Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 11
1.1.Эколого-геохимическая характеристика нефтегазодобывающего комплекса России и СНГ 11
1.2. Химическая и токсикологическая характеристика газоконденсата и некоторые аспекты его влияния на организм 14
1.3. Современные представления о детоксицирующей функции печени и ее роль в метаболизме ксенобиотиков 20
1.4. Адениловые нуклеотиды и метаболизм клетки ..25
1.4.1. Аденилаткиназа, АМФ-дезаминаза и 5-нуклеотидаза как ключевые ферменты обмена адениловых нуклеотидов. Структура и механизм действия 35
1.4.2. Обмен адениловых нуклеотидов при различных патологических состояниях организма 41
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 52
2.1. Лабораторные животные и моделирование эксперимента 52
2.2. Методы биохимических исследований 54
2.2.1. Приготовление гомогенатов печени крыс и получение субклеточных фракций 54
2.2.2. Определение содержания адениловых нуклеотидов 55
2.2.3.Определение активности ферментов метаболизма адениловых нуклеотидов в печени экспериментальных животных 57
2.3. Статистическая обработка результатов исследования 59
ГЛАВА III. Результаты исследований и их обсуждение 61
3.1. Влияние газового конденсата на общее состояние отравленных животных, гематологические показатели и на продолжительность жизни экспериментальных крыс в динамике токсического поражения 61
3.2. Влияние газоконденсата на содержание отдельных форм адениловых нуклеотидов в печени экспериментальных животных 65
3.3. Влияние газового конденсата на активность ключевых ферментов метаболизма адениловых нуклеотидов 69
3.3.1. Исследование АМФ - дезаминазной активности в субклеточных фракциях печени животных при отравлении газоконденсатом 72
3.3.2. Изменения активности 5х-нуклеотидазы в субклеточных фракциях печени крыс при модельных условиях эксперимента 78
3.3.3. Влияние газового конденсата на активность аденилаткиназы печени отравленных животных 84
3.3.4. Изменения активности ферментов метаболизма адениловых нуклеотидов в сыворотке крови крыс в условиях воздействия газоконденсатной смесью .90
Заключение 100
Выводы 110
Литература 112
- Химическая и токсикологическая характеристика газоконденсата и некоторые аспекты его влияния на организм
- Аденилаткиназа, АМФ-дезаминаза и 5-нуклеотидаза как ключевые ферменты обмена адениловых нуклеотидов. Структура и механизм действия
- Определение содержания адениловых нуклеотидов
- Влияние газоконденсата на содержание отдельных форм адениловых нуклеотидов в печени экспериментальных животных
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение закономерностей (механизмов) воздействия токсических, чужеродных соединений на живой организм, выявление последствий влияния ксенобиотиков на метаболические реакции организма имеют практический и теоретический интерес.
Значительное увеличение разведочных и строительных работ нефтегазового комплекса в нашем регионе, естественно, влечет к возрастанию выбросов загрязнителей в окружающую среду. Ежегодно в атмосферу выбрасывается 2,5 млн. тонн нефти и нефтепродуктов, около 6 млрд м попутного нефтяного газа сжигается в факелах (Грачев, Ахметханов, 2000). Согласно экспертным данным на нефтепромыслах теряется в общей * сложности до 3,5 % всей добываемой сырой нефти (с учетом нефтяных газов). Сейчас утилизируется в среднем около 70 % газов, поступающих из скважин с нефтью, а остальные 30 % сжигаются на факелах и частично испаряются в атмосферу (Мелконян, 2001; Грачев, Ахметханов, 2000).
Кроме того, наблюдаются испарения нефти и нефтепродуктов в процессах их транспортировки и хранения. Источниками загрязнения атмосферы являются и нефтяные терминалы, и нефтебазы, железнодорожный транспорт, речные и морские нефтеналивные танкеры, автозаправочные комплексы и станции. Исследователями, в связи с этим, разрабатываются (; различные способы борьбы с нефтезагрязнениями и методы сбора и очистки (Цегельский и др., 2001).
В связи с этим возрастает актуальность проблемы острого и хронического воздействия нефти, нефтепродуктов, в том числе и газоконденсата (в условиях массового загрязнения среды ими) на обменные процессы организма.
Этим вопросам посвящен ряд работ (Гиреев, 1983; Миронов, 1992; Егорова, 1995; Гильямирова, 1996), свидетельствующих о токсическом влиянии на обменные реакции организма различных нефтепродуктов.
