Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. РНК-полимеразная активность ядер. 8
1.1.1. Общая характеристика 8
1.1.2. Действие ингибиторов на РБК-полимеразную активность ядер 10
1.1.3. Внутриядерная локализация РНК-полимеразных активностей 13
1.2. Разделение и очистка множественных форм ДНК-за висимых РНК-полимераз 15
1.2.1. Экстракция ферментов 15
1.2.2. Разделение форм ДНК-зависимых РНК-полимераз 17
1.2.3. Очистка ДНК-зависимых РНК-полимераз 21
1.3. Свойства ДНК-зависимых РНК-полимераз 26
1.3.1. Оптимальные условия реакции 26
1.3.2. Зависимость активности от концентрации субстратов 29
1.3.3. Действие ингибиторов на ядерные РНК-полимеразы 32
1.4. Субъединичное строение ядерных ДНК-зависимых РНК-полимераз 36
1.4.1. Большие субъединицы 37
1.4.2. Мелкие субъединицы 46
1.4.2.1. Субъединицы, общие для всех трех классов. РНК-полимераз 49
1.4.2.2. Субъединицы, общие для двух классов РНК-полимераз 51
1.4.3. Субъединицы промежуточного размера 52
2. Материалы и методы 56
2.1. Объект исследования 56
2.2. Культивирование 56
2.3. Выделение субклеточных структур 57
2.3.1. Выделение ядер в изотонической среде 57
2.3.2. Выделение ядер в гипертонической среде 58
2.3.3. Выделение ядрышек 58
2.4. Выделение и очистка ферментов 59
2.4.1. Экстракция ферментов из ядер 59
2.4.2. Разделение форм РНК-полимеразы 59
2.4.3. Аффинная хроматография РНК-полимераз 60
2.4.3.1. Синтез аффинных сорбентов 60
2.4.3.2. Очистка РНК-полимераз на аффинных сорбентах 61
2.4.4. Гель-фильтрация РНК-полимераз 61
2.5. Методы получения ДНК 62
2.5.1. Выделение ядерной ДНК 62
2.5.2. Получение различных форм ДНК плазмиды рСО 52 63
2.5.3. Электрофорез ДНК 63
2.6. Определение активностей ферментов 64
2.6.1. Определение активности ДНК-зависимых РНК-полимераз 64
2.6.2. Определение РНК-полимеразной активности субклеточных структур 64
2.6.3. Определение нуклеазных активностей 65
2.7. Определение молекулярной массы белков 66
2.7.1. Электрофорез в полиакриламидном геле в неде-натурирующих условиях 66
2.7.2. Гель-фильтрация на колонках с сефакрилом S -300 68
2.7.3. Электрофорез в полиакриламидном геле в дена турирующих условиях 68
2.8. Определение содержания белка и ДНК 69
3. Результаты и их обсудцение 70
3.1. РНК-полимеразная активность ядер 70
3.2. Внутриядерная локализация РНК-полимеразных активностей 75
3.3. Выделение ДНК-зависимых РНК-полимераз 79
3.3.1. Разделение форм ДНК-зависимой РНК-полимеразы 81
3.3.2. Аффинная хроматография РНК-полимераз 86
3.3.3. Очистка РНК-полшлераз при помощи гель-фильтрации 87
3.3.4. Очистка РНК-полимераз с использованием сефакрила S-300 91
3.4. Свойства ДНК-зависимых РНК-полимераз 95
3.4.1. Влияние матрицы на активность РНК-полимераз 102
3.4.2. Зависимость активности от субстратов 105
3.5. Структура ДНК-зависимых РНК-полимераз Crithidia oncopelti 109
3.5.1. Размеры молекул ферментов 109
3.5.2. Субъединичная структура РНК-полимераз 114
Заклшение 123
- Разделение и очистка множественных форм ДНК-за висимых РНК-полимераз
- Субъединичное строение ядерных ДНК-зависимых РНК-полимераз
- Выделение и очистка ферментов
- Свойства ДНК-зависимых РНК-полимераз
Введение к работе
Первым этапом реализации генетической информации в живых организмах является транскрипция, то есть синтез на матрице ДНК комплементарных ей молекул РНК. В результате этого процесса образуются все типы клеточных РНК. Транскрипция осуществляется ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой (нуклеозидтрифосфат:рНК - нуклеотидилтрансфераза, КФ 2.7.7.6), которая, продвигаясь вдоль ДНК-матрицы, катализирует последовательное присоединение комплиментарных рибонуклеозидтрифосфатов, сопровождаемое отщеплением пирофосфата. Процесс транскрипции отличается высокой специфичностью: синтез РНК начинается в строго определенной точке ДНК, копия снимается лишь с одной нити матрицы и имеет определенную длину, характерную для транскрибируемого гена. Таким образом ДНК-зависимые РНК-полимеразы должны осуществлять целый ряд функций: узнавание участков начала синтеза РНК (промоторов); образование первой мекнуклеотидной связи (инициация); элонгация, то есть присоединение нуклеотидов к синтезируемой РНК, и терми-нация, состоящая в прекращении синтеза РНК на определенном участке матрицы, освобождении РНК-продукта и отделении фермента от ДНК. Слонности функции фермента соответствует слошость его структуры.
У прокариот синтез всех типов РНК осуществляется одним ферментом. Он представляет собой крупный белок (молекулярная масса 400000-500000), состоящий из двух больших (165000 и 155000) и двух идентичных малых (39000-44000) субъединиц и фактора инициации (50000-100000). Такой тип структуры обнаружен у эубактерий, сине-зеленых водорослей и актиномицетов (38). В клетках архебак-терий также присутствует один тип фермента, однако в его состав входят 9-І! субъединиц (208).
