Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1 Структура транскетолазы 12
1.1 Сравнение структур апо-и холотранскетолазы 14
1.2 Структура активного центра транскетолазы 17
1.2.1 Связывание двухвалентных катионов 17
1.2.2 Структура кофермент-связывающего участка активного центра транскетолазы 17
1.2.3 Протонный канал 21
1.2.4 Субстратный канал 22
1.2.5 Интермедиат транскетолазной реакции 25
2 Механизм транскетолазной реакции 27
3 Взаимодействие кофермента с апотранскетолазой 31
4 Участие двухвалентных катионов в связывании тиаминдифосфата апотранскетолазой 38
5 Функциональная неэквивалентность активных центров транскетолазы 40
5.1 Неэквивалентность по связыванию кофермента 40
5.2 Неидентичность активных центров при химической модификации аминокислотных остатков 41
6 Оптические свойства транскетолазы 44
Экспериментальная часть 47
1 Материалы 47
2 Методы 47
2.1 Выделение транскетолазы 47
2.2 Определение концентрации транскетолазы 48
2.3 Определение концентрации тиаминдифосфата и его аналогов 48
2.4 Определение активности транскетолазы 48
2.4.1 С использованием глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы в качестве вспомогательного фермента 48
2.4.2 По скорости окисления а-карбанионного интермедиата в присутствии феррицианида 49
2.5 Определение концентрации ксилулозо-5-фосфата 50
2.6 Определение концентрации рибозо-5-фосфата 51
2.7 Определение IQ для тиаминдифосфата 51
2.8 Исследование кинетики диссоциации тиаминдифосфата из активных центров холотранскетолазы 52
2.9 Разностные спектры поглощения транскетолазы 54
2.10 Спектрофотометрическое титрование 54
2.11 Расчет Kd для тиаминдифосфата по результатам спектрофотометрического титрования 57
2.12 Stopped flow кинетика связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой 58
2.13 Спектры кругового дихроизма 58
2.14 Триптофановая флуоресценция 58
2.15 Дифференциальная сканирующая калориметрия 59
2.16 Кинетика термоденатурации 59
Результаты и обсуждение 61
1 Влияние субстратов на реконструкцию холотранскетолазы из апо- и кофермента 61
1.1 Разностные спектры поглощения холотранскетолазы 61
1.2 Влияние субстрата-донора на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Са2+ 63
1.3 Влияние субстрата-донора на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Mg 65
1.3.1 Влияние необратимо расщепляемого субстрата-донора на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Mg2+... 66
1.3.2 Влияние обратимо расщепляемых субстратов-доноров на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Mg2+ 68
1.4 Реконструкция холотранскетолазы в присутствии Mg2+ и субстрата-акцептора 72
1.5 Взаимодействие апотранскетолазы с неактивным аналогом тиаминдифосфата - N3'-пиридил-тиаминдифосфатом 75
1.6 Исследование влияния субстрата-донора на постадийное взаимодействие апотранскетолазы с тиаминдифосфатом 80
1.6.1 Влияние субстрата-донора на процесс ассоциации тиаминдифосфата с активными центрами транскетолазы в присутствии Са2+ 81
1.6.2 Влияние субстрата-донора на процесс ассоциации тиаминдифосфата с активными центрами транскетолазы в присутствии Mg2+ 86
1.6.3 Влияние субстратов-доноров на кинетику диссоциации тиаминдифосфата из активных центров холотранскетолазы.. 91
2 Атипичные субстраты-доноры транскетолазы 97
3 Влияние кофакторов транскетолазы на ее конформацию и стабильность 108
3.1 Влияние двухвалентных катионов на спектры кругового дихроизма транскетолазы в дальнем ультрафиолете 109
3.2 Влияние кофакторов транскетолазы на ее стабильность 112
3.3 Исследование стабильности холоТК, в зависимости от типа катиона в ее составе (Са2* или Mg24"), методом триптофановой флуоресценции в присутствии мочевины 115
Заключение 121
Выводы 124
Список литературы 125
- Сравнение структур апо-и холотранскетолазы
- Неидентичность активных центров при химической модификации аминокислотных остатков
- Спектрофотометрическое титрование
- Влияние обратимо расщепляемых субстратов-доноров на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Mg2+
Введение к работе
Транскетолаза (седогептулозо-7-фосфат: D-глицеральдегид-З-фосфат гликольальдегидтрансфераза, КФ 2.2.1.1), это тиаминдифосфат-зависимый фермент, который на протяжении последних лет является объектом интенсивного изучения. ТК катализирует одну из ключевых реакций пентозофосфатного пути превращения углеводов: реакцию расщепления кетосахаров (субстратов-доноров) по С-С связи, соседней с кетогруппой, и последующий перенос двууглеродного фрагмента на альдозу (субстрат-акцептор).
