15.1 г/л Трис рН 8.3, 94 г/л глицин, 5 г/л ДСН 2х Буфер нанесения: 0.25 М Трис-НСІ рН 6.8, 4 мМ ЭДТА-Na рН 8.0, 10% глицерин, 5% Р-МЭ, 0.25 мг/мл бромфенолового синего Фиксирующий раствор: 10% этанол, 10% уксусной кислоты Окрашивающий раствор: 15% этанол, 25% уксусной кислоты, 0.3 г/л Кумасси синий R-250 20% водный раствор персульфата аммония Буфер нанесения для разделения ДНК в агарозном геле: 0.25% бромфенолового синего, 0.25% ксилолцианола, 30% глицерина в воде.
