Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДШИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
ГЛАВА I. ДНК-ЗШСИШЕ ШЫОЛШЁРАШ ПРОКАРИОТ . . 9
іфі. Открытие ДНК-завиоидах РНК-полимераз * , , 3
Выделение и очистка црепаратов РНК-полимераз 10
Физико-химические и моле кулярно-био л отческие свойства РНК-полимераз прокариот ... 12
Гетерогенность структуры РНК-полимераз . . 12
Роль полипедтвдов РНК-полимераз в процессе транскрипции 16
Структурная гомология РНК-полимераз прокариот и эунариот 20
.Бактериальные РНК-полимеразы, модифицированные под влиянием бактериофагов .... 22
Разнообразие реакций, катализируемых РНК-полимера загли 24
1.4. Вяияние различных факторов на активность
РНК-пшшмераз 26
ГЛАВА П, ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ КЛАССА
MOLLICUTES . 31
ЭКСПЕРШ^ЕНГАЛННАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА Ш. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33
Объекты исследования . 33
Культивирование микроорганизмов 34
Определение активности РНК-полимераз ... 34
Получение и цриготовление матриц 35
Выделение и очистка РНК-полимераз из мико-плазм 36
Электрофорез препаратов РНК-полимераз . ... 44
Методы изучения влияния различных факторов
на активность РНК-полимераз шкоплазм .... 47 ГЛАВА ІУ.ВЬЩЕЛЕШЕ И ХРОГ/АТСНТА^аЧЕСКИЕ ХАРАКГЕРИСТИШІ
ДНК-ЗШСИШХ РНК-П0ІШЕРАЗ МКОШГАЗй . ... 50
Получение РНК-лолимеразы из возбудителя бледно-зеленой карликовости зерновых Achole-ріаєша sp. 'IIS , , * 50
Получение РНК-полимеразы из сапрофитной микоплазмы Acholepiasma laidlawii PG 8 * 62
Получение РЯК-полямеразы из жкоплазмы ІЛусорІазта mycoides var.caprx PG 3? патогенной для животных 69
ГЛАВА У. СУЕЬЦДИНИЧНАЯ СТРУКТУРА Ш-ЗШСИШХ РНК-
ПОЛШЕРАЗ ШИШАМ 76
ГЛАВА УІ. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ .
РНК-ШЛИМЕРАЗ МИШШЗМ 82
ОВСУЗДКНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 103
ВЫВОДЫ 126
ЛИТЕРАТУРА . 128
^4-
Сокращения, наиболее часто встречающиеся б работе:
А - 10-кратный буферный раствор, содержащий 0,9 М трис + 0,8 М
борной кислоты и 0,022 М ЭДТА (рН 8,3); Б - 72,15 г акрилашда + 2,85 г бясанриламида в однократном
растворе А (100 ш); БСА - бычий сывороточный ааьбушш; Д - буферный раствор, содержащий 0,01 М трис.НСЇ рН 7,9 +
+0,001 М ЭДТА; ДМСО - диметилсульфоксдц; ДСН - додецилсулъфат натрия; ДТТ - дитиотреитол; їл*м. - молекулярная масса; НТФ - нукяеозвдтрифосфат; ПААГ - пшшакриламидный гель; РНК-полимераза « ДНК-зависимая ШК-гкшшераза; СА » сульфат ашония; ТРйС - трис-(оксиметил)-аг-шнометан; ТХУ - трихлоруксусная кислота; ТЗ - буферный раствор, содержащий 50 мМ трис-HGI рН 7,9 +
+ ОД мМ ЭДТА; ТЭД - буферный раствор, содержащий 50 М трис-HGI рН 7,9 +
+ ОД мМ ЭДТА + I vSA ДТТ + 1,5 Л ФМСФ; ТЭДГ - буферный раствор, содержащий 50 мЗЛ трис*НС1 рН 7,9 +
+ 0,1 мМ ЭДТА + I мМ ДТТ + 1,5 ыМ ФШСФ + 25$ глицерина; ТЗМЭД - й, И, Nїж 1 -тетрарлетилэтллендиамин; ФШФ - фенил^етилсульфанилйторид; ЭДТА - этилендиашнтетраацетат натрия; [ Н]УТФ - меченый уридинтряфосфат
Введение к работе
Транскрипция - первый этап в сложном механизме реализации генетической информации, закодированной в нукдеотидной последовательности ДНК. Передача этой информации осуществляется путем перевода ее в соответствующий тип РНК. При этом синтезируются РНК, которые принимают участие в процессе трансляции (рРНК, 5S и тРНК), информационные РНК (иРНК), играющие важную роль б синтезе различных белков к РНК-затравки, причастные к инищации процесса синтеза ДНК.
Синтез этих типов РНК на матрице ДНК у всех организмов осуществляется ДНК-зависимой РНК-полимеразой (РНК-полимеразой), называемой еще транскриптазой.
Свойства РНК-полимераз многих прокариотичеоких организмов изучены достаточно хорошо. У представителей класса Moiiicutes эти ферменты не исследованы и не разработаны способы их выделения из клеток микодлазм. Тот факт, что РНК-полимеразы у мико-плазм до сих пор практически не изучались, объясняется трудностями получения необходимого количества клеток, а также чрезвычайной сложностью методов выделения этих ферментов, их концентрирования и сохранения активности. Детальное изучение свойств РНК-полимераз требует больших количеств биомассы клеток и ферментов высокой чистоты.
