Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Основные теории старения 9
1.2.Посттрансляционные модификации белков 15
1.2.1. Молекулярные механизмы дезамидирования 17
1.2.2. Возможные пути окислительной модификации белков 21
1.2.3. Роль неферментативного дезамидирования и других посттрансляционных модификаций в процессах старения белков 26
1.3. Старение и интенсивность обновления белков в клетке 33
1.4. Типы клеток тканей позвоночных и процессы старения 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Материалы исследования и постановка эксперимента 39
2.2. Методы исследования 40
2.2.1. Выделение и очистка тканевых белков 40
2.2.2. Выделение и хроматографическая очистка препаратов сывороточного альбумина 42
2.2.3. Определение содержания белка методом Lowry (1951) в модификации Schaterle(1973) 46
2.2.4. Окислительная модификация сывороточного альбумина в среде Фентона (Дубинина Е.Е., 2000) 46
2.2.5. Определение содержания амидных групп белков флуорометрическим методом (Sugawara К., 1981) в модификации (Шепотиновская И.В., 1995) 47
2.2.6. Определение сульфгидрильных групп в белках колориметрическим методом при помощи 5,5 -дитиобис(2-нитробензойной) кислоты (ДТНБК) (Веревкина И.В., 1977) 47
2.2.7. Определение содержания карбонильных групп белков спектро-фотометрическим динитрофенилгидразиновым методом (Дубинина Е.Е., 1995) 48
2.2.8. Определение образования битирозина и окисления триптофана в белках, инкубированных в среде Фентона (Дубинина Е.Е., 2000) 49
2.2.9. Исследование собственной флуоресценции белков препарата альбумина 49
2.2.10. Электрофорез препаратов альбумина после инкубации в среде Фентона (Laemmli, 1970) 50
2.3. Статистическая обработка результатов исследования 50
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 52
3.1. Возрастные изменения содержания амидных, сульфгидрильных и карбонильных групп в суммарных белках разных тканей белых крыс 52
3.1.1. Изменение содержания амидных групп суммарных белков тканей белых крыс при старении 52
3.1.2. Изменение содержания SH-групп в суммарных белках различных тканей крыс при их физиологическом старении 65
3.1.3. Карбонилирование суммарных белков различных тканей крыс при их физиологическом старении 73
3.2. Изменения амидированности и окислительных модификаций сывороточного альбумина старых крыс 84
3.2.1. Выделение и очистка сывороточного альбумина крыс 84
3.2.2. Амидированность сывороточного альбумина молодых и старых крыс 86
3.2.3. Окислительные модификации сывороточного альбумина крыс 89
3.3. Окислительные модификации и амидированность сывороточного альбумина при его инкубации в среде Фентона 98
3.3.1. Окислительные модификации сывороточного альбумина при его инкубации в среде Фентона 98
3.3.2. Изучение амидированности сывороточного альбумина, инкубированного в среде Фентона 105
3.3.3. Конформационные изменения сывороточного альбумина при его инкубации в среде Фентона 109
3.4. Изменение амидированности и окислительных модификаций БСА при инкубации в условиях, моделирующих физиологические 115
3.4.1. Изменение степени амидированности БСА при инкубации в условиях, моделирующих физиологические 115
3.4.2. Исследование процессов окислительной модификации препарата БСА при его инкубации в условиях, моделирующих физиологические 117
Заключение 122
Выводы 132
Список литературы
- Молекулярные механизмы дезамидирования
- Выделение и хроматографическая очистка препаратов сывороточного альбумина
- Изменение содержания амидных групп суммарных белков тканей белых крыс при старении
- Изменение степени амидированности БСА при инкубации в условиях, моделирующих физиологические
Введение к работе
Актуальность проблемы. Старение – это комплексный биологический процесс, связанный с прогрессивным снижением физиологических и биохимических функций индивидуальных тканей или органов. Старение характеризуется «тетрадой»: поражением мембран, инактивацией ферментов, нарушением клеточного деления и накоплением балластных полимеров, включая нуклеиновые кислоты, липиды и белки (Обухова, Эмануэль, 1983). Особое значение в процессе старения имеет окислительный стресс, так как он носит прогрессирующий и нарастающий характер. Согласно свободно-радикальной теории старения, нарушение биологического механизма ингибирования свободно-радикального окисления может быть пусковым фактором для развития различных возраст-ассоциированных патологий и процессов старения. Анализ тканевых повреждений показывает, что в условиях возрастного дисбаланса про- и антиоксидантных систем белки являются одной из первичных мишеней для окислительного стресса. Окисленные модифицированные белки вовлекают в последующие процессы липиды клеточных мембран, что приводит к необратимым повреждениям клетки (Болдырев, 2003).