Известно, что углеводороды с длинной цепью углеродных атомов, накапливаясь в тканях, оказывают прямое воздействие на внутриклеточный обмен. Наиболее опасными являются ароматические углеводороды, которые лучше растворимы в липидной фазе и обладают канцерогенными свойствами. Нефтепродукты могут аккумулироваться в живых организмах, содержащиеся в пище нефтепродукты нарушают функции некоторых органов и тканей человека и снижают общий уровень иммунитета, что повышает вероятность заболевания организма инфекционными болезнями (Воробьев, Новиков, 2001; Адаева, 2001). Мишенью для действия липофильных углеводородов являются мембраны, жировая ткань, мозг, половые железы, то есть структуры и ткани с повышенным содержанием липидов.
В литературе имеется целый ряд сведений, касающихся токсического действия углеводородов нефти на липидный обмен. Показано, что загрязнение водной среды нефтью и сопутствующими растворами (буровой шлам, буровой раствор, газоконденсат) ведет к накоплению в тканях фосфолипидов, что говорит о процессах адаптации рыб (русский осетр, вобла, бычок и др.) к стрессовому воздействию загрязнителей. Вместе с тем наблюдается резкое падение суммарных фосфолипидов, сопровождающееся накоплением неэстерефицированных жирных кислот и лизосоединений в тканях, что служит показателем усиления перекисного окисления мембранных липидов и, как следствие этого, деструктивных процессов (Чернышев, 1982; Исуев, Габибов, 1997; Абросимов, Бирюкова, 1997; Мусаев, Исуев, 2002; Уцов, Исрапов, 2002; Серебренникова, 2002).
Некоторые авторы изучали проблему воздействия отдельных циклических углеводородов, в частности (дурол, псеудокумол и др.) на различные обменные реакции организма. Получены результаты, свидетельствующие об усилении процессов биотрансформации ксенобиотиков, усилении процессов генерации активных форм кислорода и перекиси водорода, что приводит к срыву антирадикальных и антиперекисных механизмов защиты при остром воздействии экотоксикантов. Единичные
7 данные литературы показывают, что в отношении адениловой системы нуклеотидов воздействие этих же ксенобиотиков проявляется в падении уровня АТФ и накоплении АДФ и АМФ, что, вероятно, связано с расстройствами в соотношении процессов фосфорилирования и дефосфорилирования макроэргичесих соединений. Вместе с тем наблюдается повышение общей концентрации адениловых нуклеотидов, нормализация чего наблюдается по истечении двух недель после ингаляционного воздействия циклических углеводородов (Шакиров, Фархутдинов, 1998; Егорова, Кулагина, 1995; Шакиров, Фархутдинов, 2000).
Изучение влияния газоконденсатной интоксикации на организм рыб и особенно наземных животных началось сравнительно недавно, о чем свидетельствуют незначительное число работ (Костров, Курапов, 2000; Омаров, Курапов, 2000; Уцов, 2002; Серебренникова, Нагиев, 2002). В настоящее время изучение биохимических механизмов действия газоконденсата на организм представляется актуальной задачей экологической биохимии и токсикологии. Газоконденсат, выбрасываемый в атмосферу при нефте- и газодобыче, представляет собой жидкую смесь высококипящих углеводородов и растворенных газов метан-бутановоЙ фракции. То есть в химическом отношении его компонентами являются алканы (С1-С4, С5 и выше), циклоалканы (СЗ и выше), ароматические и гетероатомные углеводороды (Рудзитис, Фельдман, 1987).
Энергетический обмен, в котором главную роль играют адениловые нуклеотиды, занимает центральное место в клеточном метаболизме. Любой биосинтетический и катаболический процесс сопровождается соответственно затратой и выработкой энергии, заключенной в связях макроэргических соединений, какими являются АТФ и АДФ. Кроме того, адениловые нуклеотиды являются структурными компонентами нуклеиновых кислот, участвуют в обмене коферментов (НАД, НАДФ, ФАД, КоА, ТПФ и др.). Они являются предшественниками циклических нуклеотидов (цАМФ), которые запускают каскадный механизм активирования внутриклеточных белков. АТФ
8 необходим в процессах мышечного сокращения, активного транспорта, проведения нервного импульса (Березов, Коровкин, 2002; Ткачук и др., 2002; Северин и др., 2003).
Изучению энергетического обмена, и, в частности, адениловой системы, при воздействии различного рода стрессов (гипоксия, гипотермия, физическая нагрузка, ионизирующая радиация и др.), а также на фоне различных патологических состояний (эпилепсия, острая черепно-мозговая травма и др.) посвящены многочисленные работы (Нагиев, 1984; Литовченко, 1986; Дудченко и др., 1993; Новиков, 1995; Алатырцев, 1995; Студнева и др., 1999; Нагиев и др., 2002).