В случае эукариот ситуация значительно сложнее. Во-первых, РНК-полимеразная активность обнаружена не только в ядре, но и в ДНК-содержащих органеллах - митохондриях и хлоропластах. Кроме того, в ядрах эукариотических клеток содержится в 100-1000 раз больше ДНК, чем в клетках прокариот. Некоторые гени у эукариот повторены несколько сотен или тысяч раз, тогда как другие представлены единичными копиями. При этом ДНК находится в комплексе с гистонами и негистоновыми белками. Гены, кодирующие рРНК объединены в внутриядерную органеллу - ядрышко. По-видимому, более сложной организацией генетического аппарата объясняется большая сложность аппарата транскрипции у эукариот. Во всех изученных эукариотических клетках обнаружено, три класса ДНК-зависимых РНК-полимераз, различающихся по локализации, структуре и функциям.
Среди одноклеточных эукариот встречаются виды, имеющие примитивную организацию ядерного аппарата. Среди простейших, особенно в классах саркодовых и жгутиковых, имеются организмы, у которых отсутствует мейоз и половой процесс, деление ядра происходит при помощи промитоза, без конденсации хромосом и растворения ядерной оболочки. По современным представлениям эти организмы являются наиболее древними, сохранившими черты сходства с предками эукариот. Поэтому представляет интерес изучение ДНК-зависимых РНК-полимераз этих организмов и их сравнение с ферментами высших эукариот и прокариот.
Цель работы состояла в обнаружении в ядрах жгутикового простейшего С. опсореІ-Ьімножественннх форм ДНК-зависимых РНК-полимераз, выделении и очистке этих форм, определении их внутриядерной локализации, молекулярной массы и субъединичного строения в в изучении каталитических свойств полученных ферментов.
Научная новизна. Впервые показано присутствие в ядрах жгутиковых трех форм ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Разработаны ме-тоды выделения двух форм в гомогенном состоянии. Определена их молекулярная масса, которая равна для РНК-полимеразы I 600000 дальтон, а для РНК-полимеразы П 750000 дальтон. Таким образом, РНК-полимераза П из c.oncopelti является самой крупной из изученных к настоящему времени РНК-полимераз. Обе формы состоят из 10 полипептидов, однако в отличие от других эукариотов, не было обнаружено полипептидов, общих для обеих форм. Установлено, что РНК-полимераза I локализована в ядрышке, а РНК-полимераза П в нуклеоплазме. Определены оптимальные условия проявления активности этих ферментов, а также К для УТФ и эквимолярной смеси нуклеозидтрифосфатов. Обнаружено, что РНК-полимераза П в отличие от РНК-полимеразы I обладает способностью к реитеративному синтезу поли(А). Показано, что РНК-полимераза I проявляет максимальную активность при использовании в качестве матрицы сверх-спирализованной ДНК, а РНК-полимераза П наиболее эффективно использует денатурированную ДНК.
Практическая ценность работы. Полученные в работе данные расширяют наши знания о структуре и механизме функционирования транскрипционного аппарата эукариотов. Выделение очищенных РНК-полимераз позволит изучать транскрипцию индивидуальных генов трипанозоматид. Многие представители семейства трипанозоматид являются возбудителями опасных заболевании человека и сельскохозяйственных животных, таких как сонная болезнь и болезнь Чага-са, которыми поражено более 40 млн.человек. Разработанные системы изучения транскрипции могут быть использованы для изучения механизмов действия противотрипанозомных препаратов и поиска новых лекарств против трипанозомозов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Разделение и очистка множественных форм ДНК-за висимых РНК-полимераз
Ранние попытки выделения эукариотических РНК-полимераз заканчивались неудачей, так как выход растворимого фермента был крайне низок, и полученный препарат быстро инактивировался при дальнейшей очистке (2,5,102). Трудность экстракции РНК-полимераз объясняется тем, что значительная часть фермента связана с хроматином в прочный транскрипционный комплекс, нерастворимый в буферах с низкой ионной силой.В настоящее время для экстракции используются три группы методов. Первую группу составляют методы, основанные на более или менее длительной инкубации гомогенатов или очищенных ядер в средах с невысокой ионной силой. Инкубация проводится при температуре 4 или 37. По-видимому, при этом происходит диссоциация транскрипционного комплекса, так как заметный выход наблюдается при инкубации более часа (42,102). Показано, что выход увеличивается в тех условиях, когда идет транскрипция, то есть в присутствии нуклеозидтрифосфатов при 37. Очевидно, при этом освобождаются молекулы фермента, завершающие синтез цепи РНК (20). Возможно, однако, что при низких температурах экстрагируется лишь фермент, не связанный с матрицей (207). Следует отметить, что из разрушенных клеток дрожжей этим методом извлекается лишь одна форма фермента (55). В случае животных тканей экстракция при низкой ионной силе дает хороший выход ядрышковой РНК-полимеразы (47). Аналогичные результаты были получены и для растений (77), правда, при этом фермент экстрагировали из хроматина, содержащего в основном ядрышковый фермент. Из листьев кукурузы при помощи гомогенизации в буфере с низкой ионной силой были солюбилизированы две формы фермента (141). Высокий выход нуклеоплазменных РБК-полимераз достигается только при использовании буферов, содержащих 0,3-0,5 М сульфата аммония (198). Экстракция РНК-полимераз из ядер дрогшей заметно увеличивается при добавлении небольших концентраций неионных детергентов (168). Вторая группа методов состоит в обработке гомогеиата ткани ультразвуком при низких ионных силах раствора. Такая обработка целесообразна при выделении ферментов, инактивирующихся при высоких концентрациях солей (103). Однако широкого распространения методы этой группы не получили из-за низкого выхода активности. Третья группа методов объединяет различные варианты ультразвуковой обработки, ядер, ядрышек или гомогенатов ткани в растворах с высокой ионной силой (154,155,117). Обычно используются 0,3-0,5 М растворы КСІ или, чаще, 0,2-0,4 М растворы сульфата аммония. Обработка проводится 3-Ю раз 10-20 секундными периодами во избежание локального перегрева раствора.
