Введение к работе
Актуальность проблемы. Структурная целостность ДНК постоянно подвергается действию множества экзогенных и эндогенных агентов. Для того, чтобы им противостоять, клетки имеют ряд защитных механизмов, которые действуют на различных уровнях, предотвращая и/или исправляя повреждения. Однако молекулярные механизмы узнавания и удаления поврежденных оснований из ДНК ферментами репарации до конца не ясны.
Одним из ключевых и самых универсальных путей репарации таких точечных повреждений в ДНК, как модификация оснований, является эксцизион-ная репарация. В эксцизионной репарации оснований основную роль играют ДНК-Ы-гликозилазы. В связи с этим представляется чрезвычайно важным детальное изучение молекулярных механизмов узнавания и исправления повреждений такими ферментами. Впервые этот механизм был обнаружен на примере остатков урацила, возникающих в ДНК в результате спонтанного дезаминирования цитози-на или при ошибочном включении урацила при синтезе ДНК. Этот процесс осуществляется с помощью урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ), гидролизующей N -гликозидную связь между урацилом и сахарофосфатным остовом ДНК. УДГ относится к монофункциональным гликозилазам, не обладающим апурин/апиримидин - лиазной активностью и является высококонсервативным ферментом.
Рентгеноструктурный анализ (РСА) УДГ человека, вируса простого герпеса и E.coli выявил некоторые принципы узнавания «неправильных» оснований в ДНК. Тем не менее, молекулярные механизмы узнавания и удаления поврежденных оснований из ДНК до конца не выяснены. Изучение взаимодействий УДГ с ДНК является актуальным и необходимо для более глубокого понимания механизмов действия ферментов репарации.
Цель работы. Целью данной работы было изучение закономерностей взаимодействия УДГ с ДНК. Для этого представлялось целесообразным:
-
исследование активности УДГ по отношению к одноцепочечным (оц) и двуце-почечным (дц) олигонуклеотидам (ON);
-
изучение влияния расположения и окружения модифицированных нуклеотид-ных (нд) звеньев в ON различного состава и их комплексов на активность УДГ;
-
исследование влияния модификаций dU-звена на эффективность комплексооб-разования и скорость катализируемой УДГ реакции;
4)изучение специфических и неспецифических взаимодействий УДГ с ДНК на количественном уровне с помощью анализа ингибирования исследуемого фермента ON различного состава и длины;
5)оценка относительного вклада специфических и неспецифических взаимодействий УДГ с ДНК в обеспечение специфичности действия фермента.
Научная новизна и практическая ценность работы. Работа представляет собой первое, проведенное на количественном уровне систематическое исследование механизмов узнавания УДГ ДНК, дезоксирибоолигонуклеотидов и их производных, содержащих дезоксиурацил (dU) или его аналоги в различных положениях цепи. Впервые проведен детальный кинетический и термодинамический анализ закономерностей взаимодействия УДГ с ДНК; определены величины Kj (AG), характеризующие эффективность комплексообразования УДГ с ON различного состава и длины. Опубликованные в 1995 г. результаты РСА УДГ позволили сопоставить, а также интерпретировать данные РСА в свете термодинамического и кинетического анализов действия фермента.
Публикации и апробации работы. По материалам диссертации опубликовано 7 статей. Результаты работы были доложены на 9 Международных конференциях: French-Russian Symposium on Regulation of Gene Expression, Novosibirsk, Russia, 1995; 3d IUBMB Conference on Molecular Recognition, Singapore, 1995; 4th New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification, Igls, Austria, 1997; XIII French-Russian Symposium, Montpellier - He des Embiez, 1997; Recombination: mechanism and biological consequences, Avignon, France, 1995; Международная конференция «Современные концепции эволюционной генетики», Новосибирск, 1997; The 3d International Engelhardt Conference on molecular biology, Moscow, 1997; 1th International conference on bioinformatics of genome regulation and structure, Novosibirsk, Russia, 1998; 2d International conference on bioinformatics of genome regulation and structure, Novosibirsk, Russia, 2000.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 118 страницах, содержит 24 рисунка и 10 таблиц. Библиография включает 244 литературных источника
