Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Молекулярные основы взаимодействий, обеспечивающих инициацию трансляции РНК вируса гепатита С (Обзор литературы) 9
1.1. Структура IRES 11
1.1.1. Структура домена II 13
1.1.2. Структура домена III 17
1.1.3. Структура соединения ШаЬс 22
1.2. Стадии IRES-зависимой инициации трансляции РНК ВГС и факторы необходимые для этого процесса 24
1.2.1. Образование бинарного комплекса 24
1.2.2. Образование 48S инициаторного комплекса 26
1.2.3. Образование 80S инициаторного комплекса 27
1.3. Альтернативный способ IRES зависимой инициации трансляции у ВГС 29
1.4. Функциональная роль доменов IRES ВГС в инициации трансляции 32
1.4.1. Функциональная роль домена III 32
1.4.1.1. Влияние мутаций в IRES ВГС на эффективность инициации трансляции...32
1.4.1.2. Участие домена III в связывании IRES ВГС с 40S субчастицей 35
1.4.1.3. Участие домена III IRES ВГС в его связывании с eIF3 39
1.4.1.4. Участие домена III IRES в формировании 48S и 80S комплексов инициаци. 40
1.4.2. Функциональная роль домена II 40
1.4.2.1. Участие домена II в высвобождении фактора eIF2 42
1.4.2.2. Влияние структуры домена II на функционирование IRES ВГС 43
1.4.2.3. Взаимосвязь домена II ирибосомного белка S5 44
1.4.3. Функциональная роль других районов 45
1.5. Структура комплексов инициации IRES ВГС по данным крио-ЭМ и сшивок 47
1.5.1. Взаимодействие IRES с 40S субчастицей рибосомы 47
1.5.2. Комплекс IRES ВГС с фактором инициации eIF3 50
1.5.3. Структурная модель IRES»40S«eIF3 комплекса 52
1.5.4. SOS-инициаторный комплекс 53
1.5.4.1. Конформагщонные перестройки 40S субчастиц, вызванные связыванием IRES ВГС с 80S рибосомой 53
1.5.4.2. Структура IRES ВГС в 805-комплексе 55
1.5.4.3. Контакты IRES ВГС в SOS-комплексе 58
1.6. Дополнительные факторы, влияющие на эффективность трансляции мРНК вируса гепатита С 60
1.7. Заключение 65
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 67
2.1. Материалы 67
2.2. Выделение рибосомных 40S субчастиц из плаценты человека 68
2.3. Наработка и выделение плазмиды pXL40-372.NS 70
2.4. Получение IRES ВГС с помощью Т7-транскрипции 70
2.4.1. Получение статистически [32Р]-меченого IRES ВГС 70
2.4.2. Получение биотинилированого слабомеченого IRES ВГС 71
2.5. Фосфорилирование олигонуклеотидов по 5'-концу 71
2.6. Получение 4-[г>[-(2-хлорэтил)-К-метиламино]бензил-5'-фосфамидов ол игодезоксирибонуклеотидов 72
2.7. Сайт-направленное введение фотоактивируемой группы в IRES ВГС 73
2.7.1. Комплементарно-адресованная модификация IRES ВГС 73
2.7.2. Гидролиз фосфамидной связи 73
2.7.3. Введение перфторфенилазидогруппы 74
2.8. Гидролиз ковалентных аддуктов IRES ВГС с помощью РНКазы Н 74
2.9. Определение модифицированных нуклеотидов в IRES ВГС с помощью метода обратной транскрипции 74
2.10. Получение бинарных комплексов 40S рибосомных субчастиц с IRES ВГС и его фотоактивируемыми производными 75
2.11. Определение степени связывания IRES ВГС и его производных с 40S субчастицами 76
2.12. Фотоаффинная модификация 40S субчастиц производными IRES ВГС 77
2.13. Выделение бинарных комплексов 40S субчастиц с IRES ВГС и его фотактивируемыми производными с помощью сахарозного градиента 77
2.14. Разделение модифицированных субчастиц на РНК и белки с помощью сахарозного градиента 77
2.15. Выделение суммарной РНК из модифицированных субчастиц 78
2.16. Анализ модификации 18S рРНК электрофорезом в агарозе 79
2.17. Выделение рибосомных белков из комплексов 40S субчастиц с производными IRES ВГС 79
2.18. Выделение рибосомных белков, сшитых с производными биотинилированного IRES ВГС 80
2.19. Выделение суммарного белка 40S субчастицы экстракцией уксусной кислотой 80
2.20. Определение модифицированных рибосомных белков с помощью одномерного гель-электрофореза 81
2.21. Определение модифицированных рибосомных белков с помощью двумерного гель-электрофореза 82
2.22. Анализ модифицированных белков с помощью иммунопреципитации 83
ГЛАВА 3. Молекулярное окружение IRES-элемента РНК вируса гепатита С на 40S субчастице рибосомы человека 84
3.1. Исследование роли различных доменов IRES ВГС в связывании с 40S субчастицей 84
3.1.1. Критерии выбора олигодезоксирибонуклеотидов для комплементарно-адресованной модификации 85
3.1.2. Получение ковалентных аддуктов 32Р-меченого IRES ВГС с производными олигодезоксирибонуклеотидов 85
3.1.3. Анализ связывания аддуктов IRES ВГС с 40S рибосомными субчастицами 90
3.2. Получение и характеризация производных IRES ВГС 92
3.2.1. Введение фотактивируемых групп в определенные положения IRES ВГС 92
3.2.2. Определение модифицированных нуклеотидов IRES ВГС 95