Эти методы используются наиболее широко, так как позволяют проэк-страгировать более 90% РНК-полимеразной активности без значительных потерь. Таким образом были получены ферменты из млекопитающих (116,117,154,155,195), аглфибий (152), рыб (3), насекомых (61,145,180), иглокожих (21), высших растений (65,96,106, 163), дрожжей (17,150), плесневых грибов (182,187), миксомице-тов (37,95,204), простейших (51,90,157). Несмотря на некоторую инактивацию ферментов при обработке ультразвуком, выход актив- ности из ядер печени крысы вдвое выше, чем при простой экстракции (22). Впервые РНК-полимеразы из ядер печени были разделены при помощи ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе (154,155). Ферменты элюировались линейным градиентом сульфата аммония в виде трех пиков, обозначенных авторами как РНК-полимеразы 1,П, и Ш. Фермент из тимуса теленка был разделен на ДЭАЭ-целлюлозе на две формы, названные РНК-полимеразы А и В (117). Аналогичные результаты получены и для дрожжей (34,56). В дальнейшем было показано, что РНК-полимераза, элюируемая в третьем пике с ДЭАЭ-сефадекса, элшруется вместе с РНК-полимеразой I при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе (26,169). Следует отметить, что концентрации солей, при которых происходит элюция, мало меняются от организма к организму. С ДЭАЭ-сефадекса РНК-полимераза I элюируется при 0,07-0,12 М, РНК-полимераза П при 0,15-0,25 и РНК-полимераза Ш при 0,3-0,4 М сульфата аммония. При этом ферменты из высших эукариот, как правило, связываются с анионообм менниками прочнее, чем из низших (54,71,145,149). РНК-полимеразы из низших эукариотов не всегда могут быть разделены при помощи ДЭАЭ-сефадекса или ДЭАЭ-целлюлозы, в таких случаях для разделения форм может быть использована фосфоцеллю-лоза. Хроматография на фосфоцеллюлозе оказалась наиболее надежным способом разделения форм РНК-полимераз из миксомицетов Phy-sarum polycephalum (37,72) И Dyctiostellium discoideum (149,204) И ИЗ простейшего класса саркодовых Acanthamoeba casteiiani (178,179). Порядок элюции с фосфоцеллюлозы другой: сначала элюируется РНК-полимераза П, затем РНК-полимераза Ш и наконец РНК-полимераза I. При использовании фосфоцеллюлозы РНК-полимеразы элюируются при концентрациях солей, значительно варьирующих ОТ вида К ВИДУ. Так В случае Acanthamoeba castellani РНК-полимераза П элюировалась при 100 мМ (NH4)2SO4 , РНК-полимераза Ш при 150 мМ (NH4)2S04, и РНК-полимераза I при 200 мМ (NH )2SO (54).Ферменты из высших растений и позвоночных элюируются при 0,08-0,15 М, 0,15-0,20 и 0,23-0,30 М (NH SO (80,96,107,162).
Необходимо остановиться на номенклатуре форм ДНК-зависимых РНК-полимераз. Было предложено две системы обозначения форм фермента, Рёдер и Раттер (154) обозначили формы римскими цифрами в порядке их элюции с ДЭАЭ-целлюлозы.
Однако эта система встретила ряд трудностей, связанных прежде всего с появлением в некоторых тканях дополнительных РНК-полимеразных активностей, элюируе-мых между РНК-полимеразами П и Ш или не сорбирующимися на ионо-обменник. Кроме того, в ряде случаев было обнаружено, что фермент, элюируемый 0,10-0,15 М (KH )2SO4, обладает свойствами, характерными для РНК-полшеразы П, а фермент, элюируемый при 0,2-0,25 М - свойствами РНК-полимеразы I (37,72,137). Следует отметить, что положение данного фермента при хроматографии может меняться за счет взаимодействия с другими белками и нуклеиновыми кислотами, поэтому классификацию, основанную только на хроматографических свойствах нельзя считать удовлетворительной. Другая номенклатура, предложенная Кедингером с соавторами (117), основана на различной чувствительности ферментов к Я-аманиту. РНК-полимераза, устойчивая к действию высоких концентраций этого токсина, обозначена как РНК-полимераза А. Фермент, ингибируе-ил низкими концентраціями « -аманитина, І0Г -ІСГ М, назван РНК-полимеразой В. Наконец, РНК-полимеразой С названа форма, ингибируемая высокими концентрациями токсина, 10 -ІСҐ М. Эта классификация более совершенна, однако также не является универсальной. РНК-полимераза В из ряда грибов отличается пониженной чувствительностью к с -аманитину (43,86,182). РНК-полимераза А из пекарских дрожжей наоборот, чувствительна к этому ингибитору (194). Таким образом, удовлетворительной классификации РНК-полимераз, основанной на одном признаке, предложено не было, В настоящее время для корректного отнесения фермента к тому или иному классу используется комплекс признаков. Классы обозначают, как правило, римскими цифрами. К первому классу относятся ядрышковые РНК-полимеразы, элюируемые с анионообменников при низких концентрациях солей, не ингибируемые о -аманитином и синтезирующие in vivo рибосомные РНК. РНК-полимеразы П - нукле-оплазменные ферменты, чувствительные к низким концентрациям -аманитина, элюирующиеся с ДЭАЕ-сефадекса или ДЭАЕ-целлюлозы при 0,15-0,30 М (M )2so и синтезирующие предшественники мРНК. РНК-полимеразы Ш также локализованы в нуклеоплазме, но отличаются тем, что ингибируются лишь при высоких концентрациях о(-аманитина, элюируются с ДЭАЭ-сефадекса 0,3-0,4 М (NH4)2SO4 и синтезируют предшественники низкомолекулярных РНК. Поскольку определение внутриядерной локализации и синтезируемых продуктов представляет значительные трудности, часто ограничиваются использованием хроматографических свойств и ингибирования оС-аманитином, что дает в большинстве случаев однозначный результат. В ряде случаев при помощи ионообменной хроматографии или электрофореза удается разделить каждый из классов на 2-3 подкласса.