В клетках активные кислородные метаболиты (АКМ) вызывают различные повреждения белковых молекул, такие как окисление аминокислотных остатков, образование белок-белковых сшивок, фрагментация молекул. Взаимодействие белков со свободными радикалами и активными формами кислорода (АФК) приводит к образованию гидроперекисей, альдегидов и других реакционных соединений. Присутствующие в клетках ферменты репарации белков (протеиназы, протеазы, пептидазы) расщепляют поврежденные молекулы до аминокислот и низкомолекулярных продуктов с целью их повторного использования или выведения из организма. Содержание окислено модифицированных белковых соединений в клетках, органах или целом организме представляет собой удобный показатель для оценки развития окислительного стресса (Зенков и др., 2003).
Предполагают, что встроенные в полипептидную цепь остатки аспарагина и глутамина действуют как «молекулярные часы», определяющие продолжительность функционирования белковой молекулы (Robinson, 2001). Было показано, что амиды дикарбоновых аминокислот вовлечены в процесс старения. Изменение степени амидированности влечет за собой локальные нарушения структурных и физико-химических характеристик белков и является причиной возникновения новых модифицированных белков с «дефектными» биологическими функциями (Белизи и др., 2001; Бибов и др., 2004; Назарова и др., 2005; Robinson, 2002). Можно предположить, что между генетически предопределенными посттрансляционными модификациями (ПТМ) и интенсивностью индуцированных окислительных процессов, участвующих в молекулярных механизмах развития старения, существуют сложные многосторонние связи.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось установление взаимосвязи окислительных модификаций и степени амидированности тканевых и индивидуальных белков в условиях физиологического и модельного старения.
В работе решались следующие задачи:
-
Изучить динамику степени амидированности суммарных белков тканей мышц, сердца, мозга, печени, селезенки и тестикул белых крыс на различных этапах постнатального онтогенеза (2, 4, 16, 18, 20 и 24 мес.).
-
Исследовать возрастную динамику окислительных модификаций суммарных белков по образованию карбонильных групп и уровню сульфгидрильных групп в различных тканях белых крыс.
-
Разработать модифицированный способ получения очищенного препарата сывороточного альбумина (СА) крыс.
-
Определить степень амидированности и окислительных модификаций по образованию карбонильных групп, содержанию сульфгидрильных групп, изменению собственной флуоресценции и флуоресценции остатков тирозина и триптофана сывороточного альбумина молодых (2 мес.) и старых (20 и 24 мес.) крыс.
-
Изучить динамику амидированности и окислительных модификаций по образованию карбонильных групп, уровню сульфгидрильных групп, изменению флуоресценции остатков тирозина и триптофана бычьего сывороточного альбумина (БСА) сразу и при инкубации в течение 7, 14 и 28 суток в условиях, моделирующих физиологическое старение (0,9% раствор NaCl, рН 7,0, 37С).
-
Исследовать влияние концентрации компонентов среды Фентона и времени инкубации на интенсивность окислительных модификаций и степени деструкции БСА по образованию карбонильных групп, изменению собственной флуоресценции белка и остатков тирозина и триптофана и электрофоретической гетерогенности.
-
Изучить влияние металл-катализируемых окислительных модификаций, индуцированных системой Фентона, на степень амидированности БСА.
Научная новизна работы: Впервые сопоставлена тканевая специфика степени амидированности и окислительных модификаций суммарных белков тканей мышц, сердца, мозга, печени, селезенки и тестикул белых крыс разного постнатального возраста (2, 4, 16, 18, 20 и 24 мес.). Разработана новая, простая и экономичная модификация метода выделения высокоочищенного препарата сывороточного альбумина крыс. Впервые установлена зависимость степени амидированности сывороточного альбумина от условий индуцированного металл-катализируемого окисления в среде Фентона. Определены корреляционные связи между интенсивностью окислительных модификаций и степенью амидированности сывороточного альбумина в условиях физиологического и модельного старения.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Динамика степени амидированности и окислительной модификации суммарных белков при старении белых крыс индивидуальна для каждой из исследованных тканей.
-
Инкубация в среде Фентона изменяет в БСА не только уровень окислительной модификации, но и содержание амидных групп.
-
Старение БСА в условиях, моделирующих физиологические, приводит к изменению посттрансляционных модификаций и конформационным последствиям, сопоставимым с изменениями в СА крыс при их физиологическом старении.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе результаты имеют существенное значение для понимания молекулярных механизмов, происходящих при старении белков как in vitro, так и in vivo.
В ходе старения животных наблюдается разнонаправленный характер изменений как степени амидированности, так и окислительных модификаций суммарных белков различных тканей крыс. Однако четкой зависимости между посттрансляционными модификациями суммарных белков различных тканей и их способностью к обновлению не выявлено.