В связи с этим представляет несомненный интерес выяснение К) закономерностей действия газоконденсата на процессы биосинтеза и распада нуклеотидов аденилового ряда, а также на их содержание в динамике отравления этим токсикантом.
Цель и задачи исследования. Изучить содержание адениловых нуклеотидов в печени крыс и активность ключевых ферментов их обмена при действии газового конденсата.
Для выполнения этой цели в работе решались следующие задачи: 1. Исследовать содержание отдельных форм адениловьтх нуклеотидов в печени крыс при действии газового конденсата. У) 2. Изучить в динамике острого отравления газоконденсати ой смесью активность АМФ-дезаминазы в печени и сыворотке крови экспериментальных животных.
Изучить активность 5' -нуклеотидазы в печени и сыворотке крови экспериментальных крыс в динамике острого отравления газоконденсатом.
При модельных условиях эксперимента изучить активность прямой и обратной аденилаткиназы в печени и сыворотке крови отравленных 1Г животных.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Обнаружено, что в биохимических механизмах отравления ту газоконденсатом существенную роль играют нарушения содержания адениловых нуклеотидов в печени подопытных животных, что коррелирует с летальностью пораженных крыс и изменениями гематологических показателей.
2. Установлен факт снижения содержания АДФ и АТФ на 5-10-е сутки после отравления в печени крыс, подвергшихся воздействию газоконденсатной смесью.
3. В изменениях содержания адениловых нуклеотидов в печени \) крыс в условиях отравления газоконденсатом, ведущую роль играют нарушения активности АМФ-дезаминазы, З'-нуклеотидазы и аденилаткиназы. В частности, заметно повышается активность аденилаткиназы (особенно прямой реакции), снижается активность аденозиндезаминазы и, весьма существенно, - б'-нуклеотидазы в печени экспериментальных животных в динамике острого отравления газоконденсатом.
Научная новизна. В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование активности ключевых ферментов метаболизма у адениловых нуклеотидов с одновременным определением содержания этих нуклеотидов в печени крыс в динамике острого отравления газовым конденсатом. Получены новые данные об активности аденилаткиназы, АМФ-дезаминазы и б'-нуклеотидазы в печени и сыворотке крови крыс, подвергшихся действию газоконденсатной смеси.
Обнаружены специфические особенности функционирования ферментных систем обмена адениловых нуклеотидов в митохондриях и супернатанте печени отравленных животных. АТФ, как аллостерический эффектор АМФ-дезаминазы, в условиях in vitro повышает активность фермента в печени и снижает в сыворотке крови.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные расширяют имеющиеся представления о биохимических механизмах повреждающего действия газового конденсата на организм, а также о механизмах нарушения активности ферментных систем метаболизма адениловых нуклеотидов и содержания этих нуклеотидов в тканях при действии газоконденсата.
Обнаруженные ранние изменения (спустя 1 час — 1 сутки) активности исследуемых ферментов обмена адениловых нуклеотидов в сыворотке крови отравленных животных можно использовать в качестве индикаторов отравления данным токсикантом и применить их определение в целях практической медицины.
Данные, полученные в результате проведенных исследований, могут быть использованы при чтении лекций и проведении практических занятий по общей и клинической биохимии, токсикологической и экологической биохимии.
Полученные в диссертации результаты используются в учебном процессе Дагестанской государственной медицинской академии при чтении лекций по токсикологической и биологической химии. Результаты работы вошли в лабораторный практикум по биохимии (Махачкала, 2004 г.).