Субъединичное строение ядерных ДНК-зависимых РНК-полимераз
Как и в случае прокариот, РНК-полимеразы из эукариот представляют собой крупные белки, имеющие молекулярную массу 500000--700000, и состоят из нескольких субъединиц. Существует общий план строения ДНК-зависимых РНК-полимераз. Ферменты из бактерий и из ядер эукариот состоят из двух очень больших субъединиц, ассоциированных с набором более мелких полипептидов (1,39). Однако в отличие от бактериальной РЬК-полимеразы, состоящей из 4-5 субъединиц, эукариотические ядерные РНК-полимеразы являются, пожалуй, наиболее сложными мультисубъединичными ферментами. В состав каящой полимеразы входит 10-15 различных полипептидных цепей. Эти субъединицы удобно разделить на две группы: большие субъединицы с молекулярной массой более 100000, и мелкие субъединицы с молекулярной массой менее 50000. Только РНК-полимеразы Ш включают в себя полипептиды промежуточного размера. Данные о субъединичном составе ядерных эукариотических РНК-полимераз приведены в таблице I. I.4.I. Большие субъединицы Наиболее характерной особенностью ДНК-зависимых РНК-полимераз является наличие двух высокомолекулярных субъединиц. Их молекулярная массавварьирует примерно от 120000 до 240000 в зависимости от источника фермента. Кавдая состоит из одной полипептидной цепи и, следовательно, эти субъединицы представляют собой одни из самых больших молекул, существующих в клетке. Каждая РНК-полимераза содержит две различные большие субъединицы. Так, в состав РНК-полимеразы I входят субъединицы размером 170000-200000 и I25000-I40000. РНК-полимераза П включает в себя субъединицы с молекулярной массой 170000-240000 и I40000-I60000. Большие субъединицы РНК-полимеразы Ш представлены полипептидами размером I50000-I70000 и 120000-140000. Сравнение пептидных карт показало, что кавдый член пары больших субъединиц данной полимеразы является уникальным и не родственным другому члену пары(81,119). Кроме того, большие субъединицы РНК-полимераз П из разных организмов, имеющие одинаковый или близкий размер, также заметно различаются по пептидным картам, что указывает на существенную дивергенцию их первичных структур (118,119). Иммунологическими исследованиями было установлено, что большие субъединицы РНК-полимераз одного класса неродственны большим субъединицам ферментов любого другого класса (33,100). Эти результаты позволяют заключить, что классы ферментов, по крайней мере отчасти, являются продуктами различных генов, и что три класса ферментов различаются не только по своим свойствам, но и по структуре.
Ингибирование РНК-полимераз аматоксинами обусловлено их взаимодействием с одной из больших субъединиц. Так, в результате ковалентного связывания РНК-полимеразы П и аманина (аматоксина, содержащего карбоксильную группу) при помощи карбодиимида токсин связывался с субъединицей размером 140000 (29). По-видимому, ингибирование РНК-полимераз I и Ш происходит по тому же механизму. Часто в пределах одного и того же организма каждый класс РНК-пожмераз может быть представлен двумя иж более подклассами, которые могут быть разделены при помощи электрофореза иж ионообменной хроматографии. Наличие этих подклассов обусловлено гетерогенностью некоторых субъединиц фермента по заряду иж размерам. Например, очень часто обнаруживается две иж три формы РНК-полимеразы П в очищенных препаратах. При наличии одной формы фермента обе большие субъединицы присутствуют в кожчестве одного по -жпептида на молекулу белка.В препаратах, которые содержат нес-сколько форм РНК-пожмеразы П обычно обнаруживается три иб более субъединиц большого молекулярного веса с неинтегральной стехиометрией. В сумме содержание этих субъединиц равно 2. Имеются доказательства, подтверждающие предположение о том, что эти подклассы РНК-полимеразы П образуются в результате протеолитической модификации самой большой субъединицы фермента (59,81). Во-первых, клеточные экстракты обладают протеолитической активностью, которая способна превращать один подкласс РНК-полимеразы П в другой путем частичного расщепления самой большой субъединицы. Во-вторых, введение на всех этапах выделения РНК-полимеразы ингибиторов протеолиза приводит к повышению содержания подкласса с наибольшим размером большой субъединицы. В-третьих, полипептиды с молекулярной массой 180000-220000 имеют похожие пептидные карты (119). Однако, несмотря на применения ингибиторов протеолиза, в препаратах РНК-полимеразы П, как правило, содержится некоторое количество фермента с меньшим молекулярным весом. Кроме того, опыты по выделению РНК-полимеразы П из смеси тканей, не содержащих протеиназ и отличающихся активным протеолизом, указывают на то, что наличие нескольких подклассов РНК-полимеразы П не обязательно является артефактом выделения. До сих пор, однако, не ясно, имеет ли такая модификация какое-либо физиологическое значение. Так как заметных различий в ферментативных свойствах подклассов РНК-полимеразы П не обнаружено, можно предположить, что все они функционируют in vivo; но в настоящее время нет данных, позволяющих судить о том, транскрибируют ли эти подклассы одни и те же участки генома, или разные. 1.4.2. Мелкие субъединицы Мелкие субъединицы РНК-полимераз эукариот представляют собой гораздо более сложную группу, чем крупные.