СН2ОН С=0
носн
неон
неон
R'
неон
СН2ОН
с=о + носн
неон
R'
Функцию субстрата-донора выполняют кетозы, у которых гидроксильные группы при СЗ и С4 атомах находятся в трансположении: ксилулозо-5-фосфат, фруктозо-6-фосфат, седогептулозо-7-фосфат, эритрулоза и др. Трехуглеродные субстраты-доноры -гидрокси пиру ват и дигидроксиацетон, не имеющие асимметрических атомов углерода, представляют собою исключение. Субстратами-акцепторами транскетолазы являются - рибозо-5-фосфат, эритрозо-4-фосфат, фосфоглицериновый альдегид, гликольальдегид и др. Фермент
мало специфичен по отношению к длине углеродной цепочки, однако
наличие фосфатной группы в молекуле субстрата существенно
повышает его сродство к ферменту [1]. Трапскетолазная реакция
обратима, за исключением случая, когда в качестве субстрата-донора
выступает гидрокси пиру ват, который подвергается
декарбоксилированию и процесс становится необратимым.
Кофакторами ТК являются ионы двухвалентных металлов и ТДФ. На сегодняшний день наиболее полно исследованы свойства транскетолазы пекарских дрожжей. Фермент состоит из двух идентичных субъединиц и имеет два активных центра, расположенных на границе между контактирующими поверхностями мономеров. Молекулярная масса фермента составляет 148,4 кДа [2-5]. Активные центры характеризуются одинаковой ферментативной активностью [6-8].
Определен аминокислотный состав и пространственная структура ТК [9-11]. Методами химической модификации [12-18], рентгеноструктурного анализа [2, 19-23] и направленного мутагенеза [24-28] идентифицированы аминокислотные остатки, необходимые для связывания ТДФ, субстратов и собственно катализа. Имеется довольно подробная информация об оптических свойствах фермента и их изменениях при связывании с транскетолазой различных лигандов [1, 29-40]. Показано различное влияние ионов двухвалентных металлов на взаимодействие апотранскетолазы с тиаминдифосфатом. В присутствии ионов кальция фермент характеризуется отрицательной кооперативностью и высоким сродством к тиаминдифосфату [41-46]. В присутствии ионов магния неэквивалентность активных центров
отсутствует, или слабо выражена; при этом понижается и общее сродство фермента к ТДФ [41, 42, 45, 46].
При добавлении к холоТК субстрата-донора (рис. 1А) происходит образование промежуточного, достаточно стабильного, в отсутствие субстрата-акцептора, продукта транскетолазной реакции -а-карбаниона ДОЭТДФ (рис 1Б). К настоящему времени сделан рентгеноструктурный анализ комплекса ТК с ДОЭТДФ [47]. Согласно этим данным, ДОЭТДФ образует дополнительные, по сравнению с ТДФ, связи с аминокислотными остатками в активном центре фермента и имеет, поэтому, более высокое сродство к апобелку, чем кофермент [42,48, 49].