3.2.3. Связывание фотоактивируемых производных IRES ВГС с 40S субчастицами 97
3.3. Определение компонентов 40S субчастицы, сшивающихся с производными IRES ВГС 98
3.3.1. Сшивка производных IRES ВГС с 40S субчастицей и анализ модификации 18SpPHK 98
3.3.2. Определение белков, сшитых с производными IRES ВГС в бинарном комплексе 99
3.3.2.1. Особенности идентификации сшитых белков 99
3.3.2.2. Определение белков 40S субчастицы, сшитых с РНК IV и VII 100
3.3.2.3. Определение белков, сшитых с РНК III, V и VIII 104
3.4. Рибосомные компоненты, окружающие IRES ВГС Ha40S субчастице 107
3.5. Соотнесение полученных данных с данными крио-электронной микроскопии 110
Заключение 113
Выводы 114
Список литературы 115
- Альтернативный способ IRES зависимой инициации трансляции у ВГС
- Конформагщонные перестройки 40S субчастиц, вызванные связыванием IRES ВГС с 80S рибосомой
- Получение бинарных комплексов 40S рибосомных субчастиц с IRES ВГС и его фотоактивируемыми производными
- Получение ковалентных аддуктов 32Р-меченого IRES ВГС с производными олигодезоксирибонуклеотидов
Введение к работе
Вирус гепатита С является одним из опаснейших патогенов, которым по данным Всемирной Организации Здравоохранения инфицировано более 180 миллионов человек в мире [1]. Инфекция, вызванная вирусом гепатита С, в клинически выраженных случаях характеризуется симптомами острого поражения печени, которое в большинстве случаев заканчивается развитием хронического гепатита с возможным переходом в цирроз и первичный рак печени.
Вирус гепатита С (ВГС) относится к РНК-содержащим вирусам (род Гепацивирусы семейства флавивирусов). Его геном представлен линейной одноцепочечной РНК (плюс-цепью) длиной около 9600 нуклеотидов. Одной из ключевых стадий жизненного цикла вируса гепатита С в клетках является инициация трансляция геномной РНК, которая происходит по альтернативному кэп-независимому механизму благодаря наличию в ее 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) высокоструктурированного элемента с уникальной вторичной и третичной структурой, так называемого «внутреннего сайта посадки рибосомы» (IRES, от англ. Internal Ribosomal Entry Site) [2, 3].
Последовательность событий, происходящих при инициации трансляции РНК ВГС, известна. Функциональная роль отдельных субдоменов IRES ВГС также хорошо изучена (см., например, [4]). В соответствии с общепринятой гипотезой IRES ВГС, связываясь с 40S субчастицей рибосомы, на первой стадии инициации трансляции образует 40S инициаторный комплекс, обеспечивая при этом правильное расположение инициаторного кодона на 40S субчастице в отсутствие каких-либо факторов инициации трансляции. Известно, что для формирования этого комплекса критичными элементами в IRES ВГС являются субдомены Hid и Ше и соединение ШаЬс. Однако структурная организация участка связывания IRES ВГС на 40S субчастице изучена меньше, чем функциональная роль его доменов. Работы по прямым УФ-индуцируемым сшивкам показали, что в составе комплекса с 40S субчастицей IRES ВГС сшивается с единственным рибосомным белком, который был идентифицирован вначале как S9 [3, 5], а в последствии - как S5. При использовании IRES ВГС со статистически распределенными остатками тиоуридина наблюдали сшивки с белками S2, S3, S10, S15, S16/S18 и S27 [6]. Таким образом, результаты этих работ позволяют судить об окружении на 40S субчастице 5'-концевого участка РНК ВГС в целом, но не обеспечивают информацией, касающейся окружения
отдельных структурных элементов IRES ВГС. Основываясь на данных по сшивкам и принимая во внимание тот факт, что 40S субчастицы низших эукариот не способны связывать IRES ВГС, авторы [6] выдвинули гипотезу о том, что в формирование участка связывания IRES ВГС на 40S субчастице вовлечены специфичные для высших эукариот фрагменты рибосомных белков, а не 18S рРНК. В последнее время для изучения комплексов рибосом эукариот с различными лигандами интенсивно используют метод криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) [7-9]. Однако разрешения, которого пока удается достичь, недостаточно, чтобы выйти на уровень отдельных нуклеотидов РНК, поэтому работы по визуализации IRES ВГС в комплексах с рибосомами с помощью крио-ЭМ дают лишь общее представление о расположении IRES на рибосоме. Таким образом, данные об окружении отдельных структурных элементов IRES ВГС на 40S субчастице рибосомы, которые необходимы для понимания молекулярных основ взаимодействий, обеспечивающих формирование бинарного комплекса на первой стадии инициации трансляции вирусной РНК, до последнего времени отсутствовали.