Каждая РНК-поли-мераза может содержать до 12 полипептидов с молекулярной массой ниже 50000. Среди них встречаются как кислые, так и основные по- липептиды с изоэлектрической точкой от 4,4 до 9,15 (33,49). Общие правила субъединичной организации РНК-полимераз выявляются крайне медленно, так как набор мелких полипептидов, входящих в состав фермента, крайне трудно определить. При молекулярной массе нативного фермента 500000-700000 субъединица размером 20000 составляет лишь 3-4$. Наличие и молярные отношения таких субъединиц очень трудно оценить в любых, даже самых чистых препаратах ферментов. Вследствие этого набор мелких субъединиц не был точно определен для РНК-полимераз из многих источников. Немногочисленность данных по субъединичному строению, в особенности у низших эукариот, не позволяет сделать какие-либо обоснованные выводы об эволюции РНК-полимераз. Сравнение субъединичной структуры всех трех РНК-полимераз, выделенных из одного источника, оказалось более информативным, чем сравнение ферментов одного класса из разных видов. Однако оно сдерживается крайне низким содержанием РНК-полимеразы Ш, характерным для большинства эукариотичес-ких клеток. Поэтому достаточно полный анализ проведен лишь для нескольких видов (32,33,49,80). Однако, несмотря на это, уже можно заметить некоторые закономерности. Мелкие субъединицы делятся на три группы. Первая включает полипептиды, входящие в состав только одного класса РНК-полимераз. Во вторую входят субъединицы, общие для всех трех классов фермента. Субъединицы третьей группы являются общими лишь для двух классов РНК-полимераз. Обнаружение в препаратах РНК-полимераз большого количества полипептидов, особенно мелких, ставит вопрос о том, действительно ли все они являются субъединицами фермента, или представляют собой примеси или продукты деградации. Наиболее обосновано такое опасение в отношении мелких субъединиц первой группы. Ведь при- сутствие 2% примесного белка с молекулярной массой около 15000 приведет к обнаружению дополнительной субъединицы. Предположение, что обнаруживаемые полипептиды действительно являются функциональными субъединицами РНК-полимеразы, основывается на следующих фактах. Во-первых, они соочищаются совместно с РНК-полиме-разой в результате нескольких различных процедур, включая аффинную хроматографию. При этом они обнаруживаются только во фракциях, содержащих РНК-полимеразную активность (50,89,178 и др.). Во-вторых, молекулярная масса нативной РНК-полимеразы соответствует сумме молекулярных масс всех ассоциированных с ней полипептидов (56,59,74 и др.).
Выделение и очистка ферментов
Экстракцию ДНК-зависимых РНК-полимераз проводили по модифицированному методу Рёдера и Раттера (154,155). К суспензии ядер в среде хранения добавляли равный объем 0,8 М раствора (NH4)2SO4 рН 7,9. Лизат обрабатывали ультразвуком на максимальной мощности при частоте 22 кГц 4 раза по 30 сек. Гомогенат центрифугировали I час при 250000 g. Фермент осаждали из супернатанта сульфатом аммония и растворяли в среде В (50 мМ трис-НСІ рН 8,0; IOfo глицерина; I мМ дитиотреитола; 0,1 мМ ФМСМ; ОД мМ ЭДТА). 2.4.2. Разделение форм РНК-полимеразы Для разделения форм РНК-полимеразы экстракт после осавдения (KH)2so обессоливали на колонке с акрилексом Р-2, уравновешенной буфером В. Раствор белка наносили затем на колонку 3,0 х 30 см с ДЭАЭ-целлюлозой DE-32 (Whatman ), промывали 500 мл буфера В, содержащего 0,03 М (im so , и элюировали градиентом концентрации (NH4.)2S04 ОТ Q,30 ДО 0,5 М в буфере.В. Объем градиента 500 мл. Собирали фракции по 7,5 мл, в которых определяли содержание белка, РНК-полимеразную активность и концентрацию (ITH4)2SO . Фракции из пиков по активности объединяли и использовали для дальнейшей очистки. 2.4.3. Аффинная хроматография РНК-полимераз 2.4.3.1. Синтез аффинных сорбентов Для синтеза сорбентов использовалась ядерная ДНК с. опсо-pelti. Синтез ДНК-целлюлозы осуществляли по методу Альбертса (18). ДНК растворяли в 10 мМ трис-HCI буфере рН 8,0, содержащем 50 MMNaCi и I мМ ЭДТА. Концентрацию ДНК : доводили до 1,5 мг/мл. Порошок целлюлозы набухал в воде в течение 15 час., затем его промывали 0,1 н раствором NaOH , Ю мл/г, 15 мин, отмывали до рН 8 и перемешивали 1-2 часа с 0,5 н НС1,50 мл на I г сухой целлюлозы, отмывали до рН 5 водой и промывали 0,05 М трис-НСІ буфером рН 8,0. Промытую целлюлозу смешивали с раствором ДНК (I г на 3 мл раствора). Суспензию высушивали на воздухе 20-30 часов, затем лиофилизировали. Полученный таким образом носитель растирали, помещали в колонку и промывали 0,1 М трис-НСІ буфером рН 8,0, содержащем I мМ ЭДТА и ОД М NaCl до тех пор, пока поглощение промывных вод Eggg не становилось равным 0. С целлюлозой связывалось около ЫУ/о ДНК. Содержание ДНК в сорбенте составляло 0,8-1,0 мг/мл. Для получения ДНК-целлюлозы, содержащей денатурированную ДНК, раствор ДНК перед смешиванием с носителем нагревали на кипящей водяной бане 20 мин., после чего смешивали с целлюлозой помещенной в лед. Дальнейшую обработку проводили так же, как и для нативной ДНК. ДНК-агарозу, содержащую денатурированную ДНК, получали по методу Шеллера с соавт. (165). I г сухой ДНК растворяли в 60 мл 0,02 M NaOH , нагревали до 55 и смешивали с 60 мл разбавленной 8% агарозы.