Химическая и токсикологическая характеристика газоконденсата и некоторые аспекты его влияния на организм
Углеводороды нефти издавна являются объектом широких и детальных эколого-токсикологических исследований во всем мире. Природный газ и его компоненты, в отличие от них, практически остались без внимания и вне сферы экологического анализа, контроля и регламентации. Научные публикации на эту тему очень редки, и современные знания о поведении углеводородных газов в атмосфере и в гидросфере и, особенно, об их действии на наземных животных и водных организмов, сообщества и экосистемы весьма ограничены. На всех этапах функционирования нефтегазового комплекса происходит непрерывное поступление в биосферу природного газа, продуктов его сгорания и газоконденсата. Газовый конденсат представляет собой жидкую смесь высококипящих углеводородов, в которой растворены газообразные углеводороды метан-бутановой фракции. Газоконденсаты, как и нефти, состоят из алканов, нафтенов и аренов, распределение которых в конденсатах имеет следующие особенности: 1. В среднем, абсолютное содержание аренов в бензиновых фракциях конденсатов выше, чем в нефтях; 2. Встречаются бензиновые фракции, в которых содержится одновременно большое количество аренов и нафтенов; 3. Между содержанием алканов и аренов в бензиновых фракциях существует обратная связь — чем больше алканов, тем меньше аренов; 4. Содержание разветвленных алканов ниже, чем р-алканов (Рудзитис, Фельдман, 1987; Богомолов, Гайле, 1989). К примеру, в химический состав Штокмановского газоконденсата входят фракции парафинов и нафтенов в следующем соотношении: высокомолекулярные - 54,3%, высоколетучие - 32,4%, моно- и полициклические ароматические соединения — 6,5%, производные углеводородов (гетероатомные соединения) — 6,8% (Борисов и др., 1994). При контакте с атмосферой и водной средой происходит (в течение нескольких суток и часов) испарение легколетучих фракций газоконденсата и соответствующее снижение его токсичности. Оставшиеся парафины, нафтены и ароматические соединения частично растворяются в воде, аккумулируются в почве и подвергаются процессам физико-химической и микробной деструкции и усвоении (Багаева, Чернова, 1994; Патин,1997; Кияшко, Фадеев, Фадеев, 2001; Багаева, Зинурова, 2004). Таким образом, газоконденсат по своему составу соответствует бензиновой или керосиновой фракции нефти и их смеси, следовательно, его токсичность и физические свойства можно сопоставить с аналогичными характеристиками для легких сортов нефти (Борисов и др., 1994).
В литературе преимущественно встречаются работы, посвященные изучению токсического влияния газоконденсата на водные организмы. Сообщения же по воздействию этого же токсиканта на наземных животных единичны. Минимальные действующие концентрации газоконденсата для организмов водной среды составляло 0,05 — 0,5 мг/л, а безопасный уровень для фитопланктона и наиболее чувствительных личиночных стадий развития зоопланктона, можно оценивать величиной порядка 0,01 мг/л (Кошелева и др., 1994).
По данным ММБИ гибель 50% взрослых литоральных гаммарусов происходила при концентрации газоконденсата 0,2 мл/л, а полная гибель -при 6,4 мл/л на протяжении всей экспозиции. Соответствующие величины ЛК5о для взрослых рыб и молоди семги (пестряток), были равны 0,1 и 0,05 мг/л (Борисов, и др., 1994). Концентрация газоконденсата 0,01 — 0,1 мл/л оказывало токсическое действие на первичную продукцию фитопланктона и деструкцию органических веществ. При концентрации газоконденсата 0,1 и 0,5 мл/л происходило нарушение нормального физиологического состояния фитопланктона, о чем свидетельствовало изменение физиологической взаимосвязи основных растительных компонентов: хлорофилла а и с (Гаранина, Костров, 2002). Газоконденсат вызывал изменение гематологических показателей периферической крови рыб. При концентрациях ОД - 0,2 мл/л наблюдалось снижение количества эритроцитов на 15 - 20 % и снижение концентрации гемоглобина на 20 % в крови воблы. У кефали, при концентрации 0,2 мл/л газоконденсата сначало происходило повышение количества эритроцитов на 23 % , затем наблюдался спад на 20 -30 %. Газоконденсат в концентрации 0,1 - 0,2 мл/л вызывал уменьшение количества эритроцитов у воблы к концу опыта на 28 - 33 % , соответственно. У кефали тоже отмечалась лейкопения по сравнению с контролем при концентрации газоконденсата 0,05, ОД и 0,2 мл/л и составляло 50, 55 и 62 % соответственно (Горбунова и др., 2001).
Исследования, проведенные КаспНИИРХ на вобле и кефали по изучению влияния газоконденсата на форменные элементы крови показало, что концентрации газоконденсата в диапазоне 0,05 - 0,2 мл/л вызывают изменения гематологических показателей, причем наиболее чувствительной к его действию оказалась кефаль. В концентрациях газоконденсата, превышающих ПДК, у подопытных рыб наблюдались количественные и качественные изменения показателей крови, что согласуется с данными и других авторов (Кошелева, Новиков, 1994).
Очень редки научные публикации по влиянию метана и его гомологов (составляющие компоненты газоконденсата) как на водных, так и на наземных животных. Тем не менее, существующие литературные источники акцентируют внимание на некоторые общие черты взаимодействия газообразных примесей с организмом рыб. Необходимо отметить относительную краткость латентной фазы (отрезка времени от момента контакта с ядом до появления первых симптомов отравления) и быстроту реагирования на появление токсического газа в водной среде, по сравнению с аналогичными реакциями на присутствие других растворенных в водной среде или взвешенных токсикантов. Эта особенность определяется быстрым проникновением в живые клетки, воздействующего на организм рыб газа, в начальной фазе контакта, что способствует быстрому поражению основных функциональных систем (дыхательной и нервной систем, кроветворения, ферментативной активности и др.). Внешне это проявляется изменением характера поведения (возбуждение, повышенная активность, рассредоточение в объеме воды и др.).