Целью настоящей работы являлось изучение структурной организации области связывания IRES ВГС на 40S субчастице рибосомы человека в составе бинарного комплекса, имитирующего начальную стадию инициации трансляции вирусной РНК, с помощью метода аффинной модификации. Для этой цели использованы производные IRES ВГС, несущие фотоактивируемую перфторарилазидогруппу на определенных нуклеотидах, полученные с помощью комплементарно-адресованной модификации соответствующих РНК-транскриптов алкилирующими производными олигодезоксирибонуклеотидов.
Основными задачами являлись:
получение ковалентных аддуктов IRES ВГС с олигодезоксирибонуклеотидами, комплементарными его различным последовательностям в доменах II и III, и определение их активности в связывании с 40S субчастицами рибосомы человека;
получение фотоактивируемых производных IRES ВГС, несущих перфторарилазидогруппу на различных нуклеотидных остатках в составе доменов II и III, и определение их активности в связывании с 40S субчастицами.
аффинная модификация 40S субчастиц фотоактивируемыми производными IRES ВГС в составе бинарных комплексов и определение рибосомных компонентов, сшивающихся с этими производными.
Альтернативный способ IRES зависимой инициации трансляции у ВГС
Вирус гепатита С является одним из опаснейших патогенов, которым по данным Всемирной Организации Здравоохранения инфицировано более 180 миллионов человек в мире [1]. Инфекция, вызванная вирусом гепатита С, в клинически выраженных случаях характеризуется симптомами острого поражения печени, которое в большинстве случаев заканчивается развитием хронического гепатита с возможным переходом в цирроз и первичный рак печени.
Вирус гепатита С (ВГС) относится к РНК-содержащим вирусам (род Гепацивирусы семейства флавивирусов). Его геном представлен линейной одноцепочечной РНК (плюс-цепью) длиной около 9600 нуклеотидов. Одной из ключевых стадий жизненного цикла вируса гепатита С в клетках является инициация трансляция геномной РНК, которая происходит по альтернативному кэп-независимому механизму благодаря наличию в ее 5 -нетранслируемой области (5 -НТО) высокоструктурированного элемента с уникальной вторичной и третичной структурой, так называемого «внутреннего сайта посадки рибосомы» (IRES, от англ. Internal Ribosomal Entry Site) [2, 3].
Последовательность событий, происходящих при инициации трансляции РНК ВГС, известна. Функциональная роль отдельных субдоменов IRES ВГС также хорошо изучена (см., например, [4]). В соответствии с общепринятой гипотезой IRES ВГС, связываясь с 40S субчастицей рибосомы, на первой стадии инициации трансляции образует 40S инициаторный комплекс, обеспечивая при этом правильное расположение инициаторного кодона на 40S субчастице в отсутствие каких-либо факторов инициации трансляции. Известно, что для формирования этого комплекса критичными элементами в IRES ВГС являются субдомены Hid и Ше и соединение ШаЬс. Однако структурная организация участка связывания IRES ВГС на 40S субчастице изучена меньше, чем функциональная роль его доменов. Работы по прямым УФ-индуцируемым сшивкам показали, что в составе комплекса с 40S субчастицей IRES ВГС сшивается с единственным рибосомным белком, который был идентифицирован вначале как S9 [3, 5], а в последствии - как S5. При использовании IRES ВГС со статистически распределенными остатками тиоуридина наблюдали сшивки с белками S2, S3, S10, S15, S16/S18 и S27 [6]. Таким образом, результаты этих работ позволяют судить об окружении на 40S субчастице 5 -концевого участка РНК ВГС в целом, но не обеспечивают информацией, касающейся окружения отдельных структурных элементов IRES ВГС. Основываясь на данных по сшивкам и принимая во внимание тот факт, что 40S субчастицы низших эукариот не способны связывать IRES ВГС, авторы [6] выдвинули гипотезу о том, что в формирование участка связывания IRES ВГС на 40S субчастице вовлечены специфичные для высших эукариот фрагменты рибосомных белков, а не 18S рРНК. В последнее время для изучения комплексов рибосом эукариот с различными лигандами интенсивно используют метод криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) [7-9]. Однако разрешения, которого пока удается достичь, недостаточно, чтобы выйти на уровень отдельных нуклеотидов РНК, поэтому работы по визуализации IRES ВГС в комплексах с рибосомами с помощью крио-ЭМ дают лишь общее представление о расположении IRES на рибосоме. Таким образом, данные об окружении отдельных структурных элементов IRES ВГС на 40S субчастице рибосомы, которые необходимы для понимания молекулярных основ взаимодействий, обеспечивающих формирование бинарного комплекса на первой стадии инициации трансляции вирусной РНК, до последнего времени отсутствовали.
