Введение к работе
Актуальность проблемы. Сукцинатдегидрогеназный ферментный комплекс (сукцинат : акцептор-оксидоредуктаза, сукцинат-убихинон-редуктаза) является энзимом, служащим одновременно компонентом дыхательной цепи и цикла Кребса, обеспечивающий трансэлиминирование двух атомов водорода от янтарной кислоты с образованием фумарата (Игамбердиев, Фалалеева, 1994). Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ 1.3.5.1), являясь полифункциональным ферментом, выполняет функции комплекса II ЭТЦ, катализирует реакцию цикла трикарбоновых кислот и участвует в одном из этапов глюконеогенеза (утилизируя сукцинат, образуемый в глиоксилатном цикле) (Епринцев, Попов, 1999). Известно, что трансформация биохимических процессов происходит с помощью ферментов, причем в этих сложных процессах участвуют изоферменты. У бактерий, которые часто меняют направление метаболических процессов, осуществляя адаптивную реакцию, редко встречается изоферментный полиморфизм (Хочачка, Сомеро, 1977). Ранее в нашей лаборатории была установлена структурная перестройка малатдегидрогеназной системы, обеспечивающая вариабельность метаболических потоков у серобактерий (Епринцев и др., 2007). Значение сукцинатдегидрогеназы в механизмах осуществления адаптивной реакции клеточного метаболизма практически не известно. Особый интерес представляет исследование ферментативной регуляции метаболизма у бактерий S. natans, являющихся умеренными термофилами и способными в зависимости от типа питательной среды осуществлять органотрофный или миксотрофный рост (Епринцев и др., 2011). Бактерии S.natans штамма Д-507 выделены из природных термальных сероводородных источников. Бактерии штамма Д-380 относятся к мезофиллам и являются типичными обитателями антропогенных экосистем, использующих только органотрофный тип питания (Гриднева и др., 2009). Ранее было показано, что малатдегидрогеназная ферментная система в процессе посттрансляционной модификации формирует димерную структуру (обеспечивающую функционирование ЦТК) или тетрамерную (функционирующую в глиоксилатном цикле). Выявлено, что не только тип питания может влиять на структуру и характеристики ферментов. Показано, что регулирование активности фермента путем трансформации изозимного состава белков может осуществлять температурный фактор. Для сукцинатдегидрогеназного ферментного комплекса подобных исследований не обнаружено. В связи с этим определенный интерес вызывает изучение структурно-функциональных особенностей сукцинатдегидрогеназы в бактериях S.natans при разном типе питания.
Целью данной работы являлось получение гомогенных препаратов изоформ СДГ из бесцветных серобактерий S. natans при разных условиях роста и изучение их структурно-функциональных и регуляторных свойств.
В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать с помощью маркерных ферментов цикла Кребса и глиоксилатного пути особенности трансформации углеводного метаболизма у разных штаммов S. natans при органотрофном и миксотрофном питании.
-
Выявить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле изоферментный состав сукцинатдегидрогеназной ферментной системы у штамма Д-507 и штамма Д-380 бесцветной серобактерии Sphaerotilus natans.
-
Осуществить с помощью многостадийной схемы очистку изоформ сукцинатдегидрогеназы из разных штаммов и получить электрофоретически гомогенные препараты исследуемых бактерий.
-
Изучить четвертичную структуру изоформ сукцинатдегидрогеназы из разных штаммов S. natans в условиях органо- и миксотрофного питания.
-
Установить значения констант Михаэлиса и рН-оптимума для окисления сукцината изоформами СДГ исследуемых штаммов бактерий.
-
Исследовать влияние температуры на скорость ферментативной реакции и термостабильность изоформ СДГ из штаммов Д-507 и Д-380.
-
Выяснить влияние АТФ и АДФ на функционирование высокоочищенных препаратов изоформ сукцинатдегидрогеназы.
-
Изучить регуляторные свойства различных ионов на функционирование изоформ сукцинатдегидрогеназы из S.natans.
-
Разработать способ длительного хранения препаратов изоформ сукцинатдегидрогеназы, выделенных из штаммов Д-507 и Д-380 S. natans.
Научная новизна. Показано, что в условиях органотрофного роста у S.natans функционируют две изоформы сукцинатдегидрогеназы у штамма Д-507 и одна форма у штамма Д-380. Анализ ферментативной активности маркерных энзимов свидетельствует, что в условиях миксотрофного роста индуцируется у исследованных бактерий штамма Д-507 глиоксилатный цикл.
Получены в электрофоретически гомогенном состоянии три формы сукцинатдегидрогеназы из S.natans при разных условиях питания. Установлена четвертичная структура всех изоформ, представляющая гетеротетрамер. Каталитические и регуляторные характеристики у изоформ, осуществляющих функционирование цикла трикарбоновых кислот, имеют близкие значения. Установлены термодинамические характеристики изоформ
сукцинатдегидрогеназы и их термостабильность.
Практическая значимость. Результаты диссертационной работы расширяют и углубляют знания о структурно-функциональных характеристиках изоформ сукцинатдегидрогеназы в бактериях Sphaerotilus natans при разных типах питания. Полученные гомогенные препараты сукцинатдегидрогеназы могут найти применение в научно-исследовательских работах, как вспомогательный энзим для изучения других ферментов. Предлагаемый способ хранения обеспечивает широкое использование препаратов изоформ сукцинатдегидрогеназы в лабораторной практике. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, спецкурсах по энзимологии, биохимическим механизмам адаптации прокариот, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
-
Бактерии Sphaerotilus natans штамм Д-507 характеризуются мобильным типом обмена веществ, о чем свидетельствует изменение ферментативной активности маркерных энзимов. Трансформация метаболизма (индукция глиоксилатного цикла) у бактерий штамма Д-507 вызывается сменой органотрофного роста на миксотрофный.
-
Получены электрофоретически гомогенные препараты изоформ сукцинатдегидрогеназы из разных штаммов бактерий S.natans. Установлено, что изоформы СДГ состоят из четырех различных по молекулярной массе субъединиц, то есть молекула энзима представляет собой гетеротетрамер.
-
Выявлены две изоформы СДГ в бактериях штамма Д-507 при органотрофном и миксотрофном типе роста. У бактерий штамма Д-380 функционирует только одна изоформа исследуемого фермента.
-
На гомогенных препаратах сукцинатдегидрогеназы, выделенных из разных штаммов, исследованы регуляторные особенности функционирования данной ферментной системы. В частности, показано наличие активирующего эффекта функционирования СДГ, вызываемого ионами хлора.
5. Проанализированы различные варианты хранения изоформ сукцинатдегидрогеназы с использованием стабилизаторов белковой молекулы и низких температур. Наиболее высокая сохранность активности СДГ характерна при их хранении в условиях низкой температуры (-78 оС). Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на межрегиональных конференциях, посвященных памяти А. А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого- биохимических процессов» (Воронеж, 2010, 2011, 2012 гг), на 15 международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (2011), ежегодных научных сессиях, отчетных конференциях преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2011-2012гг.).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 8 публикациях - 7 статьях и 1 тезисе.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (170 источников). Иллюстрационный материал включает 6 таблиц и 40 рисунков.
Похожие диссертации на Очистка, физико-химические и регуляторные свойства изоформ сукцинатдегидрогеназы из штаммов Sphaerotilus natans с разным типом метаболизма при органо- и миксотрофном росте
-