Хроническое отравление ведет к последующим нарушениям, которые являются следствием кумулятивных эффектов на уровне физиолого-биохимических процессов. Для всех рыб общим типом реагирования на присутствие газов в воде является газовая эмболия, которая возникает при перенасыщении воды различными газами и проявляется в разрыве тканей (особенно в плавниках и глазах), увеличении плавательного пузыря, нарушении кровеносной системы и в ряде других характерных патологических признаков (Патин, 1993).
В некоторых других работах отмечается, что метан легко проникает из водных растворов через кожу и обладает, в зависимости от концентрации, наркотическим или токсическим действием, в основе которого лежит гипоксия, резко усиливающаяся в присутствии этана, пропана, бутана и других гомологов этого ряда. Начальная стадия интоксикации метаном проявляется функциональными нарушениями со стороны центральной нервной и сердечно-сосудистой систем, с последующим прогрессированием нарушений этих систем и увеличением количества лейкоцитов в периферической крови. Последующие стадии сопровождаются органическими поражениями головного мозга, тканей сердца, желудочно-кишечного тракта, выраженным лейкоцитозом (Измеров, 1984).
Аденилаткиназа, АМФ-дезаминаза и 5-нуклеотидаза как ключевые ферменты обмена адениловых нуклеотидов. Структура и механизм действия
Ключевыми ферментами распада адениловых нуклеотидов являются аденилаткиназа, АМФ-дезаминаза и 5 -нуклеотидаза. Последние два фермента относятся к классу гидролаз. АМФ-дезаминаза (КФ 3.5.4.6), как и аденозиндезаминаза (КФ 3.5.4.4), действует на C-N-связи, отличные от пептидных в циклических амидинах; 5;-нуклеотидаза (3.1.3.5) действует на сложно-эфирные связи нуклеотидов.
Как известно, аденозиндезаминаза осуществляет гидролитическое дезаминирование аденозина до инозина с высвобождением аммиака. АМФ 36 дезаминаза катализирует гидролиз АМФ до ИМФ и свободного аммиака. Оба фермента обнаружены практически во всех тканях, но с различным распределением активностей в этих тканях. Адеиозиндезаминазой наиболее богаты лимфоидные и слизистые ткани, селезенка, щитовидная железа, мозг. Наибольшее содержание АМФ-дезаминазы обнаружено в скелетных мышцах, а также в печени (Диксон, Уэбб, 1982). АМФ-дезаминаза и аденозиндезаминаза сходны по ряду свойств. Аденозиндезаминаза играет важную роль в нервной и сосудистой системах, в созревании и дифференциации лимфоидных клеток. Врожденный дефицит аденозиндезаминазы (аутосомно-рецессивно наследуемый) приводит к синдрому тяжелого комбинированного иммунодефицита; отклонение уровня фермента обнаружено при различных заболеваниях аутоиммунной природы, при синдроме приобретенного иммунодефицита. АМФ-дезаминаза принимает участие в регуляции многих жизненно-важных процессов, в развитии и протекании нервно-мышечных и, возможно, иммунологических патологий (Лущак, 1996; Марданян и др., 2002). АМФ-дезаминаза представляет собой тетрамер с молекулярной массой протомеров 68 - 77 кДа. Молекулярная масса в нативных условиях составляет 261 - 272 кДа. Фермент содержит в активном центре около двух атомов цинка на мономер. Инкубация АМФ-дезаминазы с ЭДТА, связывающим ионы цинка, приводит к потере ее активности (Айрапетян и др., 1988). АМФ-дезаминаза регулируется концентрацией субстрата и изменением рН среды. Кроме того он активируется одновалентными катионами, АТФ, АДФ и ингибируется ГТФ, ИМФ и ионами фосфата. Варьирование рН в диапазоне 6,6 — 7,3 не приводит к изменению влияния АТФ, ГТФ и ИТФ на свойства АМФ-дезаминазы, а степень активирования фермента АДФ была чувствительной к рН. Специфическая активность АМФ-дезаминазы составляет 200 - 500 ед/мг белка. Активация фермента при закислении среды в физиологическом диапазоне происходит вследствие снижения Кт для субстрата. АМФ-дезаминаза из скелетных и сердечных мышц активируется Са2+-активируемой фосфолипидзависимой протеинкиназой. Фермент взаимодействует с миозином и фосфолипидными слоями, что также изменяет V 1 его свойства. АМФ-дезаминаза выделенная из белых мышц лосося была элекрофоретически гомогенной (Лущак, Стори, 1995). Аденозиндезаминаза из мозга гетерогенна как по заряду, так и по молекулярной массе. Отмечены две формы фермента различающихся по