Целью настоящей работы являлось изучение структурной организации области связывания IRES ВГС на 40S субчастице рибосомы человека в составе бинарного комплекса, имитирующего начальную стадию инициации трансляции вирусной РНК, с помощью метода аффинной модификации. Для этой цели использованы производные IRES ВГС, несущие фотоактивируемую перфторарилазидогруппу на определенных нуклеотидах, полученные с помощью комплементарно-адресованной модификации соответствующих РНК-транскриптов алкилирующими производными олигодезоксирибонуклеотидов.
Основными задачами являлись: получение ковалентных аддуктов IRES ВГС с олигодезоксирибонуклеотидами, комплементарными его различным последовательностям в доменах II и III, и определение их активности в связывании с 40S субчастицами рибосомы человека; получение фотоактивируемых производных IRES ВГС, несущих перфторарилазидогруппу на различных нуклеотидных остатках в составе доменов II и III, и определение их активности в связывании с 40S субчастицами. аффинная модификация 40S субчастиц фотоактивируемыми производными IRES ВГС в составе бинарных комплексов и определение рибосомных компонентов, сшивающихся с этими производными.Инициация биосинтеза белка (трансляции) является важнейшей и, зачастую, лимитирующей стадией процесса реализации генетической информации у эукариот. Инициация трансляции подавляющего большинства эукариотических мРНК относительно хорошо изучена и происходит по кэп-зависимому механизму [10, 11]. Согласно этому механизму, малая 40S субчастица рибосомы сначала взаимодействует с тройным комплексом, состоящим из фактора инициации трансляции eIF2, инициаторной тРНК и GTP, а затем при помощи факторов инициации трансляции 4 группы присоединяется к кэп-структуре на 5 -конце мРНК и сканирует ее в 3 -направлении в поисках стартового кодона AUG. После того, как такой кодон окажется в Р-участке 40S субчастицы, происходит присоединение 60S субчастицы с образованием 80S инициаторного комплекса. В этом процессе участвуют также факторы инициации первой и пятой групп.
Конформагщонные перестройки 40S субчастиц, вызванные связыванием IRES ВГС с 80S рибосомой
Структура субдомена Hid была разрешена с помощью ЯМР-спектроскопии одновременно двумя различными группами авторов [44, 47] (рис. 7). Полученные данные в целом хорошо согласуются между собой и с предполагаемой вторичной структурой этого субдомена [18, 26-30], согласно которой субдомен Hid состоит из двух спиральных районов, разделенных внутренней петлей, и апикальной шестинуклеотиднои петли UUGGGU. По данным ЯМР эта шестинуклеотидная петля представляет собой наиболее разупорядоченный район третичной структуры субдомена Hid [44, 47], в то время как его высококонсервативная внутренняя петля [25] принимает форму Е-петлевого мотива, как и прилегающий к апикальной петле фрагмент в субдомене ПЬ (см. раздел 1.1.1 и рис. 1). Четыре последовательные неканонические пары во внутренней петле представлены сдвинутой парой G256»A276, параллельной парой А257»А275, обращенной хугстеновской парой U259»A274 и еще одной сдвинутой парой A260G273. Расположение этих пар в Е-петлевом мотиве создает протяженную стопку четырех аденинов (А260 и А274-276), с уотсон-криковскими поверхностями, экспонированными в малую бороздку. Внутренняя петля асимметрична с максимальной выпуклостью в положении G258 в основной бороздке, где этот нуклеотид принимает участие в формировании триплета с обращенной хугстеновской парой U259 A274. Фосфодиэфирный остов подвергается локальному обращению, образуя мотив Surn, что характерно для Е-петлевого мотива [44].
Пространственная Следует отметить, что Е-петлевой мотив является распространенной структурной особенностью многих молекул РНК, таких, например, как 5S (см., например, [48]) и 28S рРНК [42]. Все Е-петлевые мотивы содержат деформированные пары G»A и расположенные рядом пары 1 А и представляют огромный потенциал для образования водородных связей в большой и малой бороздках при любых типах взаимодействий (РНК-РНК и РНК-белок).
Способность формировать Е-петлевую структуру консервативна у IRES ВГС. В работе Г44] показано, что мутации, нарушающие эту структуру в субдомене Hid, ведут к потере трансляционной активности IRES. Е-петлевой мотив с его суженной главной бороздкой, деформированным остовом и протяженными участками неканонического спаривания может быть вовлечен как во внутримолекулярные взаимодействия, образующие третичную структуру, так и в межмолекулярпыс взаимодействия IRES ВГС с компонентами аппарата трансляции.