ТК была первым ТДФ-зависимым ферментом, для которого в 1992 г. был сделан РСА. Естественно поэтому, что все последующие годы основное внимание было обращено на изучение структуры данного фермента: аминокислотных остатков, участвующих в связывании кофакторов и субстратов, функциональных групп, целостность которых необходима для катализа, структуры активного центра, и совсем мало внимания уделялось вопросам функционирования ТК (в широком смысле этого слова), понимая под этим, в частности, изменение конформации (функциональная подвижность) молекулы фермента в результате его взаимодействия с кофакторами и субстратами. В связи с этим, нашей задачей было исследование влияния кофакторов (ТДФ и двухвалентных катионов) на конформацию и стабильность ТК, а также влияния субстратов и природы двухвалентных катионов на взаимодействие кофермента с апоТК и образование каталитически активного холофермента.
CH2OH
сі-ьон
сн2он
с=о
но-с-н
н-с-он
с=о
сн2он
Дигидроксиацетон
с=о
но-с
II о
Гидроксипируват HOHC-0-Qp)
Ксилулозо-5-фосфат
N^S^CH^ft сн 0 0
0с-он I
СН2ОН
Рис. 1. А - структура некоторых субстратов-доЕюров транскетолазы;
Б - структура а-карбаниона дигдироксиэтил-тиаминдифосфата
Сравнение структур апо-и холотранскетолазы
Тиазоловое кольцо ТДФ взаимодействует с остатками обеих субъединиц, в основном, за счет гидрофобных контактов с остатками Leu383 и Пе191. Участвует в гидрофобных взаимодействиях метильная группа тиазолового кольца. У деметилированного аналога ТДФ (4-нор ТДФ) сродство к белку понижено в тридцать раз по сравнению с ТДФ, а каталитическая активность вообще отсутствовала [65]. Важную роль играет консервативный остаток Asp382, который, за счет своего отрицательного заряда, нейтрализует положительный заряд тиазолового кольца (рис. 4).
Пирофосфатиая группа кофермента связана с РР-доменом одной из субъединиц, как непосредственно, при участии остатков His69, His263, Glyl58 Cys159, так и опосредовано, при участие иона двухвалентного металла. Пирофосфатиая группа вносит существенный вклад в прочность связывания кофермента с апобелком, выполняя роль «якоря»: тиамин и тиаминмонофосфат — соответственно, нефосфорилированный и монофосфорилированный аналоги ТДФ, характеризуются очень низким сродством к апоТК [66].
Тиаминдифосфат находится глубоко внутри кофермент-связывающего участка, и только С2-атом тиазолового кольца (с которым, в процессе катализа, связывается субстрат-донор) доступен растворителю. Подвижные петли в активном центре ТК, о которых говорилось выше (аминокислотные остатки 187-198 и 383-393), обеспечивают удержание ТДФ в коэнзим-связывающем участке (рис.3) [20]. Сравнение кристаллических структур многих ТДФ-зависимых ферментов, показало, что имеется значительное сходство их коферментсвязывающих участков [66].
Молекулы ТДФ расположены в активных центрах ТК на расстоянии 19 А. Между ними находятся консервативные остатки глутаминовой кислоты, со связанными молекулами воды, которые образуют протонный канал. Помимо этого, образовавшаяся сеть из водородных связей прочно связывает две субъединицы в зоне контакта. В сеть вовлечены G]u418, Glul62 и Glul67 как одной, так и другой субъединицы. Эти остатки расположены асимметрично относительно друг друга и таким образом, что каждая молекула ТДФ в активном центре сближена со своим остатком Glu418, который находится в непосредственной близости от N1 -атома аминопиримидинового кольца. В процессе катализа остаток Glu418 способен отдавать протон N1 -атому аминопиримидинового кольца, обеспечивая, таким образом, первую стадию тиаминового катализа, т.е. депротонирование С2-атома тиазолового кольца [67-70].