молекулярной массе. В тканях с высокой удельной активностью аденозиндезаминазы, как правило, доминирует низкомолекулярная форма (35 — 40 кДа). И наоборот, высокомолекулярная форма фермента (250 — 300 к Да) доминирует в тканях с низкой удельной активностью. В некоторых Г 1 тканях небольшую долю составляет промежуточная форма (110 кДа). Все эти формы фермента обычно взаимопревращаемы. В активном центре аденозиндезаминазы расположены гистидин, глицин, глутамат и аспартат, которые принимают участие, вместе с ионами цинка, в ферментативном дезаминировании аденозина (Марданян и др., 2002). Активный центр молекулы фермента содержит SH-группу, активную только в непротонированной форме. Существенными для каталитической активности фермента являются два остатка цистеина. Ч Зависимость скорости дезаминирования аденозина от его концентрации подчиняется закону Михаэлиса-Ментен. Величина Кт для аденозиндезаминазы в мозге близка к максимальной в широком диапазоне рН от 7,0 до 8,5. Ионы меди необратимо ингибируют активность фермента. Удельная активность очищенного фермента из серого вещества мозга при насыщающих концентрациях субстрата равна 5,6 мкмоль/ мин на 1 мг белка. Эта величина на 1-2 порядка ниже активности высокоочищенных препаратов, выделенных из более богатых ферментом тканей, но близка к величинам 9,6 и Г 2,5 мкмоль/мин на 1 мг белка, полученных для аденозиндезаминазы, очищенная соответственно, из больших полушарий мозга и скелетной мышцы быка (Шароян др., 1994). Механизм реакции, катализируемой аденозиндезаминазой и АМФ-дезаминазой в принципе сходен. Рентгеноструктурный анализ аденозиндезаминазы мышцы показал, что ион цинка контактирует с атакующим нуклеофилом воды, используя рибозу пурина как ингибитор переходного состояния. Поэтому предполагается, что цинк активирует молекулу воды для атаки АМФ (аденозина) в С-6 положении с заменой NH/j. Реакция идет с быстрым установлением равновесия между АМФ (аденозином) и ферментом в соответствии с моделью кинетики быстрого случайного равновесия. Максимальная активность требует протонированной и одной непротонированной группы со значениями рКа 6,4 и 7,7, соответственно. Индуцированный НгО сдвиг рКа для этих групп совпадает с карбоксил атом и гистидином, которые и находятся в контакте с рибозидом пурина в аденозиндезаминазе. Отношение профиля Vmax/Km для двух ферментов сходно, только значение рКа сдвинуто с 6,7 до 7,3 (Марданян и др., 1996; Марданян и др., 2002). -нуклеотидаза — интегральный белок плазматических мембран большинства эукариотических клеток, каталитический центр которого локализован на внешней поверхности мембраны. Фермент катализирует необратимое дефосфорилирование адениловой кислоты до аденозина и неорганического фосфата (Егуткин и др., 1990).
Определение содержания адениловых нуклеотидов
Исследование содержания кислорастворимых нуклеотндов в тканях мелких животных затруднительно, поскольку для определения этих веществ методом хроматографии требуется большое количество (20-50 г) материала. Методы бумажной и тонкослойной хроматографии полуколичественны, а ферментные требуют наличия дефицитных реактивов. Ионообменная хроматография позволяет разделить нуклеотиды с достаточным разрешением, то есть с хорошим разделением и выходом всех компонентов (Киреев и др., 1979). В связи с этим, для разделения и количественного определения адениловых моно-, ди- и трифосфатов мы избрали метод ионообменной хроматографии на колонке со смолой Дауэкс 1x8,200-400 меш (Киреев и др., 1979) в некоторой модификации (Нагиев, 2001).
Перед работой смолу Дауэкс 1x8,200-400 меш заливали 10-ю объемами воды (при всех операциях использовали только дистиллированную воду) и оставляли на ночь для набухания. Тонкую и грубую фракции, отделенные по скорости их осаждения отбрасывали. Воду сливали декантацией и промывали смолу 3 раза по 200 мл воды. Смолу, промытую водой, загружали в хроматографическую колонку, последнюю наполняли водой для вытеснения воздуха из всей её частей. После этого смолу промывали 5% щелочью до исчезновения хлора (контролировали при помощи AgNCb). Далее отмывали смолу от щелочи под контролем универсальной индикаторной бумаги. Затем смолу промывали 85% муравьиной кислотой и оставляли на ночь.