Последовательность UUGGGU апикальной петли субдомена Hid также абсолютно консервативна у IRES ВГС [25J (рис. 1), как и соответствующая последовательность субдомена Ше (см. выше). Нуклеотид G268 образует параллельную транс-wobble пару с U264, и эта пара находится в стэкинг-взаимодействии с уотсон-криковской парой G263»C270. Нуклеотиды U265, G266 и G267, неспарены, при этом G266 и G267 экспонированы наружу, a U265 направлен во внутрь петли. Эти нуклеотиды обеспечивают такой поворот остова, что структура петли оказывается похожей на так называемый мотив Uurn, найденный ранее у тРНК [49]. Нуклеотид U269 выпячен из петли, а окружающие его нуклеотиды G268 и С270 находятся в стэкинге, кроме того, на нуклеотиде G268 происходит инверсия остова, что в результате приводит к формированию мотива Surn. Таким образом, в структуре субдомена Hid существует сразу два Е-петлевых мотива: один - в районе внутренней петли, а другой - вблизи апикальной. Эти петли разделены коротким спиральным стеблем, состоящим из wobble пары G»U, ограниченной двумя парами G»C, при этом оба Е-петлевых мотива располагаются с одной стороны субдомена Hid, что и обеспечивает уникальность его структуры.
В отличие от высококонсервативной первичной структуры субдоменов Ше и Hid, нуклеотидная последовательность субдомена ШЬ у IRES ВГС вариабельна. Тем не менее, как было показано в работе [50] с помощью ЯМР спектроскопии, домен ШЬ содержит высококонсервативный элемент пространственной структуры в районе внутренней петли и примыкающего к ней стебля (рис. 8).
В этом элементе структуры нуклеотиды А182 и С183 формируют стандартный шаг правовинтовой спирали, а А214 на противоположной стороне участвует в стэкинг-взаимодействии с С213 и А215, при этом сахарофосфатный остов локально инвертирован на основании А215, что характеризует наличие Е-петлевого мотива. Остаток С183 находится напротив инвертированного А215, и эти два нуклеотида формируют обратную wobble пару с двумя водородными связями между атомами водорода аминогруппы и азота иминогруппы. Нуклеотид U216 выпетлен наружу из-за инверсии остова, что также является характерной чертой Е-петлевого мотива. Все остальные спиральные закручивания остова имеют стандартные характеристики А-спирали. Стэкинг-взаимодействия между нуклеотидами С213, А214, А215 и G217 достаточно сильны, тогда как противоположные основания А182, С183 и G184 перекрываются лишь слегка, что может приводить к повышенной внутренней подвижности структуры в этом районе, чему также способствует ошибочное (от англ. mismatch) спариване ОС в прилегающем стебле. Лентовидное изображение СА-(зеленый) и AU- (желтый) вариантов структуры.
В целом, такая структура внутренней петли у субдомена ШЬ, названная СА-вариантом структуры [50], сохраняется при любой нуклеотидной последовательности этой петли, за единственным исключением, когда в положении 183 находится остаток А, а в положении 214 - остаток U, что приводит к формированию канонической пары A»U и соответствует AU-варианту структуры. Локально инвертированный нуклеотид А215 неспарен и участвует в стэкинг-взаимодействии с остатками U214 и G217, что незначительно сказывается на форме спирали (рис. 8).
С помощью ЯМР изучена также структура декануклеотидного синтетического РНК-транскрипта с последовательностью субдомена Шс [51]. Показано, что этот субдомен состоит из стебля, образованного тремя парами G»C и оригинальной четырехнуклеотидной петлей (рис. 9), все нуклеотиды которой экспонированы в малую бороздку.
Соединение ШаЬс (рис. 1) по своей структурной организации очень напоминает «четырехходовые соединения» (от англ. four-way junction) [52], которые играют главную роль в самоорганизации третичной структуры таких молекул РНК, как, например, нуклеазные рибозимы (см., например, [53]). В работе [54] олигорибонуклеотид, моделирующий структуру соединения ШаЬс, закристаллизован в виде димера и использован для получения дифракционной карты с разрешением 2.8 А; полученные результаты представлены на рис. 10.
В общих чертах, соединение ШаЬс принимает Х-форму за счет находящихся в одной плоскости попарно расположенных один над другим стеблей. Стебель субдомена Шс находится в стэкинге с основной спиралью домена III (обозначаемой в дальнейшем как спираль III ), образуя стопку спиралей почти идеальной А-формы. Стебель субдомена Ша находится в стэкинге с субдоменом ШЬ. Эти две спиральные стопки, соединяются в параллельной ориентации с помощью «перемычки», состоящей из единичного фосфата, образуя структуру, представленную на рис. 10а. При этом неспаренные нуклеотиды А154, A155 и U228 оказываются в месте соединения субдоменов Ша и ШЬ, что приводит к некоторому искажению геометрии образующейся в результате стэкинга стопки спиралей.