В отличие от разнонаправленных динамик содержания амидных, карбонильных и сульфгидрильных групп в суммарных белках, отличающихся тканевой спецификой, посттрансляционные модификации индивидуального белка (сывороточного альбумина) имеют сходную картину как при физиологическом, так и при модельном старении.
Важным в теоретическом плане является установление взаимосвязи между степенью амидированности и окислительными модификациями белков, выявляемые по содержанию карбонильных групп, битирозиновых сшивок и окислению триптофана.
Полученные в работе результаты свидетельствуют о сопряжении спонтанных и индуцированных посттрансляционных модификаций, являющихся пусковым механизмом конформационных изменений белков, приводящих к нарушению их функциональной активности и накоплению во времени их аномальных, модифицированных форм.
Обнаруженная взаимосвязь между окислительной модификацией белка и степенью его амидированности имеет принципиальное значение, поскольку позволяет объяснить наблюдавшееся ранее увеличение амидированности белков в некоторых тканях при состояниях организма, сопряженных с окислительным стрессом.
Разработка модифицированного способа выделения высокоочищенного препарата сывороточного альбумина крыс позволяет упростить и сократить во времени базовый метод, не нанося ущерба степени чистота и гомогенности препарата.
Материалы, полученные в работе, используются на кафедре биохимии и микробиологии Южного федерального университета при чтении спецкурсов «Биология старения» и «Химия белка с основами биокатализа».
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 4-м съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием, (Новосибирск, 2008); 8-м Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2008); Научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2008); 3-й Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009); 9-м Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2010); 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых. «Биология – Наука 21-го века» (Пущино, 2010); 2-й Международной конференции «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 2011); Юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Общий объем публикаций составил 0,8 п.л., личный вклад – 57,3%.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литература, включающего 97 отечественных и 114 зарубежных источников. Работа иллюстрирована
43 таблицами, 2 схемами и 52 рисунками.
Молекулярные механизмы дезамидирования
Одним из факторов, оказывающих воздействие на экспрессию гена, является метилирование ДНК (Catania J., 1991). До 5% всех остатков цитозина в ДНК млекопитающих метилировано по 5 -позиции с образованием 5-метилцитозиа (5-мЦ). Это единственное постоянно модифицированное основание в ДНК высших эукариот. Метилирование происходит в обеих нитях ДНК, симметрично, и остатки 5-мЦ всегда фланкируются остатками гуанина со стороны З -конца. Метилирование ДНК вовлечено в регуляцию активности генов. Изменения в метилировании, в частности деметилирование динуклеотидов у позвоночных, связаны с изменением уровня транскрипции. Возрастное деметилирование ДНК впервые описано в 1973 г. Ванюшиным (Vanyushin B.F., 1973), когда была обнаружена разница в степени деметилирования в тканях крыс - в ткани мозга по сравнению с печенью оно было выше. В дальнейшем было показано возрастное снижение количества 5-мЦ в легких и культурах фибробластов кожи, для последних отмечена связь деметилирования со снижением возможности к росту в культуре (Wilson М., 1983). Было высказано предположение о том, что возрастное деметилирование предрасполагает клетки к опухолевой трансформации (Анисимов В.Н., 2007).
В 1961 г. Л. Хейфлик и П. Мурхед (Hayffick L., Moorhead P.S., 1961) показали, что человеческие клетки, способные к пролиферации в организме, размножаются ограниченное число раз, и этот предел запрограммирован. А именно, популяция фибробластов, взятых из раннего эмбриона, может удваиваться фиксированное число раз -приблизительно 50 (HayffickL., 1965).
Еще одной важной причиной клеточного старения может быть укорачивание теломер - специфических длинных последовательностей ДНК на концах хромосом. В 1971г. А.Оловников (Словников А.М., 1971) сформулировал проблему концевой недорепликации линейных молекул ДНК, поскольку ДНК-полимераза не может реплицировать несколько нуклеотидов на 3 -конце матрицы ДНК. Впоследствии был обнаружен фермент теломераза, компенсирующий укорочение ДНК путем наращивания на концах ядерной ДНК многократно повторяемого гексануклеотида (TTAGGG у человека), образующего так называемую теломеру (Greider C.W., 1985; 1989). В итоге укорочение линейной ДНК лишь сокращает этот нетранскрибируемый текст теломерного участка хромосомы, но не приводит к утрате наследственной информации и не нарушает механизм ее считывания. На определенной стадии развития, приходящейся на ранний эмбриогенез, происходит выключение гена, кодирующего теломеразу в подавляющем большинстве соматических клеток человека, в результате чего теломера укорачивается, что приводит к ухудшению функционирования хромосом. Это ухудшение наступает задолго до того, как исчезнет вся теломера и начнется деградация смысловых участков ДНК (Анисимов В.Н., 2007). Дело в том, что теломера, помимо защиты от потери генетического материала при репликации, играет также какую-то неясную еще структурную роль в расположении хромосом внутри ядра и в правильном их функционировании (Куренова Е.В., 1997; Counter СМ., 1996). Прослежена четкая корреляция между сокращением длины теломерного участка ДНК и лимитом Хейфлика (Анисимов В.Н., 2000).