На следующий день отмывали смолу водой от кислоты, промывали метанолом (до бесцветной жидкости) и пропускали через колонку 7-кратный объем воды. Нужно следить, чтобы над смолой был постоянно слой жидкости не менее 5 мм. Перед работой смолу активировали 3 М раствором формиата натрия и промывали водой. Отработанную смолу не регенерировали, а выбрасывали, так как она загрязнена другими продуктами. Экстракция нуклеотидов и их хроматография. Животных быстро декапитировали, ткань печени фиксировали немедленным погружением в жидкий азот, затем извлекали и обрабатывали в замороженном состоянии. Это позволило предотвратить распад макроэргических соединений во время подготовки материала. Экстрагирующим и осаждающим реагентом служила хлорная кислота, естественное поглощение которой в ультрафиолете ниже, чем у трихлоруксусной кислоты (ТХУ), сильно поглощающей при 260 нм. 1 г печени растирали в предварительно охлажденной фарфоровой ступке в 2 мл холодного раствора 0,6 М хлорной кислоты и центрифугировали при 3000 Ч_ об/мин в течении 10 мин. Осадок повторно обрабатывали 0,2 М хлорной кислотой. Надосадочную жидкость нейтрализовали 10% раствором КОН, под контролем индикатора метилового красного и потенциометра; отделяли выпавший перхлорат калия, а экстракт наносили на колонку и подвергали анионообменной хроматографии. При прохождении экстракта, содержащего нуклеотиды, через колонку вся проба, окрашенная в красный цвет за счет метилового красного, фиксировалась в верхней части колонки. Применялся ступенчатый градиент элюции. Собирали фракции объемом 3,5 мл, поступающие с колонки со скоростью 12 мл/час. Были использованы Л следующие элюирующие растворы: а) вода, с которой выходили все нуклеозиды, так как у них нет остатков фосфорной кислоты и они не фиксировались смолой; б) после этого последовательно смывали нуклеотиды при помощи растворов муравьиной кислоты возрастающей концентрации. Количество отдельных нуклеотидов рассчитывали в мкмоль на 1 г ткани, используя молярные коэффициенты экстшщии. В соответствии с поставленными задачами объектом нашего внимания была адениловая группа нуклеотидов в связи с чем был произведен анализ всех основных форм адениловых нуклеотидов печени экспериментальных животных. 2.2.3. Определение активности ферментов метаболизма адениловых нуклеотидов Активность 5/-нуклеотидазы оценивали по приросту неорганического фосфата (Скулачев, 1962). Принцип метода заключается в превращении ортофосфата в присутствии молибдена в фосфомолибденовую кислоту, которая при наличии восстановителя (аскорбиновой кислоты) при рН 4,0 образует фосфорномолибденовый комплекс синего цвета. Ионы меди ускоряют развитие окраски и повышают чувствительность метода. Этот метод имеет высокую чувствительность, развивающая окраска стабильна длительное время, позволяет определить неорганический фосфат в присутствии лабильных органических фосфатов. Определение Ч. неорганического фосфата производили следующим образом. К 2 мл инкубационной смеси добавляли 6 мл 3,3% трихлоруксусной кислоты для прекращения реакции и разбавления инкубационной смеси, пробы перемешивали, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 минут для осаждения белков. Затем отбирали 0,1 мл ацетатного буфера (рН 4,0); 0,5 мл 1% аскорбиновой кислоты, приготовленного на 0,05 Н серной кислоте и 0,5 мл 1% аскорбиновой кислоты, приготовленной на 0,001 М CuS04. Смесь перемешивали, оставляли на водяной бане 10 мин при 25С и затем кол ориметриро вали на фотоэлектроколориметре ФЭК-М при красном Л светофильтре (кювета-10мм). Разница в содержании неорганического фосфата между контрольным и опытным пробами составляла величину прироста неорганического фосфата за время инкубации проб. Контрольные пробы реинкубировались и ТХУ добавляли раньше субстратов для ферментативных реакций. Количество неорганического фосфата определяли по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору фосфорнокислого калия. Активность З -нуклеотидазы выражали в мкг образовавшегося неорганического фосфата (Рі) на 1 мг белка, количество которого определяли микробиуретовым методом (Кочетов, 1980) за 60 мин инкубации. Активность АМФ-дезаминазы определяли спектрофотометрическим методом, основанным на уменьшении оптической плотности раствора при 265 нм после дезаминирования АМФ до ИМФ (Пеккель, 1980).
