Введение к работе
Актуальность темы
Алкилоксибензолы (АОБ) встречаются на разных уровнях организации живой материи (бактерии, грибы, растения) и демонстрируют чрезвычайно широкий спектр биологических активностей, что делает их объектом значительного числа междисциплинарных исследований (Kozubek А., TymanJ.H.P., 1999; Эль-Регистан Г.И. с соавт., 2006). В частности, у бактерий родов Azotobacter, Pseudomonas, Micrococcus, Thioalkalivibrio и др. эти вещества выполняют роль внеклеточных ауторегуляторов с функциями адаптогенов, способных индуцировать переход клеток в гипометаболическое и анабиотическое состояние (Suzina N.E. et al., 2006; Мулюкин А.Л. с соавт., 2009).
В основе биологической активности АОБ лежит их способность к ряду физико-химических взаимодействий (гидрофобных, электростатических, водородных) с липидами клеточных мембран (Вострокнутова Г.Н. с соавт., 1983), протеинами (Николаев Ю.А. с соавт., 2008) и нуклеиновыми кислотами (Ильинская О.Н. с соавт., 2002), что обуславливает изменение структурной организации и функциональной активности биомакромолекул и надмолекулярных структур. При этом универсальность действия АОБ как «химических шаперонов» (Мартиросова Е.И. с соавт., 2004) обуславливает развитие сходных эффектов в гетерологичных системах. В частности, в присутствии микромолярных концентраций гомологов АОБ показаны изменения каталитической активности, функциональной и операционной стабильности моно- и полисубъединичных ферментных белков не только микробного и растительного, но и животного происхождения (Колпаков А.И. с соавт., 2000; Петровский А.С. с соавт., 2009; Solyanikova LP. et al., 2010), а также снижение аффинности рецепторов к фибриногену на поверхности тромбоцитов (Kozubek A., Wroblewki Z., 1990).
В связи с тем, что АОБ в значимых количествах поступают в организм человека и животных с пищей, а также синтезируются некоторыми представителями микробиоценоза, их концентрации в биологических жидкостях и тканях могут достигать нано- и микромолярных значений (Landberg R. et al., 2006; Ross А.В. et al., 2010). Это предполагает возможность участия АОБ в регуляции ряда иммунофизиологических и иммунопатологических процессов. Высказанное предположение подтверждает показанная в опытах in vitro способность АОБ изменять розеткообразующую активность Т-лимфоцитов (Казацкая Ж.А. с соавт., 2005), а также оказывать цитотоксическое действие на мононуклеарные фагоциты (Шушпанова О.Н., 2008). Итоговым результатом реализации такой биологической активности могут являться индуцируемые АОБ аллергические состояния (Ока К. et al., 2004; Hershko К. et al., 2005).
Однако до настоящего времени отсутствуют данные, характеризующие эффекты алкилоксибензолов в отношении антител - неферментных иммунных белков человека и животных, включая изменение их основного свойства -антигенсвязывающей способности, а также функциональной и операционной стабильности при экстремальных физических и химических воздействиях.
Цель работы - изучить влияние алкилкоксибензолов - химических аналогов бактериальных ауторегуляторов, на функциональную активность и стабильность антител (иммуноглобулинов).
Задачи исследования
Исследовать влияние алкилоксибензолов на функциональные характеристики иммуноглобулинов в реакциях «антиген-антитело».
Изучить действие алкилоксибензолов на стабильность иммуноглобулинов при денатурирующих воздействиях и неоптимальных условиях проведения реакций.
Научная новизна
Впервые установлено, что алкилоксибензолы - химические аналоги бактериальных ауторегуляторов, способны блокировать специфическое взаимодействие антител (иммуноглобулинов) с соответствующими антигенами. Выраженность эффектов АОБ зависит от длины алкильного радикала и определяемой этим гидрофобности данных веществ, а концентрационная зависимость их действия варьирует от характеристик реакционной системы. Механизм эффектов АОБ на иммуноглобулины связан с их модифицирующим действием на аффинность, а через него и авидность антител. Эффект распространяется на антитела различной специфичности и классов. В ряде случаев результатом взаимодействия «АОБ : антитела» может стать частичное изменение специфичности иммунных белков.