После тщательного перемепшвания охлавдали в холодной воде и протирали образовавшийся гель через сито с отверстиями I мм. Носитель помещали в колонку и промывали также, как и ДНК-целлюлозу. С агарозой связывалось 65-7С$ ДНК. Содержание ДНК в сорбенте составляло 3,5-5,0 мг/мл. 2.4.3.2. Очистка РНК-полимераз на аффинных сорбентах Образцы, полученные на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой, разводили буфером В до концентрации (NH so . 0,05 М и наносили на колонку 1,1 х 10 см, содержащую один из аффинных сорбентов. Скорость нанесения равнялась 5-Ю мл/час. Колонку промывали 20 мл буфера В, содержащего 0,05 Ш (NH )2SO . Элюцию проводили линейным градиентом концентрации (NH4)2SO4 ОТ 0,05 до 0,6 М. Объем градиента 30 мл, скорость элюции 7,2 мл/час. Собирали фракций по 0,6 мл, в которых определяли РНК-полимеразную активность, Ar gQ, и концентрацию (ин г30 Фракции, содержащие РЯК-полимеразу, объединяли, белок осаждали (кн4)2зо (7С насыщения) и растворяли в 0,2 мл буфера В. При выборе аффинного сорбента и при очистке небольших количеств фермента использовались колонки 0,8x2,0 см. Скорость протекания таких колонок 2 мл/час. Элюцию проводили ступенчатым градиентом (KH )2SO , содержащим по 2 мл растворов, с концентрацией соли 0,1, 0,2, 0,3, 0,5 и 1,0 М. Объем фракций по 0,5 мл. 2.4.4. Гель-фильтрация РНК-полимераз Для отделения РНК-полимеразы от белков с небольшой молекулярной массой препарат после аффинной хроматографии наносили на колонку с биогелем Р-300 размером 0,8x40 см. Колонку предварительно уравновешивали буфером В, содержащим 0,4 М (NH )2SO . Скорость элюции 2 мл/час, объем фракций 0,5 мл. Фракции, содержащие РНК-полимеразнуго активность, собирали, белок осаждали двумя объемами насыщенного раствора (NH )2SO , растворяли в 100 мкл буфера В и обессоливали на акрилексе Р-2, уравновешенном буфером В. Концентрацию глицерина доводили до 5С$ и хранили препараты при -20С. Для гель-фильтрации на сефакриле S-300 использовались колонки размером 2,6x100 см, уравновешенные буфером В, содержащим 0,25 MCNH so На колонку наносили 10-15 мл экстракта, содержащего 30-40 мг белка в мл. Собирали фракции по 10 мл при скорости протекания 40 мл в час. Фракции, содержащие РНК-полимеразу, объединяли, разводили в 8 раз и использовали для разделения форм на ДЭАЭ-пеллюлозе. 2.5.