Учитывая возросший интерес к изучению микошгазм и их биологической роли, следует признать, что имеющихся данных явно недостаточно для полной характерыстики этой важнейшей группы микроорганизмов. Изучение РНК-полимераз микоплазм позволит более глубоко понять особенности этого класса микроорганизмов, установить место в мире микробов и определить фундаментальные основы их биологической активности.
Результаты изучения ингиПирующего действия U -аманитина на poGT шкошшзм - типичных представителей прокариот - нослуштли косвенным основанием для предположения о существовании у микоплазм иной, чем у других прокариот» РНК-полимеразной системы, а именно, ^-аманитин чувствительной РЯК-пошшеразы /Скрипаль, 1977/. Одной из особенностей ферментативной системы прокариот является отсутствие рС -аманитин чувствительной ДНК-зависимой
РНК-ПОММераЗЫ, НаЙДеННОЙ у эукариоТ /Redinger et al.( 1970/,
Предполагается, что наличие с-аманитин чувствительной РНК-по-лимеразы у микоплазм связано с их патогенными свойствами. Как известно, представители этой грушш микроорганизмов являются возбудителями многих заболеваний человека, животных и растений. Таким образом, дальнейшее изучение этого вопроса может иметь существенное значение для выяснения механизма патогенности данных микроорганизмов* Выделение я изучение ДНК-зависимых РНК-полимераз микоплазм представляется актуальным как в теоретическом, так и в практическом отношении. Препараты PHK-полимєраз могут применяться в генно-инженерных исследованиях для синтеза РНК in vitro, для более детального изучения механизмов транскрипции и трансляции, Вакным для установления гомологии РНК-полимераз эука-риот и прокариот является выяснение их субъединичной структуры, что может послужить ключем к пониманию эволюции как ферментов, так и микроорганизмов.
Целью настоящей работы является сравнительное изучение ДНК-зависимых ШК-полимераз микоплазм, представляющих различные семейства класса Moliicutes, и отличающихся как местом обитания, так и биологической активностью.
В работе были поставлены следующие задачи:
I. Разработать метод выделения л очистки ДНК-зависимых РНК-полимераз из клеток микоплазм.
_ 7 -
Провести сравнительное изучение физико-химических и МО-лекулярно-биологических свойств РНК-полимераз микоплаэм*
Установить субъединичную структуру РНК-полимераз мико-плазм, их молевулярную массу, степень сходства этих ферментов с РНК-полимеразами других прокариотических микроорганизмов,
В результате проведенных исследований впервые разработаны сравнительно быстрые методы выделения и очистки РНК-полимераз из миколлазм. Применение элективной аффинной (гепарин-сефаро-за, зеленый А) и ионообменной (ДЭАЭ-целлюлоза, Ш-сефадекс) хроматографии позволило исключить длительную процедуру высокоскоростного центрифугирования. Новый метод обеспечивает получение удовлетворительных результатов, хорошую воспроизводимость. Он позволяет провести полную очистку РНК-полимераз из небольшого количества исходного материала (1р5-2,0 г) за 1-2 дня.
Впервые получены РНК-полимеразы из представителей семейства Acholeplasraataceae - сапрофита Acholeplasma laidlavdi PG 8 и Acholeplasma sp* шташа 118, являющегося возбудителем бледно-зеленой карликовости зерновых, и семейства Mycoplasmataceae -патогенного для животных штамма Mycoplasma mycoides PG З*
Из M*mycoides PG 5 и штамма 118 выделены две формы РНК-полшлеразы, отличающиеся условиями элюирования с хроматографи-чесішх колонок и субъединичной структурой* Две формы РНК-поли-меразы штамма IIS отличаются еще и чувствительностью к <^-ама-нитину*
Структура РНК-полимераз микоплазм по основным субъединицам сходна с аналогичными ферментами! других прокариот* Однако есть и специфические белки, играющие роль в процессе транскрипции и определяющие индивидуальность этих ферментов. РНК-полимеразы микоплазм по субъединичнои структуре ближе всего к РНК-нолиме-
разам грамположтельных эубактерий, их бащллус-шшстридиальной ветви.
Возможность получения РНК-полимераз шкоплазм в достаточном количестве позволила детально изучить свойства и субъединичный состав ферментов- Определены оптимальные условия проявления максимальной активности РНК-полимераз шкоплазм in vitro. Исследована зависимость транскрипции от матриц, ингибиторов и активаторов синтеза РНК,
Работа выполнена в отделе микоплазмологии Института микробиологии и вирусологии им.Д.К. Заболотного АН УССР под руководством кавдидата биологических наук Й.Г.Скрипаля-
Культивирование и наработка клеток макоияазм для выделения РНК-псишмераз проводились совместно с ЛМ,Малиновской, а выделение ДНК из микоплазм для использования их в качестве матриц для синтеза РНК in vitro выполнено совместно с кандидатом биологических наук Л.ЇЇ*їїанченко.
^9-
0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ
