Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение биосинтеза белка - одна из главных задач молекулярной биологии. Образование полипептидной цепи представляет собой заключительный этап, на котором осуществляется перевод генетической информации, заключенной в молекулах ДНК, в белковые структуры. Одним из центральных событий процесса трансляции является взаимодействие матричной и транспортных РНК с рибосомами. Существует ряд принципиальных отличий в механизмах белкового синтеза у эукариот и прокариот, причем основные различия проявляются на стадии инициации трансляции. Последовательность событий в цикле реакций, приводящих к образованию полипептидной цепи, хорошо известна. Однако молекулярные механизмы происходящих при этом процессов остаются во многом непонятыми, и в особенности это касается стадии инициации белкового синтеза в эукариотичесяих клетках. Существенный сдвиг в этом направлении, по-видимому, возможен после детального изучения структурно-функциональной топографии главного компонента аппарата трансляции - рибосомы. Очевидно, что изучение структурной организации функциональных центров прокариотических и эукариотических рибосом наряду с выяснением структурных особенностей, обуславливающих различия в механизмах функционирования на стадии инициации позволило бы получить информацию для построения молекулярной модели функционирующей рибосомы и расширило бы наше понимание молекулярных механизмов процессов, происходящих при синтезе полипептидной цепи. Одним из подходов к изучению структурных элементов рибосомы, вовлеченных в формирование тех или иных функциональных центров является метод аффинной модификации рибосом реакционноспособными аналогами компонентов аппарата трансляции (мРНК, тРНК, АТР, факторов инициации и GTP). С использованием этого метода были достигнуты значительные успехи в изучении структурно-функциональной топографии рибосом E.coli (Graifer et al., 1989, Yladimirov et al., 1990). В этом отношении эукариотические рибосомы и, в частности, рибосомы человека, оставались малоизученными. Так, например, до начала настоящей работы практически отсутствовали данные о том, какие контакты матрицы с 40S субчастицей реализуются на стадии инициации трансляции.
Цель работы. Целью настоящей работы было исследование взаимодействия аналогов мРНК: [4-(Ы-2-хлорэтил)-Ы-метиламино]бен-зилметилфосфамидных производных олигорибонуклеотидов pAUGU^
(где п=0,3) и г'-,3,-о-[4-(И-2-хлорэтил}-ы-металамино]беизилиде-новых производных олигорибонуклеотидов AUGU с (где п=0,3) С 40S рибосомными субчастицами из плаценты человека в составе модельного инициаторного комплекса 40s*elF-2,GTP'Met-TPHK'!!et'aHaflor мРНК.
Научная новизна. Впервые изучена аффинная модификация 40S субчастиц рибосом из плаценты человека производными олигорибонуклеотидов разной длины, содержащих инициирукщий кодон AUG, с алкилирупцей группой на 5'- или 3'-конце в составе модельного инициаторного комплекса 40S'elF-2'Grp-Met-TPHK^etаналог мРНК. Идентифицированы фрагменты I8S рРНК (длиной 81-138 нуклеотидных звеньев), внутри которых расположены участки I8S рРНК, принимающие участие в формировании 5'- или 3'- зоны области кодон-антикодоновых взаимодействий. С помощью олигонуклеотидных зондов, комплементарных 15-звенвым участкам внутри одного из этих фрагментов, выявлены последовательности IBS рРНК, имеющие функциональную значимость во взаимодействии 40S субчастицы с тройным Комплексом eIF-2'GTP'Met-T И матрицей. Идентифицированы рибосомные белки, формирующие область кодон-антикодоновых взаимодействий или примыкающие к ней в 40S инициаторном комплексе .
Практическая ценность. Разработан метод выделения модифици-рованных рибооомных белков с ковалентно присоединенным остатком олигонуклеотида с помощью одномерного гель-электрофореза. Предложена модель расположения матрицы в участке кодон-антикодоновых взаимодействий в комплексе инициации 40S-eir-2*GTP'Met-TPHK^et<aHanor мРНК.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на между-народной конференции "Биосинтез белка" (Пущино, 1991), франко-российском симпозиуме по молекулярной биологии "Биосинтез белков. Структура генома" (Конкарно, 1992), международной конференции "Аппарат трансляции" (Берлин, 1992).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 134 стра-ницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов я списка цитируемой литературы из 240 наименований и содержит 9 таблиц и 13 рисунков.