Методы получения ДНК 2.5.1. Выделение ядерной ДНК с. oncopelti Ядерную ДНК из клеток с. oncopelti выделяли по модифицированному методу Мармура (133). 100 г сырой биомассы суспендировали в 200 мл 150 мМ NaCl , 15 мМ цитрата Na, рН 7,0 ( SSC) и добавляли додецилсульфат Na до 2%. Инкубировали 10-20 мин. при 50С, охлаждали и добавляли 75 мл 5 М раствора NaCl. Добавляли равный объем смеси хлороформ - изоамиловый спирт (24:1) и встряхивали в течение 20 мин. После центрифугирования 30 мин при 1000 g собирали водный слой и повторяли депротеинизацию 2-3 раза. Полученный раствор центрифугировали 60 мин. при 50000 g для удаления ассоциата кинетопластной ДНК. Затем ДНК осаждали, добавляя 2 объема этанола. Осадок растворяли в 100 мл ssc, добавляли РНКазу, предварительно прогретую при 85 15 мин (50 j ) инкубировали 2 часа при 37. Затем добавляли проназу (20 мкг на мл) и инкубировали 2 часа при 50. После этого проводили депротеинизацию фенолом и две депротеинизации хлороформом. ДНК осаждали этанолом и хранили под 7($ этанолом. 2.5.2. Получение различных форм ДНК плазмиды рСО 52 Суперспирализованная ДНК плазмиды рСО 52, выделенная по методу Бёрнбойма (27), была получена от Д.А.Маслова. Для получения линейной формы 20 мкг ДНК растворяли в 200 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-НСІ рН 7,6; 10 мМ MgCl2, І мМ ЭДТА, добавляли 50 ед. рестриктазы Sal G1 и инкубировали 2 часа при 37С. Затем проводили депротеинизацию фенолом, смесью хлороформ-изоами-ловый спирт и осаждали ДНК добавлением 400 мкл этанола. Денатурированную ДНК получали, прогревая линейную форму 20 мин при Ю0С и затем охлаждая во льду. 2.5.3. Электрофорез ДНК Для определения размеров и формы молекул ДНК, а также при определении ДНКазной активности препаратов РНК-полимераз использовался электрофорез ДНК в 0,8% агарозном геле. В качестве электродного буфера использовали раствор, содержащий 40 мМ трис, 20 мМ CH coONa , 2 мМ ЭДТА, СНдСООН до рН 7,7. Гель, приготовленный на электродном буфере, заливали в вертикальный блок размером 140x140x1,5 мм. Электрофорез проводили при напряжении 100 в в течение 2-3 часов и заканчивали, когда краситель бромфе-ноловыи синий, внесенный вместе с образцами, достигал нижней границы геля. Гель прокрашивали 30 глин раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл), промывали водой (3 раза по 15 мин) и просматривали на ультрафиолетовом хемископе. Активность ДНК-зависимых РНК-полимераз определяли по включению радиоактивности из УТФ в кислотонерастворимый материал. Для этого препарат фермента (от 2 мг до 2 мкг в зависимости от стадии очистки) инкубировали в среде следующего состава: 100 мМ трис-НСІ рН 8,0; 2,5 мМ МпС12 ; 0,05 мМ ЭДТА; I мМ дитиотреито-ла; по 0,5 мМ АТФ, ГТФ, ЦТФ; ОД мМ Н3-УТФ (I мккюри), 5 мкг ДНК (смесь равных количеств нативной и денатурированной ядерной ДНК C.oncopelti). Объем инкубационной среды 100 мкл. Инкубацию проводили 10 мин при температуре 30С. Реакцию останавливали добавлением I мл ICffo раствора ТХУ, охлажденного во льду. В тех случаях, когда проба содержала менее 50 мкг белка, перед добавлением ТХУ вносили 0,1 мл раствора сывороточного альбумина (I мг/мл).
Свойства ДНК-зависимых РНК-полимераз
Изучение свойств ДНК-зависимых РНК-полимераз мы начали с определения условий среды, оптимальных для проявления активности ферментов. На рис. 13 показана зависимость РНК-полимеразной активности от температуры. Как РНК-полимераза I, так и РНК-поли-мераза П проявляют максимальную активность при 40С. При 30С активность снижается в два раза. Однако при 40С происходит быстрая инактивация ферментов: радиоактивность кислотонераствори-мого продукта линейно возрастает лишь в течение 5 мин, тогда как при 30С - до 20 мин. Поэтому определение активности в дальнейшем проводили при 30С. Следует отметить, при при повышении температуры активность РНК-полимеразы П падает быстрее, чем активность РБК-полимеразы I. Это противоречит нашим данным о тер-моинактивации РНК-полимеразной активности ядрышек и хроматина (стр.76). По-видимому, это объясняется стабилизирующим действием компонентов хроматина на РНК-полимеразу П. Для проявления активности обеих форм РНК-полимеразы необходимы двухвалентные катионы. РНК-полимераза I активировалась Мп2+ и Mg , тогда как РНК-полимераза П - только Мп : Зависимость активности от концентрации ионов Мп2+ и Mg2+ приведена на рис. 14. Для РНК-полимеразы I оптимальной была концентрация шг+ - 1,0-1,5 мМ, a Mg2+ - 1,5 мМ. При оптимальных кон- центрациях активность в присутствии Мп у была в 3,2 раза выше, р. чем в присутствии Mg ;. Для РНК-полимеразы I из других организ- 2л. мов отношение активностей при оптимальных концентрациях Мп"" и р. Mg ; колеблются в пределах от I до 3. Таким образом по отношению к двухвалентным катионам фермент из Concopeiti сходен с другими РНК-полимеразами I. Для РНК-полимеразы П оптимальная концен- р. трация Мп ; была равна 2 мМ. Отсутствие активности с ионами 2+ Щ в концентрациях до 20 мМ не является уникальным свойством фермента из критйдии. В тех случаях, когда РНК-полимераза П дру-гих эукариотов активировалась как Мп , так и Mgfe;, соотношение активностей колеблется от 5 до 30. В используемых нами условиях достоверное определение активности, в 30 раз меньшей, чем р, наблюдавшаяся в присутствии Мп , было невозможно. Поэтому полностью исключать возможность проявления активности РНК-полимера-зы П из Concopeiti в присутствии Mg нельзя. Зависимость активности двух форм РНК-полимеразы от концентрации (NH4)2so носила противоположный характер (рис. 15). РНК-полимераза I ингибировалась уже при концентрации соли 50 мМ, а при высоких концентрациях активность падала на 30%. РНК-полимераза П, наоборот, активировалась сульфатом аммония с оптимумом при 300 мМ. РНК-полимераза I из других объектов также ингибирует-ся высокими концентрациями соли, однако проявляет максимальную активности при 30-60 мМ (NH )2SO4 .
Что касается РНК-полимера- зы її, то она обычно характеризуется более четко выраженным максимумом активности, находящимся в области 50-150 мМ (HH )2so Таким образом, РНК-полимераза I из критидии в основном сходна с ферментами из других эукариотов, а РНК-полимераза її отличается большей устойчивостью к ионной силе. Активность ферментов имела сложную зависимость от рН (рис. 16). Обе формы были активны в интервале рН от 7,4 до 9,5. В этой области наблюдалось два максимума при рН 7,8 и 9,2. Измерение активности в трис-НСІ и трис-глициновом буфере дало одинаковые результаты. Следует отметить, что определение активности при рН выше 9,5 затруднено вследствии образования осадка Мп02 . Во избежание этого Мвг; добавляли в инкубационную смесь в последнюю очередь непосредственно перед инкубацией. Инкубацию проводили в течение 5-Ю мин, тогда как осадок образовывался через 20-30 мин. Сложная рН-зависимость объясняется, по-видимому, участием в реакции нескольких ионизирующихся субстратов. Крме / того, изменение рН может влиять на структуру самой РНК-полимера-зы. Так, инкубация фермента в растворе рН 6,8 в течение 30 мин при 2С приводила к полной инактивации. Для РНК-полимеразы из дрожжей показано, что при рН ниже 5,8 от РНК-полимеразы I отделяется комплекс из трех мелких субъединиц, что приводит к инактивации (35). Возможно, что аналогичные изменения происходят и с ферментом из критидии. После хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе активность фермента полностью зависела от добавления экзогенной ДНК. Активность двух форм РНК-полимеразы полностью подавлялась актиномицином D при концентрации 50 мкг/мл, что также указывает на ДНК-зависимый характер реакции. Продукт реакции полностью разрушался панкреатической РНКазой (25 мкг/мл, 37, 10 мин.). При гидролизе 0,75 н КОН в течение 16 часов при 37 радиоактивность из продукта реакции полностью переходала в кислоторастворимую фракцию. Это указывает на полирибонуклеотидную природу продукта реакции.
Таким образом, выделенные нами ферменты действительно являются ДНК-зависимыми РНК-полимеразами. Как и следовало ожидать, РНК-полимераза I не ингибировалась циклогексимидом. Ингибиторы бактериальных РНК-полимераз рифампи-цин (50 мкг/мл) и стрептолидигин (100 мкг/мл) не подавляли активности полученных ферментов, что может служить доказательством отсутствия бактериального загрязнения. Как уже отмечалось, РНК-полимераза I устойчива к действию К -аманитина, а РНК-полимераза П полностью ингибируется при низких концентрациях этого токсина. Таким образом, РНК-полимеразы с. oncopeiti по отношению к действию специфических ингибиторов не отличаются от ферментов других эукариотов. Низкая активность полученных нами препаратов РНК-полимераз могла быть обусловлена наличием примеси РНКазы, гидролизующей продукт сразу после его синтеза. Однако определение РНКазной активности показало, что заметной деградации РНК до кислотораство-римых продуктов в присутствии очищенного фермента не происходит даже за 30 мин. При инкубации в течение 60 мин радиоактивность высокомолекулярной РНК снижалась на 3-5/&, однако такое же снижение наблюдалось и в отсутствии фермента. Это позволяет заключить, что полученные нами препараты свободны от примеси РНКазы. При изучении эффективности транскрипции различных матриц серьезным источником ошибок может стать примесь ДНКазы в препарате РНК-полимераз. Она приводит к образованию однонитевых разрывов, брешей и к увеличению концентрации концов молекул ДНК, к которым РНК-полимеразы имеют повышенное сродство. Поэтому мы провеж определение ДНКазных активностей в препаратах РНК-пожмераз. Экзонуклеазную активность определяж в тех же условиях, что и активность РНКазы, используя в качестве субстрата ДНК меченую 14С-тимидином. Достоверного снижения радиоактивности кислотонерастворимого материала при инкубации в течение 60 мин не происходило. Эндонуклеазная активность, определяемая как описано в "Материалах и методах", в очищенных препаратах РНК-пожмераз отсутствовала. Дане инкубация в течение 180 мин не приводила к уменьшению дож сверхспиражзованной ДНК. Следует отметить, что фракция РНК-полимеразы I, полученная хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, но не очищенная на ДНК-агарозе, вызывала полный переход сверхспиражзованной ДНК в линейную за 30 мин. Дальнейшая инкубация до 180 мин не приводила к уменьшению размера ДНК. Такое действие может быть обусловлено нажчием нуклеазы, специфичной либо к нуклеотидной последовательности, встречающейся в использованной плазмиде один раз, жбо к определенным элементам структуры в сверхспиражзованной ДНК, например, к частично расплетенным участкам. 3.4.1. Вжяние матрицы на активность РНК-полимераз С. oncopelti. После очистки на ДЭАЭ-целлюлозе обе формы РНК-полимеразы для проявления активности требоваж экзогенной ДНК. Хроматография на ДНК-агарозе приводила к снижению зависимости ферментов от экзогенной матрицы. Поэтому для изучения матричной специфичности препараты ферментов после аффинной хроматографии пропускали через колонку, содержащую I см3 ДЭАЭ-целлюлозы. При концентрации (NH4)2so4 в элюенте 0,15 М сорбции фермента не происходило, а зависимость от матрицы восстанавливалась.