Образование сети водородных связей между остатками глутаминовой кислоты двух субъединиц необходимо для формирования и стабилизации димера ТК. Например, замена Glul62 в одной из субъединиц на аланин или глутамин, приводит к невозможности образования водородных связей с участием Glu418 и Glul67 второй субъединицы, в результате чего наблюдается значительная дестабилизация димера [27]. Предполагалось также, что благодаря протонному каналу может осуществляться перемещение протонов между двумя активными центрами, в результате чего состояние одной молекулы ТДФ может влиять на состояние другой [3].
Наличие протонного канала характерно и для ПДГ - еще одного ТДФ-зависимого фермента. Как предполагают авторы, протонный канал обеспечивает противофазную работу активных центров данного фермента [69] за счет поочередного протонирования или депротонирования Nl -атома аминопиримидинового кольца кофермента.
Анализ пространственной структуры ТК показал, что субстрат встраивается в глубокий узкий канал, ведущий от поверхности белка к С2-атому тиазолового кольца ТДФ [3, 28]. Канал настолько узок, что нахождение в нем одновременно и субстрата-донора, и субстрата-акцептора невозможно. Субстраты (донор и акцептор) подходят к активному центру поочередно в соответствии с кинетическим механизмом "пинг-понг".
Фосфатная группа субстратов взаимодействует с остатками Arg359 , Arg528 , His469 и Ser386 (рис. 5), причем Arg528 . Ser386 и His469 образуют водородные связи с атомами кислорода фосфатной группы субстрата, a Arg359 - ионную связь [28]. Исследование фосфорилированных и нефосфорилированных субстратов показало, что наличие фосфатной группы у субстрата снижает на порядок значение его Кт и совершенно не сказывается на активности [1]. Остатки His69 и His 103 образуют водородные связи с гидроксильной группой С1-атома субстрата-донора (рис. 5). Мутация ТК по His69 и His30 не приводит к изменению Кт для субстратов-акцепторов, но значительно повышает Кт для субстрата-донора -К-5-Ф, и резко снижает активность фермента [27]. Еще одна ионная связь образуется при взаимодействии ОН-группы, находящейся при СЗ-атоме субстрата, с остатком Asp477. Это взаимодействие определяет стереоспецифичность субстратов-доноров (ОН-группы при третьем и четвертом атомах углерода молекулы субстрата должны находиться в транс-положении). Кроме того, Asp477 играет важную роль в узнавании и ориентации субстрата-акцептора/Важную роль в распознавании субстратов играют также His30 и His263, которые образуют водородные связи с гидроксильной группой при СЗ-атоме субстрата-акцептора [28].
Известно, что гидроксипируват может выполнять функцию субстрата-донора ТК, в то же время фермент не может осуществлять превращение пирувата. Последнее обусловлено отсутствием у пирувата при СЗ-атоме гидроксильной группы. Отсюда следует, что наличие гидроксильной группы при С1-атоме у кетосахара и возможность образования водородных связей этой группы с остатками гистидина (His 69, His 103) обусловливает субстратную специфичность ТК [25, 71, 72].
Неидентичность активных центров при химической модификации аминокислотных остатков
В процессе проведения химической модификации функционально важных остатков гистидина, тирозина и карбоксильных групп в молекуле ТК, кривые инактивации были двухфазны, что отражало различную скорость их модификации в двух активных центрах [85-89]. Доказательство неэквивалентности активных центров было получено и при исследовании процесса инактивации фермента тетранитрометаном в присутствии субстрата-донора (рис. 9).
Оказалось, что холо- и "полу-холо ТК (т.е. ТК, содержащая кофермент лишь в одном из активных центров) инактивируются с одинаковой скоростью, значительно меньшей, чем скорость инактивации апофермента (ср. кривые I и II). В присутствии кетозы (субстрат-донор) скорость инактивации холоТК (кривая III) и "полухоло" ТК (кривая I) повышалась в равной степени и становилась равной скорости инактивации апоТК (кривая I). Разница заключалась лишь в том, что в экспериментах холоТК + фруктозо-б-фосфат степень инактивации не превышала 50%. Таким образом, кетоза повышает скорость инактивации одного активного центра и полностью предохраняет от инактивации другой [86].