Ко второй категории относят теории, согласно которым старение организма происходит из-за изменений во вторичных продуктах, детерминируемых генами, - в ферментах, етруктурных белках (коллагене), гормонах белково-пептидной природы, из-за разрушения различных клеточных мембранных структур (лизосом, митохондрий), а также из-за возрастных нарушений гомеостатичееких механизмов организма. Очевидно, инициация этих процесеов имеет двойственный характер, и как любое структурно-функциональное изменение они имеют первопричину в нарушениях реализации генетического аппарата клеток, ответственного за синтез различных компонентов или индуцированных структурных изменениях, возникающих в ходе функционирования клеток и организма в целом (Канунго М., 1982; Рыжак Г.А., 2004).
В 1924 году А.А. Богомолец выдвинул соединительно-тканную гипотезу старения, согласно которой в основе старения лежат возрастные изменения соединительной ткани. Аналогичная теория была еформулирована в еередине 50-х годов XX века А. Верцаром и извеетна в литературе как коллагеновая теория етарения. Сущноеть этой теории заключается в спонтанном или индуцированном процессе возникновения межмолекулярных ковалентных сщивок в основном белке соединительной ткани коллагене под действием экзогенных или эндогенных факторов окружающей среды.
Повышение с возрастом числа перекрестных внутри- и межмолекулярных связей рассматривают как один из возможных механизмов етарения, поскольку этот процесс сопровождается образованием дефектных, функционально неактивных макромолекул. В связи с чем основная идея А.А. Богомольца о предотвращении образования поперечных сшивок в межклеточной соединительной ткани продолжает оставаться актуальной и в настоящее время (Рыжак Г.А., 2004).
Структурная и функциональная перестройка белков и нуклеиновых кислот может быть вызвана путем неферментативного присоединения сахаров к свободным аминогруппам молекул. Такие моносахара, как D-глюкоза или D-галактоза, запускают цепь химических событий, продуцирующую метаболиты, способные создавать ковалентные связи внутри белковых молекул и связывать различные белки между еобой. В коллагене, содержащем большое количество глюкозы, обнаружено увеличение количества ковалентных связей у пожилых и больных диабетом по сравнению со здоровыми взрослыми людьми (Kohn R.R., 1984; Dunn L,1989). По мнению Серами, из-за такого гликозилирования соединительная ткань и сердечная мышца со временем теряют эластичность. Такое изменение на молекулярном уровне может являться причиной утолщения базальной мембраны, например, в мезангиальном матриксе почек, и приводить к почечной недостаточности при диабете, а также быть причиной возрастного снижения функции почек (Cerami А., 1985, 1986; Серами Э., 1987). Полагают, что этот механизм играет роль в сужении артерий, уменьшении сосудистого кровотока и снижении гибкости сухожилий. Показано, что в коллагене кожи коротко- и долгоживущих видов животных уровень маркера гликозилированного пентозидина обратно пропорционален видовой максимальной продолжительности жизни (Sell D.R., 1996).
В 1970 г. А. Фролькис предложил адапционно-регуляторную теорию старения, согласно которой благодаря деятельности мозга в ходе возрастного развития мобилизуются приспособительные механизмы, направленные на увеличение продолжительности жизни, сохранение и развитие адаптационных возможностей организма, что, в конечном итоге, приводит к формированию важнейших процессов витаукта. Однако возникновение возрастных нарушений в самих центрах регуляции способствует ограничению адаптационных возможностей и, как следствие, старению целостного организма (Фролькис А., 1992; Рыжак Г.А., 2004).
Исследование процессов возрастной инволюции тимуса и эпифиза позволило установить, что снижение функции клеток этих органов связано с уменьшением продукции веществ полипептидной природы (Анисимов В.Н., 1998,1999). В 1959 г. было установлено, что удаление эпифиза в молодом возрасте приводит к существенному уменьшению продолжительности жизни крыс по сравнению с контролем (Анисимов В.Н., 2003; Лысенко А.В., 2003,2005).
Согласно другой теории, выдвинутой в 1982 г., старение может быть следствием плейотропного эффекта группы генов, несущих информацию о программированной гибели клетки (апоптозе). С одной стороны, эта программа необходима для развития и функционирования многоклеточного организма, с другой - она делает неизбежной гибель клеток у взрослого организма. В таком случае старение может являться следствием постепенной убыли функционально активных клеток (Itzhak! О., 2003; Jigisha R. Patel, 2008).