Влияние газоконденсата на содержание отдельных форм адениловых нуклеотидов в печени экспериментальных животных
На 15-е сутки после отравления концентрация АМФ увеличивается на 17 % по сравнению с десятыми сутками и на 33 % по сравнению с контролем. Количество АДФ через 15 суток после отравления повышается примерно на 25% по сравнению с предыдущим сроком исследования (10 сутки) и приближается к показателям контроля. Содержание АТФ в этот период наблюдений продолжает возрастать, однако остается заметно сниженной (77%) по сравнению с контрольными значениями. Некоторое возрастание АТФ возможно объяснить частичной реутилизацией АМФ - продукта дефосфорилирования АДФ.
Таким образом, данные представленные в таблице 6 демонстрирует усиление процесса дефосфорилирования адениловых нуклеотидов при отравлении газовым конденсатом, о чем свидетельствует существенное снижение суммарной концентрации аденилатов уже на 5-е сутки, а также преимущественное снижение концентрации АТФ и АДФ с одновременным увеличением количества АМФ в большинстве сроков исследования.
Влияние газового конденсата на активность ключевых ферментов метаболизма адениловых нуклеотидов в печени крыс в норме и после отравления газоконденсатом
Среди многочисленных ферментов обмена адениловых нуклеотидов наибольший интерес и важность представляют те из них, которые в естественных условиях нормальной жизнедеятельности обладают высокой активностью и в максимальной степени обусловливают течение реакций аденилового метаболизма, их регуляцию и переключение в зависимости от состояния и потребностей организма. Изучение нарушений их структуры и функции под влиянием различных токсикантов может углубить наши представления о биохимических механизмах токсического поражения и способствовать плодотворному поиску средств коррекции этого поражения. К числу таких ключевых ферментов аденилового метаболизма относятся, по нашим данным, АМФ-дезаминаза, 5/-нуклеотидаза и аденилаткиназа. Чтобы оценить закономерности, механизмы и возможную роль нарушений активности этих ферментов и аденилового метаболизма в целом при токсическом поражении организма, рассмотрим активность указанных ферментов в норме и при воздействии газокоііденсатиой смеси, Активность ферментов обмена адениловых нуклеотидов была исследована в субклеточных фракциях - митохондриях и постмитохондриальном супернатанте клеток печени.
Активность 5;-нуклеотидазы в митохондриях печени существенно выше, чем АМФ-дезаминазы (табл. 7). Кроме того, следует отметить, что активность АМФ-дезаминазы в митохондриях печени без аллостерического эффектора -АТФ не проявляется.
Только в присутствии АТФ в митохондриях печени заметно проявляется активность АМФ-дезаминазы, которая составляет 0,10 ± 0,03 мкг АМФ/мг белка. Активность 5 -нуклеотидазы в митохондриях печени обнаруживается и в присутствии аллостерического эффектора АТФ и без нее. Причем активность 5 -нуклеотидазы без АТФ в митохондриях печени составляет около 91% от активности фермента с АТФ. При сопоставлении величин активности аденилаткиназы в митохондриях и супернатанте печени обнаружено преобладание как прямой, так и обратной реакции в митохондриях печени, что согласуется с литературными данными (Criss, 1991). Так, в митохондриях печени активность прямой реакции равна 3,02; обратной - 0,32. В супернатанте активность прямой реакции составляет 1,26; обратной реакции - 0,25, то есть значительно ниже, чем в митохондриях (табл. 7, 8). Эти данные свидетельствуют о связи функции аденилаткиназы с процессом энергообеспечения клетки. В частности, в печени, где энергетические потребности клетки обеспечиваются в основном за счет интенсивно протекающего тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования (Северин и др., 2003), фермент наиболее активен в митохондриях. Кроме того, обращает на себя внимание тот факт, что активность прямой аденилаткиназной реакции существенно преобладает над обратной, особенно это выражено в митохондриях.
Так, в частности, активность прямой аденилаткиназной реакции в митохондриях печени более чем в 9 раз интенсивнее, чем обратной реакции в этих же субклеточных фракциях, а в супернатанте - более чем в 5 раз. Эти данные свидетельствуют о том, что в обычных условиях аденилаткиназа более интенсивно катализирует реакцию образования АДФ из АТФ и АМФ (АТФ + АМФ — 2 АДФ) и несколько меньше ее роль в пополнении уровня АТФ и АМФ из АДФ (2 АДФ АТФ + АМФ).
Данные по исследованию активности АМФ-дезаминазы и 5f-нуклеотидазы в постмитохондриальных супернатантах клеток печени крыс в норме представлены в таблице 8. Активность обоих исследуемых ферментов в отличие от митохондрий в супернатантах проявляется и в присутствии АТФ и без АТФ. Активность АМФ-дезаминазы в постмитохондриальном супернатанте клеток печени существенно выше по сравнению с митохондриями.
Похожие диссертации на Обмен адениловых нуклеотидов в печени крыс при действии газового конденсата