Так как начальная фаза кривой инактивации холоТК в присутствии субстрата совпадает с аналогичной кривой инактивации "полу-холо ТК (ср. кривые I и II), можно заключить, что тот активный центр, скорость инактивации которого повышается, содержит субстрат.
Учитывая то, что активные центры холоТК характеризуются одинаковой каталитической активностью, т.е. активность холоТК в 2 раза выше, чем активность "полу-холо ТК [7, 90], можно говорить о том, что субстрат содержится и в первом активном центре, и во втором (который в присутствии субстрата не теряет свою каталитическую активность), но, возможно, в различных состояниях - расщепленном и нерасщепленном. В таком случае, активные центры работают одновременно, но в противофазе, т.е. когда в одном из них кетоза расщепляется (начальная стадия транскетолазнои реакции), в другом она образуется (в результате осуществляется следующая стадия транскетолазнои реакции - конденсация активного гликольальдегида с субстратом-акцептором) [89].
Функциональная неэквивалентность активных центров характерна не только для ТК. Например, субстрат 6 фосфоглюконатдегидрогеназы способен индуцировать конформационные изменения фермента таким образом, что последующее связывание аналога кофермента возможно только в одном активном центре, причем конформационные изменения затрагивают весь энзим и при этом связывание носит необратимый характер [91].
Взаимодействие ТДФ с апоТК и образование каталитически активного холофермента сопровождается появлением, как в спектрах поглощения, так и КД, новой полосы с максимумом, соответственно, при 310 [33] нм (рис. 10А) и 320 нм (рис. 10Б) [30]. Появление этой полосы характеризует формирование активного центра и образование каталитически активного холофермента. Имеется четкая линейная зависимость между амплитудой полосы поглощения и количеством реконструированного, каталитически активного холофермента [80].
Первоначально полагали, что причиной ее появления является образование комплекса с переносом заряда между коферментом и остатком триптофана апоТК [92]. Такое предположение было основано на том, что аналогичные холоТК спектральные изменения - появление новой полосы в спектре поглощения с диффузным максимумом и длинным "хвостом", простирающимся в видимую область спектра, были получены в модельной системе при взаимодействии ТДФ с триптофаном и его аналогами, но не с другими аминокислотами. Следует отметить, что характер этой полосы является одним из признаков образования комплекса с переносом заряда.
После появления в печати данных рентгеноструктурного анализа, участие индолильной группы остатка триптофана в образовании КПЗ стало подвергаться сомнению, так как в активном центре фермента остатка триптофана, расположенного в достаточной близости от связанного кофермента, обнаружено не было [3]. Тогда роль триптофана в образовании КПЗ стали приписывать Phe445, который находится в активном центре холоТК в непосредственной близости от аминопиримидинового кольца ТДФ. Оказалось, однако, что мутантная форма ТК, у которой фенилаланин был заменен на изолейцин, не потеряла каталитическую активность. Сохранялась и индуцированная полоса поглощения, хотя интенсивность ее уменьшилась в 5 раз [93].
Рассматривалась и такая возможность. Как уже упоминалось выше, встраивание ТДФ в активный центр ТК, сопровождающееся конформационными перестройками молекулы белка, приводит к стабилизации двух петель, расположенных хаотично в апоТК и строго организованных в холоферменте. В результате происходит сближение остатка Тгр391 одной петли и остатка Туг370 - другой, причем их ароматические кольца оказываются параллельными друг другу. На основании этого факта было высказано предположение, что индуцированные тиаминдифосфатом изменения в спектре холоТК обусловлены стэкинг взаимодействием ароматических колец указанных аминокислотных остатков. Однако, и это предположение не получило экспериментального подтверждения [94].