Выделение и хроматографическая очистка препаратов сывороточного альбумина
Принцип метода основан на сочетании биуретовой реакции, в ходе которой пептидные связи белков в щелочной среде взаимодействуют с сернокислой медью с образованием биуретового комплекса, окрашенного в сине-фиолетовый цвет, и реакции с применением реактива Фолина - Чокалтеу, которые образуют с ароматическими аминокислотами (Тир, Фен и Трп) белков интенсивное темно-синее окрашивание. Чувствительность данного метода составляет 0,01 - 0,05 мг белка на мл.
Исследуемый белок (1 мг/мл) растворяли в 5 мл 0,1 н NaOH. К 0,2 мл раствора белка приливали 1 мл реактива «А» (раствор 2% Na2C03) и помещали на 10 минут в темное место. Затем приливали 4 мл реактива «Б» (0.5% CuS04 5H20 на 1% цитрате Na) и инкубировали в темноте в течение 40 минут. Оптическую плотность измеряли на ФЭКе («Backman», США) при t=750 нм. Количество белка в пробах рассчитывали по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартного раствора кристаллического сывороточного альбумина («Serva», США). Построение калибровочной кривой проводилось в трех параллелях.
В качестве системы, инициирующей металл-катализируемое окисление белков, использовали среду Фентона, состоящую из смеси FeS04 , ЭДТА и Н2О2 . Концентрация белка в пробах составляла 1 мг/мл.
Для установления точной концентрации перекиси водорода, используемой в качестве реагента среды Фентона, проводили её перманганатометрическое титрование.
Для инициации окислительной модификации сывороточного альбумина использовали среду Фентона 3-х концентраций: ОД М фосфатный буфер (рН 7,4), Fe2+, ЭДТА комплекс, который готовили ex tempore, и Н2О2 (10"5мМ, 10"4мМ, 10"3мМ). Контрольные пробы соответствующих серий белковых препаратов Н2О2 не содержали. Пробы инкубировали при 37 в течение 15 минут, 1 и 2 часов. По истечении инкубации интенсивность окислительной модификации белка оценивали по степени образования битирозиновых сшивок, снижению флуоресценции триптофана и содержанию карбонильных групп. Определяли также содержание амидных групп
В основе метода лежит специфическая для аммиака флюоресценция, возникающая в результате его взаимодействия с ортофталевым альдегидом (ОФА) в присутствии дитиотреитола (ДТТ). О содержании амидных групп в белке судили по количеству выделенного аммиака после гидролиза препарата белка в1н серной кислоте при 100С. В белках определяли суммарную амидированность, легкогидролизуемые и трудногидролизуемые амидные группы (Гершенович З.С., 1960).
1 мг белка растворяли в 0,2 мл 0,1 н NaOH, прибавляли 4,8 мл 1 н Н2804 и помещали в кипящую водяную баню при 100С. Через 15 минут инкубации отбирали 2,5 мл раствора для определения легкогидролизуемых амидов (ЛАГ), и через 3 часа для определения суммарных амидных групп (САГ). Пробы охлаждали, центрифугировали 15 минут при 3000 об./ мин. до рН 5,0-6,5 (в ходе нейтрализации раствор не должен достигать щелочных значений рН).
К 0,2 мл гидролизата добавляли 3 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 8,45, проверяли рН раствора и добавляли 0,1 мл смеси раствора, содержащего 5 мкМ ОФА и 5 мкМ ДТТ, растворенных в этаноле, затем перемешивали и инкубировали в течение 2-х часов при 37С.
Концентрацию свободного аммиака определяли флуорометрически при в03б = 413 нм и Хэмиссии = 476 нм на спектрофлюориметре «Shumadzu» (США). Количество ТАГ определяли по разнице между САГ и ЛАГ. По содержанию амидов данных фракций в первом приближении можно судить о количестве Асп и Глн в белке (Пушкина Н.В., 1976).
Количество аммиака в пробах определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартного раствора (NH SC , в 1 мл которого содержится 10 мкг азота аммиака. Содержание аммиака в пробах выражали в мкМ азота аммиака на 1 г белка.
В процессе реакции ДТНБК со свободными SH-группами белков, протекающей при рН 8,0, происходит освобождение тионитрофенильного аниона (ТНФА). Количество образовавшегося ТНФА прямо пропорционально количеству свободных сульфгидрильных групп белков, прореагировавших с ДТНБК. Коэффициент молярной экстинции при 412 нм равен 11400.