Получение бинарных комплексов 40S рибосомных субчастиц с IRES ВГС и его фотоактивируемыми производными
Оказалось, что IRES ВГС способен связываться с 40S субчастицей рибосомы в отсутствие любого или даже сразу всех факторов инициации трансляции, тогда как р-глобиновая мРНК и IRES-элемент вируса энцефаломиокардита, относящийся к другому типу IRES, не связываются с 40S субчастицей в аналогичных условиях [55]. Как показали результаты тоупринтинга, это взаимодействие обеспечивается множеством контактов между IRES-элементом и 40S субчастицей. При этом кодирующая последовательность IRES ВГС в бинарном комплексе с 40S субчастицей фиксируется в мРНК-связывающем канале рибосомы, а инициаторный кодон оказывается в непосредственной близости к Р-участку [55]. Об этом же свидетельствуют данные недавно опубликованной работы [56], где с использованием бактериального токсина RelE, способного ращеплять мРНК в районе кодона, связанного в вакантном А-участке (в отсутствие тРНК), при условии ее корректного расположения на рибосоме, показано, что в бинарном комплексе с 40S субчастицей кодирующая часть IRES ВГС не занимает правильного положения. Помимо аутентичного инициаторного кодона, IRES ВГС имеет еще три AUG триплета, в том числе один триплет, абсолютно консервативный не только у разных штаммов IRES ВГС, но и у других подобных ему IRES-элементов (например, у IRES пестивирусов). Два дополнительных AUG триплета расположены в 5 -НТО в домене I с З -стороны (т.е. 5 -стороны с от IRES-элемента). Но ни один из этих пяти триплетов не используется рибосомой в качестве инициаторного кодона [57]. Рибосома не способна также узнавать триплет AUG, если он расположен всего на 7 нуклеотидов выше или на 8 нуклеотидов ниже положения природного инициаторного кодона [58]. Это означает, что 40S субчастица не сканирует мРНК в поисках инициаторного кодона, что является отличительной особенностью механизма IRES ВГС-зависимой инициации трансляции, который не требует присутствия фактора eIF4F или любой его субъединицы, а также eIF4B и гидролиза АТР. Показано также, что гидролиз eIF4F, вызванный вирусом полиомиелита, и мутации в eIF4A, инактивирущие его активность, не приводят к ингибированию IRES ВГС-зависимой инициации трансляции [55, 59]. Кроме того, имеются данные, свидетельствующие о том, что заключение инициаторного кодона в стабильную вторичную структуру или введение шпильки непосредственно перед ним приводит к ингибированию IRES-зависимой трансляции [60, 61]. Эти данные указывают на то, что факторы четвертой группы не участвуют в расплетении вторичной структуры РНК при образовании 48S предынициаторного комплекса.
То, что формирование бинарного комплекса является начальной стадией IRES ВГС-зависимой инициации трансляции, в дальнейшем было подтверждено в работе [62], где регистрировали образование различных инициаторных комплексов IRES-элемента в S10 лизате клеток HeLa в различные промежутки времени с помощью сахарозного градиента. В полученных профилях седиментации обнаружено три пика идентифицированных как 40S, 48S и 80S инициаторные комплексы, соотношение которых с течением времени менялось, - происходило постепенное уменьшение пика, соответствующего 40S комплексу, и увеличение пика, отнесенного к 80S комплексу.
Что касается фактора eIF3, то некоторое время существовали сомнения относительно порядка связывания этого фактора и IRES-элемента с 40S субчастицей перед присоединением к ней тройного комплекса MetPHK «elFl GTP, так как по данным [63, 64] eIF3 может непосредственно связываться с 40S субчастицей. Однако в работе [65] показано, что изолированный eIF3 (в отсутствие мРНК) не способен образовывать стабильный комплекс с 40S субчастицей, из чего следует, что IRES-элемент связывается с 40S субчастицей раньше, чем eIF3.