В настоящее время показано, что причиной возникновения новой полосы в спектре поглощения и КД, при связывании тиаминдифосфата с апотранскетолазой и образовании каталитически активного холофермента, является изменение оптических свойств самого кофермента при попадании его в гидрофобное окружение активного центра фермента. При этом, аминоформа аминопиримидинового кольца ТДФ превращается в имино-таутомерную форму, которая стабилизируется путем протонирования N1 -атома аминопиримидинового кольца ТДФ за счет Glu418 и стэкинг взаимодействия с остатком Phe445 [40].
Спектрофотометрическое титрование
Спектр апоТК (3,6 мкМ) в 50 мМ глицил-глициновом буфере, рН 7,6, в присутствии 2,5 мМ СаСЬ снимали на спектрофотометре AMINCO DW 2000 (США), в кювете с длиной оптического пути 1см. В ту же кювету добавляли ТДФ или его неактивный аналог в насыщающей концентрации и снимали спектр повторно. Для регистрации спектра холоТК в присутствии гидроксипирувата к раствору холофермента добавляли 2,5 мМ гидроксипируват. Отдельно были сняты спектры ТДФ, его аналогов и гидроксипирувата в тех же условиях. Разностные спектры получали вычитанием спектров апотранскетолазы и ТДФ (или, соответственно, аналога ТДФ) из спектра холоТК, или вычитанием спектров апоТК, ТДФ и гидроксипирувата из спектра холоТК в присутствии субстрата.
Связывание ТДФ и его неактивного аналога - Ш -пиридил-ТДФ, с ТК регистрировали методом спектрофотометрического титрования. При низкой концентрации ТДФ, его взаимодействие с апоТК протекает достаточно медленно, что позволяет следить за ходом реакции в процессе инкубации апофермента с ТДФ. При связывании апоТК с ТДФ (см. «Обзор литературы», раздел 6) в спектре поглощения появляется новая полоса в районе 290-340 нм, которая отсутствовала у исходных компонентов. Ее интенсивность прямо пропорциональна доле реконструированного, каталитически активного холофермента. Мы регистрировали не только стационарный уровень интенсивности поглощения для каждой из используемых концентраций кофермента, но и предстационарный быстрый рост его интенсивности с первых же секунд после добавления ТДФ (рис. 11). За ходом реконструкции холоТК следили по изменению оптической плотности при 320 нм в двуволновом режиме (A-i=320 нм, А.2=360 нм), на спектрофотометре AMINCO DW 2000.
При связывании апоТК с № -пиридил-ТДФ, в спектре поглощения появляется новая полоса с максимумом при 345 нм, которая отсутствовала у исходных компонентов. Таким образом, как и в опытах с ТДФ, была возможность исследовать взаимодействие апоТК с аналогом методом спектрофотометрического титрования. За ходом реконструкции комплекса № -пиридил-ТДФ-ТК следили по изменению оптической плотности при 345 нм в двуволновом режиме (Хі=345 нм, =420 нм).