Суммарные белки тканей растворяли в 0,1н NaOH с последующей нейтральзацией соляной кислотой. К 1 мл исследуемого раствора белка (1 мг/мл) добавляли 0,5 мл 0,2М фосфатного буфера рН 8,0 и 1,5 мл дистиллированной воды и вносили 20 мкл реактива Элмана (ДТНБК). Пробы перемешивали и помещали в темное место на 20 минут. Затем измеряли оптическую плотность при длине волны 412 нм на спектрофотометре «Backman» (США).
Количество SH-групп в пробах определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартного раствора L-глутатиона (1 мМоль/ л), и выражали в мкМ SH-групп на 1 г белка.
В результате окисления белков под действием свободных радикалов кислорода образуются альдегидные и кетонные группы аминокислотных остатков (карбонильные группы), которые взаимодействуют с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона, которые имеют максимум поглощения при длине волны 370 нм.
При определении исходного уровня карбонильных групп белков в опытную пробу в определенной последовательности вносили: 1 мг белка (растворенного в 0,1 н NaOH и доведенного до 1 мл 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,4); 1 мл 50 мМ 2,4-ДНФГ и 1 мл 20 % ТХУ. Контрольная проба содержала те же компоненты, но вместо 2,4-ДНФГ добавляли 1 мл 2 М НС1.
Полученные пробы инкубировали при 25С в течение 1 часа с периодическим перемешиванием каждые 15 минут. По окончании инкубации образцы центрифугировали при 3000 об./ мин. в течение 20 минут. Для удаления из белковых образцов несвязавшегося 2,4-ДНФГ и липидов осадок дважды промывали 4 мл смеси этанол: этилацетат (1:1). Промытые осадки высушивали при 4С (помещением в холодильник) в течение 12-16 часов.
Высушенные осадки растворяли в 3 мл 8 М раствора мочевины, с добавлением одной капли 2 М раствора НС1. Пробы перемешивали и оставляли на 30 минут при комнатной температуре. Затем измеряли оптическую плотность при длине волны 370 нм на спектрофотометре «Backman» (США). Степень окислительной модификации белков рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинции Ем = 22000 л-м -см"1 (при 370 нм) для ДНФГ-производных, по формуле: ЛН А 22000 С где А содержание карбонильных групп в мкМ / мг белка; АЕ = Е оп - Е к01пр; С - содержание белка в пробе (в мг).
Изменение содержания амидных групп суммарных белков тканей белых крыс при старении
Исследованные нами препараты СА молодых животных содержат 594,2 мкМоль АГ на 1 г СА, что на 12% ниже теоретического расчетного значения. Незначительные отклонения в определенном нами содержании амидных групп от теоретического уровня связаны с частичным дезамидированием при выделении и очистке препарата (Пушкина Н.В., 1992).
В табл. 25 представлены данные относительно содержания двух фракций амидных групп в препаратах СА крыс. ЛАГ преимущественно принадлежат аспарагину, ТАГ - глутамину (Пушкина Н.В., 1992).
В исследуемом белке крыс 2-месячного возраста (контроль) количество амидных групп фракции ЛАГ составило 220,2±3,21 мкМоль амидного азота на 1 г белка, фракции ТАГ - 374,0±9,22 мкМоль азота аммиака на 1 г белка. К 20 месяцам содержание амидных групп фракции ЛАГ снижается на 11,9% (р 0,05) и в дальнейшем достоверно не изменяется. Достоверных изменений во фракции ТАГ не выявлено. ,4 і I Г
Содержание САГ в СА контрольной группы составило 594,2±2,63 мкМоль азота аммиака на 1 г бежа. К 20 месяцам уровень суммарной фракции амидов снизился на 7,8% (р 0,05) и соответствовал 547,8±6,18 мкМоль азота аммиака на 1 г белка. При дальнейшем увеличении возраста животных статистически достоверных изменений не обнаружено. Таким образом, отмечено более интенсивное снижение ЛАГ (аспарагина) в сывороточном альбумине старых животных.
Нами установлено, что в сывороточном альбумине старых крыс происходит посттрансляционное дезамидирование, которое сопровождается постепенным уменьшением количества амидов на 8% САГ и 11,9% ЛАГ. Следует подчеркнуть, что снижение амидированности происходило, в основном, за счет фракции ЛАГ, представленной в основном аспарагином, что согласуется с данными литературы о преимущественном дезамидировании аспарагина (Пушкина Н.В., 1979) и является косвенным доказательством неферментативности процесса. В пользу того, что наблюдаемый процесс носит спонтанный характер, свидетельствует высокая степень чистоты препарата сывороточного альбумина, а также отс тствие примесей протеолитических ферментов и микробных загрязнений.