Следующий этап IRES-зависимой инициации трансляции у ВГС - это присоединение к бинарному комплексу фактора инициации eIF3 и тройного комплекса MetPHK et »eIF2»GTP, заканчивающееся формированием 48S предынициаторного комплекса с инициаторным кодоном в Р-участке. Оказалось, что тройной комплекс MetPHK »eIF2»GTP способен связываться с бинарным комплексом IRES«40S в отсутствие дополнительных факторов, в том числе и eIF3 [55]. Связывание eIF3 хотя и существенно не влияло на формирование 48S комплекса, но в отсутствие eIF3 выход пика, соответствующего 48S предынициаторному комплексу, при центриифугировании в сахарозном градиенте значительно уменьшался, что свидетельствует о возможном стабилизирующем влиянии eIF3 на этот комплекс. Тоупринтинг IRES ВГС, ассоциированного с 40S субчастицей и тройным комплексом, содержащим GMP-PNP вместо GTP, выявил остановки обратной транскриптазы на нуклеотидах ААА(357-359). Добавление фактора eIF3 или факторов 4 группы никак не влияло на интенсивность соответствующих сигналов, а удаление из реакционной смеси MetPHKf1" либо замена инициаторного AUG кодона на триплет AAG или GCG вело к исчезновению упомянутых остановок. Все эти результаты свидетельствуют о том, что остановки обратной транскрипции на нуклеотидах ААА(357-359) IRES ВГС происходили благодаря образованию стабильного 48S предынициаторрного комплекса с корректным кодон-антикодоновым взаимодействием в Р-участке. Таким образом, формирование 48S комплекса на IRES ВГС характеризуется сдвигом соответствующих сигналов тоупринтинга из положений С355 и U356, наблюдаемых в бинарном комплексе, в положения ААА(357-359). Интенсивность сигналов в последнем случае сильнее, чем в первом, что указывает на более жесткую фиксацию IRES в 48S комплексе. На основании этих данных авторы пришли к заключению, что образование 48S комплекса может индуцировать слабые изменения в расположении инициаторного кодона и кодирующей части ВГС на 40S субчастице по сравнению с их расположением в бинарном комплексе.
На эффективность образования 48S комплекса, по-видимому, не влияют факторы elFl и elFIA, поскольку присутствие этих факторов не изменяло выхода этого комплекса в случае IRES-элемента вируса классической лихорадки свиней (CSFV) [66], родственного IRES ВГС. В этой же работе [66] показано, что факторы elFl и elFIA способны вызывать некоторые изменения сингналов тоупринтов области инциаторного кодона IRES, что, как полагают авторы, свидетельствует о конформационных изменениях в 48S комплексе, индуцируемых этими факторами [66]. Однако в последующей работе этой же группы авторов высказана другая точка зрения относительно действия факторов elFl и elFIA [67]. Анализируя результаты своей предыдущей работы [66], они пришли к заключению, что эти факторы оказывают существенное дестабилизирующее влияние на 48S комплекс, образованный с участием IRES CSFV, приводя к понижению выхода элонгационно-компетентных 80S рибосм [67].
Получение ковалентных аддуктов 32Р-меченого IRES ВГС с производными олигодезоксирибонуклеотидов
Тоупринтинг IRES ВГС, лишенного части домена II, в составе бинарного комплекса с 40S субчастицей показал уменьшение интенсивности сигналов в районе инициаторного кодона и на нуклеотидах +15- +17 по сравнению с сигналами для полноразмерного IRES [55]. Это свидетельствует о более слабой фиксации в мРНК-связывающем участке 40S субчастицы кодирующей части мутантного IRES ВГС с нарушенным доменом II по сравнению с фиксацией этой части в полноразмерном IRES. Более того, в случае 48S комплекса, собранного на данном мутанте, наблюдали уменьшение интенсивности сигналов на нуклеотидах +15- +19, характерных для 48S комплекса, на основании чего сделан вывод, что делеция этой части домена II приводит к нарушению кодон антикодонового взаимодействия. Но это не согласуется с данными работы [69] по сшивкам Met-тРНК 1" с тиоуридин-содержащими РНК транскриптами, соответствующими полноразмернму IRES или его мутанту, не содержащему домена И, где выход продукта сшивки в обоих случаях одинаков. Наконец, с использованием IRES, содержащего остатки тиоуридина только в домене II, показано, что этот домен при УФ-облучении соответствующего 48S комплекса не образует сшивок с кодирующей частью.
По данным крио-ЭМ [8] домен II индуцирует конформационные изменения в 40S субчастице при образовании бинарного комплекса, при этом как в 40S, так и в 80S комплексе с 40S субчастицей контактирует апикальная часть домена II. О непосредственном взаимодействии домена II с 40S субчастицей свидетельствуют также работы по химическому и ферментативному футпринтингу [78, 81]. Так, защиты IRES от гидролиза РНказой ТІ в присутствии 40S субчастицы наблюдали в апикальной петле субдомена ПЬ (нуклеотид G82), а от разрезания иодином - на протяжении всего субдомена ИЬ [78]. Фингерпринтинг фрагментов IRES после гидролиза РНКазами в присутствии 40S субчастицы свидетельствует, что практически весь домен II защищен от гидролиза в бинарном комплексе, при этом среди защищаемых фрагментов наиболее часто встречается фрагмент, соответствующий участку с 59 по 70 нуклеотид. Однако с помощью этого же метода не обнаружено каких-либо защит в домене II в 48S и 80S комплексах.