Опыты проводили в кинетическом режиме следующим образом: вначале прописывали исходный уровень оптической плотности апоТК при 320 нм (в случае ТДФ), или при 345 нм (в случае Ш -пиридил-ТДФ) в течение 0,5-1 мин. Затем, приоткрыв окошко крышки кюветного отделения, быстро вносили и перемешивали первую порцию ТДФ или его аналога. При этом продолжалась запись кинетики, которая шла до тех пор, пока не прекращалось изменение оптической плотности, вызванное добавлением кофермента или его аналога. Далее записывали, в течение 0,5-1 мин, конечный ее уровень после первой добавки, после чего вносили следующую порцию кофермента, или N3 -пиридил-ТДФ, и т.д., до тех пор, пока оптическая плотность раствора белка не переставала изменяться после очередной добавки (рис.11). Субстрат-донор, двухвалентный металл и пирофосфат натрия (в тех опытах, где это было необходимо) добавляли к раствору белка перед началом опыта. Конечные концентрации компонентов в опытах с ТДФ: 50 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6; 2,5 мМ СаСЬ или MgC ; 4,5 мкМ ТК; концентрацию ТДФ повышали от 0 до 63,39 мкМ - в присутствии СаС12, или от 0 до 1 мМ - в присутствии MgC . Чтобы исследовать связывание апоТК с ЫЗ -пиридил-ТДФ и влияние субстрата-донора на этот процесс, было необходимо понизить высокое сродство аналога к ферменту, для чего добавляли пирофосфат натрия, который является конкурентным, по отношению к ТДФ, ингибитором ТК [105]. Концентрацию пирофосфата подбирали следующим образом. К раствору апоТК в присутствии MgC добавляли увеличивающиеся концентрации пирофосфата, и одну и ту же (1,4 мкМ) концентрацию аналога, регистрируя изменение оптической плотности при 345 нм. Внесение 20 мМ пирофосфата оказалось достаточным, чтобы снизить количество образующегося комплекса ТК-Ю -пиридил-ТДФ, и иметь возможность оценить влияние субстрата на процесс его образования. Конечные концентрации компонентов в опытах с Ш -пиридил-ТДФ: 50 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6; 2,5 мМ MgCb; 6,34 мкМ ТК; 20 мМ пирофосфат натрия; 0-30 мкМ ЫЗ -пиридил-ТДФ. При исследовании влияния субстрата-донора на реконструкцию, перед добавлением кофермента или Ш -пиридил-ТДФ в кювету вносили, в насыщающих концентрациях, субстрат.
Влияние обратимо расщепляемых субстратов-доноров на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Mg2+
Итак, конформация апоТК в присутствии Mg отличается от ее конформации в присутствии Са . По крайней мере, в той ее части, которая касается вторичной структуры, если судить по результатам, полученным при изучении спектров КД фермента в дальнем УФ. Связывание ТДФ с апобелком не сопровождается изменением вторичной структуры; на это указывает отсутствие изменений спектра КД. В то же время, ТДФ существенно стабилизирует апоТК, что соответствует данным пертурбационной спектрофотометрии [35], указывающим на более компактную, по сравнению с апоТК, структуру холофермента. Об этом же свидетельствуют и результаты рентгеноструктурных исследований, согласно которым структуры апо-и холоТК различаются положением двух петель в соответствующих субъединицах фермента (остатки 187-198 и 383-394). Эти петли относительно подвижны в апоТК и структурированы - в холоТК [2, 3].
Стабилизирующий структуру ТЬС эффект кофермента выражен в значительно большей степени в присутствии Са2+, чем в присутствии Mg2+. Как известно из данных рентгеноструктурного анализа, Me + является связующим звеном между апоТК и молекулой ТДФ [2, 3]. Катион, с одной стороны, взаимодействет с дифосфатной группой молекулы кофермента, а с другой - с аминокислотными остатками подвижных петель молекулы белка. Таким образом, Ме2+ участвует в создании правильной взаимной ориентации ТДФ и контактирующего с ним участка белковой молекулы. Mg +, выступая в роли кофактора ТК, образует те же, по типу, связи с белком и ТДФ, что и Са2+. Однако, эти связи являются более слабыми и неустойчивыми, что, в конечном счете, возможно, отражается на локальной конформации кофермент связывающего участка молекулы белка.