Следует отметить, что отношение ЛАГ/ТАГ в сывороточном альбумине молодых и старых крыс достоверно не отличается и составляет 0,59 и 0,56, соответственно, что косвенно свидетельствует об отсутствии возрастных изменений в экспрессии гена альбумина. 3.2.3. Окислительные модификации сывороточного альбумина крыс
В таблице 26 представлены данные о содержание карбонильных групп в сывороточном альбумине крыс 2, 20 и 24 месячного возраста. Содержание карбонильных групп в сывороточном альбумине 2 месячных животных составило 2,2 мкМ/мг белка.
С увеличением возраста (20 месяцев) наблюдается статистически достоверный прирост карбонильных производных на 19,1% (р 0,05), что составило 2,62+0,15 мкМ/мг белка, к 24 месяцам также отмечается увеличение содержания карбонильных групп на 10%, что в совокупности превышает показатели контрольной группы животных на 30,4% (р 0,05) (см. рис. 32).
Накопление карбонилированных белков на поздних этапах онтогенеза животных отражает возникновение оксидативного стресса при этом интенсивность оксидативного стресса у животных старческого возраста (24 месяца) была выше, чем у 20 месячных. Одной из причин этого может быть возрастное снижение мощности антиоксидантных систем организма, которое на фоне нарушения функционирования мембранных электрон-транспортных цепей при старении способствует усилению радикалообразования в митохондриях и микросомах печени и, как следствие, увеличению в них концентрации АФК и локальному накоплению карбонилированных белков.
Таким образом, при старении возрастает эффективность возникновения оксидативного стресса. Важную роль в формировании этого сдвига приобретают возрастные изменения в функционировании мембранных редокс-систем и модуляция каталитических свойств ферментов «первой линии» антиоксидантной защиты (Губский Ю.И. и др., 2000).
Остатки цистеина в белках особенно чувствительны к окислению всеми активными формами кислорода, азота, серы и хлора (Лущак В.И., 2007). В ходе окисления цистеинового остатка последовательно образуются производные сульфеновой, сульфиновой и сульфоновой кислот. Сульфеновые производные могут окисляться до сульфиновых, либо образовывать смешанные эфиры с цистеином или глутатионом, либо восстанавливаться до 8Н-rpynn.
Сывороточный альбумин как и большинство внеклеточных белков имеет небольшое количество свободных реакционноспособных сульфгидрильных групп (одну) и значительное число дисульфидных связей (17) (Джафаров Э.С., 1990).
В таблице 27 представлено содержание SH - групп в сывороточном альбумине 2, 20 и 24 месячных крыс. Количество тиолов сывороточного альбумина 2-х месячных животных составило 23,73+1,3 мкМ/г белка, тогда как у 20 месячных крыс анализируемый показатель превысил контрольную величину на 137,1% (р 0,05) и составил 56,2 мкМ/г белка. К 24 месячному возрасту животных содержание сульфгидрильных групп СА в 2,5 раза превышает показатель контрольной группы (см. рис.33).
Изменение степени амидированности БСА при инкубации в условиях, моделирующих физиологические
В процессе старения позвоночных животных наблюдаются разнообразные по форме, величине и направленности изменения биологической активности многих белков и ферментных систем в органах и тканях. Рост или падение функциональных хариктеристик полипептидных цепей может быть результатом изменения как их количества под влиянием различных воздействий на процессы трансляции и элиминации, так и структурной организации молекул белков (Демченко А.П., 1981). Появление измененных белков считают одним из фундаментальных признаков старения. Полагают, что старение характеризуется накоплением ошибок трансляции, различных посттрансляционных модификаций (Степанов В.М., 2005), а также изменениями белковой конформации.
Робинсон (2001) выявил закономерностъ между временем полужизни белков и неферментатйвным дезамидированием остатков аспарагина и глутамина Дезамидирование аспарагина в бежах происходит с высвобождением аммиака и формированием, в конечном счете, остатков изоаспартата и аспартата через стадию гидролиза циклицеских сукщшимищых. интермедиатов. L-изоаспартатные остатки составляют от 60 до 70 % продуктов дезамидирования и, как постулируется, вводят перегибы в полипептидный остов, нарушая тем самым структуру и функции белка (Hayes С, 1997). Эти структурные преобразования инициируют опознавание поврежденных белков обычными протеолитическими системами клетки и протеасомами. Механизм распозиавания таких белков связан со способностью протеасом определять участки глобул, на которых происходит экспозиция гидрофобных радикалов.
Rothstein М. (1985) предположил, что возраст-зависимое увеличение гидрофобности может происходить как при спонтанных изменениях конформации бежа, так и при постгрансляционных окислительных модификациях (Chao С.-С, 1997).