Показано, что IRES-элемент, лишенный либо субдомена ИЬ, либо его апикальной или внутренней петли, либо внутренней петли субдомена Па, либо всего домена II не способен формировать 80S комплекс, инициация трансляции останавливается на стадии образования 48S комплекса [62, 69, 82]. Более детально роль домена II IRES ВГС в инициации трансляции изучена в работе [69], где 48S комплексы с полноразмерным IRES или его мутантом, лишенным домена II, полученные в ретикулоцитном лизате, выделяли аффинной хроматографией. Далее, добавляя к этим комплексам различные компоненты (факторы инициации трансляции, GTP или его негидролизуемый аналог), с помощью сахарозного градиента и последующего Вестерн-блотинга фракций следили за включением и/или высвобождением факторов инициации трансляции и гидролизом GTP в процессе образования 80S комплекса. В результате показано, что удаление домена II не влияет на степень связывания факторов eIF2, eIF3 и eIF5, но существенно препятствует диссоциации eIF2 из 48S комплекса. Так, количество диссоциировавшего eIF2 для IRES с делетированным доменом II было в пять раз ниже, чем для полноразмерного IRES, при этом диссоцииация eIF3 практически не зависела от присутствия домена II в IRES. В этой же работе проверяли эффект удаления домена II на степень гидролиза GTP. Для этого 48S комплексы инкубировали с фактором eIF5 и Р-меченым GTP и затем измеряли количество образовавшегося неорганического фосфата. Оказалось, что удаление домена II приводит к уменьшению эффективности гидролиза GTP в два раза по сравнению с гидролизом в случае полноразмерного IRES. На основании этих данных сделан вывод, что домен II стимулирует е1Р5-зависимый гидролиз GTP и последующее высвобождение eIF2/GDP из 48S комплекса. Предполагают, что такое стимулирующее влияние домена II обусловлено конформационными изменениями в 40S субчастице, вызванными связыванием с IRES [8].
Индуцированный доменом II способ высвобождения фактора eIF2 явно отличается от способа, характерного для канонической инициации трансляции, когда кодон-антикодоновое взаимодействие в Р-участке ведет к диссоциации eIF2 и образованию 80S комплекса, при этом факторы elFl и elFIA способствуют поиску инициаторного кодона во время сканирования мРНК, а фактор elFl участвует также в ингибировании преждевременной диссоциации eIF2/GDP. Фактор elFl при канонической инициации, как и домен III IRES ВГС, связывается в районе платформы 40S субчастицы и, как предполагают авторы [69], индуцирует в ней такие же конформационные изменения, как и домен III. Возможно, домен III IRES аналогично фактору elFl препятствует диссоциации eIF2/GDP, но elFl после образования 48S комплекса с кодон-антикодоновоым взаимодействием в Р-участке фактор диссоциирует из комплекса, тогда как домен III остается в комплексе, являясь частью мРНК. По-видимому, для «противодействия» эффекту домена III необходим домен II, стимулирующий гидролиз GTP и диссоциацию eIF2/GDP после связывания инициаторной тРНК в Р-участке. Аналогичные исследования были проведены с мутантными формами IRES, несущими делеции в различных участках домена II, нарушающие его структуру, а именно в районе апикальной и внутренней петель субдомена ПЬ и в районе внутренней петли субдомена Па. Результаты этих исследований показали, что любое нарушение струтуры домена II оказывает такое же влияние на эффективность диссоциации eIF2 и на степень гидролиза GTP, как и удаление всего домена П.
В работах [83, 88] установлено, что третичная структура домена II более важна для функционирования IRES ВГС, чем его нуклеотидная последовательность. В одной из этих работ проведено исследование влияния мутаций в районах внутренних и апикальной петель домена II, а также в спиральном участке вблизи апикальной петли [83], вызывавших нарушение его пространственной структуры. Оказалось, что все эти делеции, приводили либо к уменьшению (до 20-30%), либо к полной потере трансляционной активности IRES [83]. В работе [88] подробно изучали влияние разного рода мутаций в субдомене ПЬ на трансляционную активность IRES ВГС; показано, что вставки и делеции в районе этого субдомена существенно ингибируют трансляцию. Что касается роли консервативных нуклеотидов в домене II IRES, то, как выяснилось, их влияние на трансляционную активность IRES ВГС несущественно. Так, замены консервативных нуклеотидов А81, С83, С84 (апикальная петля) и А93, А96 (внутренняя петля) вели лишь к незначительному уменьшению трансляционной активности. Но в то же время, замены нуклеотидов U80 и А85 сильно ингибировали трансляцию, при этом компенсаторные мутации не восстанавливали трансляционной активности. Интересно, что эти нуклеотиды не защищены в комплексе с 40S субчастицей по данным химического и ферментативного футпринтинга [78]. Таким образом, можно заключить, что, кроме вторичной структуры, для функционирования домена II важны также некоторые отдельные нуклеотиды апикальной петли, хотя целостность всех консервативных нуклеотидов домена II необязательна.