В настоящее время РСА сделан только для холоТК в присутствии Са . Соответствующих данных для холоТК, реконструированной в присутствии Mg2+, пока нет. Поэтому сопоставить структурные характеристики этих двух форм холофермента не представляется возможным. Тем не менее,- ряд данных, как показано в данной работе и литературе, указывали на то, что структуры холоформ ТК, содержащих в своем составе, соответственно, Са2+ или Mg2+, не идентичны. Прямым доказательством этому являются результаты экспериментов, приведенные в данном разделе. Итак, субстрат-донор повышает сродство апотранскетолазы к тиаминдифосфату, как в присутствии ионов кальция, так и в присутствии ионов магния. Во втором случае, в отсутствие субстрата, сродство обоих активных центров к коферменту одинаково. Необратимо расщепляемый субстрат-донор — гидроксипируват, в присутствии ионов магния, повышает сродство тиаминдифосфата к транскетолазе, в разной степени по отношению к первому и второму активным центрам. Отсюда следует, что исходно эквивалентные по связыванию тиаминдифосфата активные центры транскетолазы становятся неэквивалентными при реконструкции холофермента, осуществляемого в присутствии субстрата-донора. Обратимо расщепляемые субстраты-доноры повышают сродство тиаминдифосфата к апотранскетолазе только в одном из активных центров, что также приводит в результате к появлению неэквивалентности активных центров по связыванию кофермента.
Повышение сродства тиаминдифосфата к транскетолазе в присутствии субстратов-доноров и появление кооперативности активных центров при наличие в среде ионов магния, может быть одним из возможных механизмов регуляции фермента субстратом.
На основании того, что субстраты-доноры повышают сродство тиаминдифосфата к апотранскетолазе, а субстраты-акцепторы такой способностью не обладают, было сделано предположение, что в основе механизма влияния субстрата-донора на сродство активных центров фермента к тиаминдифосфату лежит образование, в результате первого акта катализа, интермедиата транскетолазной реакции — дигидроксиэтилтиаминдифосфата. Эта гипотеза нашла подтверждение в опытах с неактивным аналогом кофермента — Ш -пиридил-тиаминдифосфатом, комплекс которого с ферментом каталитической активностью не обладает и интермедиат транскетолазной реакции по этой причине образовываться не может. Действительно, было показано что гидроксипируват (субстрат-до нор) не влияет на сродство неактивного аналога к ферменту.
Принимая во внимание двустадийный механизм взаимодействия тиаминдифосфата с апотранскетолазой, мы детально исследовали влияние субстрата-донора на каждую из его стадий. Образование неактивного и легкодиссоциирующего комплекса фермента с тиаминдифосфатом (ТК"ТДФ на схеме 1) не зависит от присутствия субстратов, также, как и последующая стадия медленного конформационного перехода в каталитически активный холофермент (ТК -ТДФ на схеме 1). Субстрат-донор, как в присутствии ионов кальция, так и в присутствии ионов магния, влияет на процесс, связанный с обратным конформационным переходом из каталитически активной формы транскетолазы в неактивный комплекс фермента с тиаминдифосфатом. Показано, что в присутствии субстрата-донора скорость диссоциации кофермента из активных центров холотранскетолазы значительно снижена, по сравнению с опытами в которых субстрат добавлен не был. Кинетика диссоциации тиаминдифосфата в присутствии субстрата-донора не зависит от типа катиона в составе холотранскетолазы.
Помимо обычных кетоз в качестве субстрата-донора транскетолазной реакции могут выступать галогенированные по третьему атому углерода производные пирувата. Свойства этих субстратов сильно зависят от того, какой галоген введен в молекулу пирувата. Галогенированные субстраты не индуцируют неэквивалентность активных центров транскетолазы по связыванию тиаминдифосфата в присутствии ионов магния, однако в случае бромпирувата наблюдается увеличение сродства тиаминдифосфата к ферменту.
Различные свойства холотранскетолазы, реконструированной в присутствии ионов магния или кальция, объясняются различной конформацией реконструированного холофермента. Показано, что при встраивании катиона в молекулу апотранскетолазы происходит изменение ее вторичной структуры. Последующее добавление кофермента не сказывается серьезным образом на вторичной структуре фермента, однако существенного его стабилизирует.