Окислительные модификации сопровождаются увеличением персистенции карбонильных белков, что может быть результатом снижения активности клеточных протеазных систем. Показано, что угнетение биологической роли протеасом, различающихся для окисленных и нативных форм белков, сопровождается накоплением поврежденных белков. В свою очередь, снижение протеолиза характеризуется аккумуляционным эффектом по отношению к агрегатам бежов (агрегасом), устойчивых к действию протеаз. Эти агрегасомы, в свою очередь, связываются с протеасомами и блокируют их (Муравлева Л.Е., 2010; Е. Shacter, 2000). Существующие весьма немногочисленные и противоречивые данные о процессах онтогенетического катаболизма бежов согласуются с представлением, что измененные белки старых организмов более чувствительны к протеолизу, чем белки молодых особей. Однако нарушения в системе внутриклеточных протеаз и возрастная дисфункция протеасом позволяют таким белкам деградировать со значительно меньшей скоростью, чем в организмах молодых животных, при этом становится возможным накопление частично гидролизованных «недорасщепленньк» форм белков (Демченко А.П., 1981). Склонность окисленных белков к агрегации в процессе старения также замедляет их ферментативный гидролиз (Дубинина Е.Е., 2006).
Нами выявлены некоторые особенности накопления окисленных производных суммарных белков разных тканей в различных возрастных группах крыс в ходе их физиологического старения (см. рис. 51). Исследованные ткани отличались митотической активностью и относились к группам постмитотических необратимых (сердечная и скелетная мускулатура, мозг) и обратимы (печень, селезенка, тестакулы) тканей. мышцы сердце печень селезенка тестикулы мозг суммарные белки
Установлена четкая тканеспецифичная возрастная динамика прироста карбонильных производных суммарных белков во всех анализируемых тканях, за исключением тестикул, в которых отмечено снижение кетопроизводных белков, к началу пострепродукгивного периода Наиболее выраженные изменения в обратимых пскггмитотических тканях выявлены в печени и селезенки, в которых накопление карбонил-модифицированных белков составило 1,5 и 4,5 раза, соответственно, тогда как в необратимых тканях онтогенетические увеличение наблюдалось преимущественно в отношении миокарда с величиной 2,3 раза Возрастное изменение степени карбонильной модификации белков мозга имело более сглаженный характер и составило 34%.
В литературе также показана различная динамика и интенсивность ПОЛ в разных органах и тканях животных при старении организма. Эти различия завиеят от устойчивости систем ПОЛ и антирадикальной защиты данного органа (Boechme et al., 1997; Анисимов и др., 1999; Хавинсон и др., 2003; Bokov et al., 2004; Halliwell, Gutteridge, 2007). Так результаты, полученные Бондаренко Т.И. и Майборода Е.А. (2011) в нашей лаборатории и на тех же животных, свидетельствуют о возрастании интенсивности ПОЛ, выраженном в накоплении МДА в мозге, печени и плазме крови крыс в ходе их индивидуального развития. Наибольшее повышение содержания МДА имело место в мозге животных всех возрастных групп, что объясняется особенностями метаболизма данной ткани. В печени эти изменения имели более неоднородный характер и онтоленегическое накопление ТБК-активных продуктов отмечено, начиная с 20 месячного возраста крыс.
Однако наблюдаемое нами статистически значимое накопление белковых карбонилов соответствовало более раннему возрастному периоду (16 мес.) животных, что позволяет рассматривать окислительные модификации белков как первичный индикатор окислительного повреждения тканей.
Другим механизмом окислительного повреждения белков активными кислородными метаболитами является окисление SH-содержащих аминокислотных остатков цистеина или метионина с последующим образованием тиолов, тиолягов, тиильных радикалов, дисульфидов, сульфеновых, сульфиновых и сульфоновых кислот. Эффективность окислительной модификации цистеиновых остатков определяется их низким потенциалом ионизации и в значительной степени зависит от микроокружения и структурной организации белковой молекулы. В условиях окислительного стресса действие АКМ на цистеиновые остатки в белках ведет к образованию нестабильной сульфоновой кислоты, которая может либо обратно восстанавливаться в цистеин, либо подвергаться более глубокому окислению до сульфиновой и сульфоновой кислот (Зенков Н.К., 2009)
Анализ сравнительно-онтогенетических исследований показал, что во всех тканях происходит снижение содержания сульфгидрильных групп к 24 месячному возрасту животных. Однако наблюдаемые изменения носили нелинейный характер. Это выражалоеь в предварительном увеличении содержания тиольных групп в миокарде, тестикулах и скелетных мышцах на 67,0, 38,7 и 59,4%, соответственно, в 4 месячном возрасте животных, которое еохранялось в скелетных мыщцах вплоть до 16 месяцев (91,9%) (Рис. 52).