Обнаружено, что алкилоксибензолы способны дополнительно влиять на результат реакции в системе «антиген-антитело» через взаимодействие с антигенами. Ранжирование значимости эффектов АОБ в рассматриваемой системе позволило установить, что короткоцепочечные гомологи преимущественно реализуют свою биологическую активность через влияние на свойства антигенов, в то время как длинноцепочечные АОБ оказывают большее действие на свойства антител.
Выявлен модифицирующий эффект длинноцепочечных алкилоксибензолов на функциональную активность Fc-фрагментов антител, проявляющийся в затруднении инициации классического пути активации комплемента в реакции комплементзависимого гемолиза.
Изучение эффектов алкилоксибензолов на функциональную и операционную стабильность антител позволило установить разнокачественность отклика на внешние воздействия: АОБ снижали устойчивость белков к термоденатурации, преимущественно увеличивали их устойчивость к УФ-облучению и неоднозначно изменяли диапазон активности при низких и высоких значениях рН.
При длительной инкубации модифицированных АОБ антител в водных растворах выявлено развивающееся во времени восстановление показателей их связывания с соответствующими антигенами, первоначально ингибированного в результате взаимодействия белков с длинно це почечными АОБ. На этом фоне
значимым эффектом 1,3-диокси-5-метилбензола явилась его способность увеличивать сроки сохранения функциональной активности антител при температуре +37С.
Практическая значимость
Полученные результаты, свидетельствующие об изменении функциональных характеристик антител при взаимодействии с АОБ, позволяют говорить об алкилоксибензолах как о новой группе бактериальных ауторегуляторов с иммуномодулирующими свойствами с перспективой разработки на этой основе новых подходов к регуляции иммунологических реакций в системах in vitro и in vivo.
Результаты модификации антител 1,3-диокси-5-метилбензолом положены в основу оригинального подхода к стабилизации этих белковых молекул в условиях длительного нахождения в водных растворах, ориентированного на увеличение сроков хранения диагностических и лечебно-профилактических препаратов иммуноглобулинов без утраты их функциональной активности. Приоритет разработанного подхода закреплен «Способом стабилизации антител в водных растворах» (положительное решение ФИПС по заявке на изобретение № 2010136488 от 30.08.2010 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
Алкилоксибензолы - химические аналоги бактериальных ауторегуляторов, изменяют функциональные характеристики антител: антигенсвязывающую способность, специфичность и эффекторные функции. Характер влияния алкилоксибензолов зависит от химического строения АОБ и наиболее выражен у их длинноцепочечных гомологов. Изменение параметров связывания в системе «антиген-антитело» дополнительно может быть обусловлено модификацией свойств антигенов в присутствии АОБ.
Алкилоксибензолы различной структуры разно качественно влияют на стабильность антител при внешних воздействиях: повышают их чувствительность к термоденатурации, преимущественно снижают чувствительность к УФ-облучению и неоднозначно изменяют диапазон активности при различных значениях рН. 1,3-диокси-5-метилбензол увеличивает сроки сохранения функциональной активности антител в условиях их длительного нахождения в водном растворе.
Связь автора с выполнением научных программ и собственный вклад автора
Исследования выполнены в рамках ГБ НИР № 01200606125 «Влияние ауторегуляторных di -факторов бактерий из группы алкилоксибензолов на структуру и функции биополимеров», а также при поддержке гранта РФФИ 08-04-99078-р_офи «Разработка технологии стабилизации иммунных и ферментных белков с использованием химических шаперонов микробного происхождения».
Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы
Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на III и
Межрегиональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой (Саратов, 2006, 2010);
конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии» (Оренбург, 2006); Региональной конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Екатеринбург - Пермь, 2007); III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь - Н. Новгород, 2008); IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (СПб, 2008); Российской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011).
Основные результаты проведенных исследований представлены в 13 печатных работах, в том числе 5 статьях в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований.
Структура и объем диссертации
