Введение к работе
Актуальность проблемы. Большой интерес к изучению механизмов действия особого класса белков - «молекулярных шаперонов», основной функцией которых является участие в сворачивании полипептидных цепей в нативную структуру, вызван проблемами, связанными с процессами денатурации и агрегации белков вследствие нарушения их конформации при стрессорных воздействиях различного характера
Молекулярные шапероны обладают способностью взаимодействовать с развернутыми или неправильно свернутыми белками, что препятствует связыванию этих белков между собой и последующей агрегации Подобное взаимодействие приводит в конечном итоге к сохранению или восстановлению нативного состояния белков
Многообразие действия шаперонов велико они участвуют в различных внутриклеточных процессах, в том числе в котрансляционном фолдинге полипептидных цепей при их биосинтезе, транслокации белков через мембраны, включении индивидуальных белков в надмолекулярные структуры, они способствуют также солюбилизации агрегатов белков и их корректному рефолдингу
Исследования последних лет показали, что традиционные представления о сохранении биологически активной конформации белков в денатурирующих условиях не ограничиваются сведениями о защитных свойствах молекулярных шаперонов Процессы фолдинга могут осуществляться под действием системы шаперонов, входящих в состав мультишаперонной сети В эту сеть часто вовлекаются ферменты фолдинга (пептидил-пролил-цис-транс изомераза и протеиндисульфидизомераза) и различные шапероноподобные белки К этим белкам можно отнести тубулин, казеин, фактор ингибирования миграции макрофагов и др [Guha et al, 1998, Bhattacharyya, Das, 1999, Souza et al, 2000, Cherepkova et al, 2006] Кроме того, оказалось, что пептидные фрагменты известных шаперонов (протеиндисульфидизомеразы и альфа-кристаллина) и их синтетические аналоги проявляют шаперонные свойства [Puig et al, 1997, Deuerhng et al, 1999, Sharma et al, 2000, Manna et al, 2001] Было обнаружено также, что шаперонная активность присуща изолированным пептидным фрагментам (и их синтетическим аналогам) молекул некоторых белковых субстратов, в частности, дрожжевой алкогольдегидрогеназы [Bhattacharyya et al, 2003]
Несмотря на огромное число экспериментов, направленных на изучение защитной роли шаперонов, структурно-функциональные особенности, необходимые для характеристики белка как шаперона, не вполне ясны В соответствии с современными представлениями действие шаперонов осуществляется в результате их связывания с гидрофобными участками молекулы белкового субстрата, которые оказываются экспонированными наружу при нарушении пространственной структуры белка в состоянии стресса Однако, наряду с гидрофобными взаимодействиями, в образовании агрегатов участвуют химические связи, аналогичные тем, которые
стабилизируют белковую глобулу (вандерваальсовы силы, электростатические взаимодействия, водородные связи, дисульфидные связи и др ), которые весьма редко учитываются при изучении молекулярных механизмов действия шаперонов
В этой связи большой интерес вызывает исследование шапероноподобных свойств термостабильных гидрофобных белков, проявляющих способность к образованию амфифильной вторичной структуры Представляется целесообразным также исследование защитных функций пептидов и свободных аминокислот, содержащих заряженные боковые группы
Целью данной работы является исследование молекулярных механизмов защитного действия амфифильных белков и пептидов, предотвращающих агрегацию модельных белковых субстратов в состоянии стресса
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи
Выделить иммунофилин - низкомолекулярный (12 кДа) цитоплазматический рецептор иммуносупрессора FK506 (FK506-Binding Protein, FKBP12) из мозга быка в гомогенном состоянии
Исследовать шапероноподобную активность FKBP12 в тест-системе in vitro, основанной на торможении агрегации рекомбинантного инсулина человека, индуцированной дитиотреитолом (ДТТ)
Изучить молекулярные механизмы действия на кинетику агрегации белковых субстратов - малатдегидрогеназы из сердца свиньи (МДГ) и дрожжевой алкогольдегидрогеназы (АДГ) свободных аминокислот, содержащих положительно заряженные боковые группы (Arg, Lys и их аналоги), а также синтетических Arg- и/или Lys-содержащих пептидов -трипептида (Ala-Phe-Lys), дипептида (Arg-Phe) и аналогов пептидного антибиотика грамицидина
Проанализировать изменение состояния агрегатов, образовавшихся при тепловом стрессе, после снятия денатурирующего воздействия
Научная новизна и практическое значение работы. Впервые продемонстрированы шапероноподобные свойства иммунофилина FKBP12 из мозга быка При этом применен новый оригинальный метод выделения этого белка в гомогенном состоянии, основанный, главным образом, на обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) С помощью метода динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) показано, что шапероноподобная активность FKBP12 проявляется в концентрационно-зависимом уменьшении интенсивности светорассеяния и размеров (величины гидродинамического радиуса) аморфных агрегатов рекомбинантного инсулина человека
Новые свойства иммунофилина FKBP12 могут расширить представления о его иммунологических функциях, поскольку в механизмах действия иммуносупрессоров участвуют различные белки, биологически активная
структура которых может поддерживаться в присутствии FKBP12 [Snyder, Sabatini, 1995]
С использованием двух модельных систем термоагрегации АДГ и ДТТ-индуцированной агрегации инсулина показана способность свободной аминокислоты аргинина тормозить агрегацию белков в концентрациях, близких к физиологическим (0,1-10 мМ) Подавление агрегации наблюдали и в присутствии коротких Arg- или Lys-содержащих пептидов (Ala-Phe-Lys) и (Arg-Phe) Данные пептиды и аргинин могут быть предложены в качестве эффективных средств для повышения выхода биологически активных белков в биотехнологических процессах
В частности, проблемы, связанные с получением препарата рекомбинантного инсулина биотехнологическим путем и его длительным хранением, остаются в настоящее время актуальными В этой связи весьма перспективным представляется изучение механизмов стабилизации молекулы инсулина и предотвращения его агрегации
Практическое значение защиты инсулина от агрегации трудно переоценить Инсулин, который образует аморфные агрегаты при диссоциации А- и В-цепей в результате восстановления связывающих их S-S-мостиков, является одним из интереснейших объектов исследования Исследования защитной роли шапероноподобных белков, связывающих инсулин и предотвращающих его агрегацию, могут представлять интерес для нейроэндокринологии при разработке новых подходов к терапии некоторых нейродегенеративных заболеваний, в патогенезе которых участвуют факторы, вызывающие дисфункцию инсулина
Что касается аргинина, то учитывая его роль во многих метаболических процессах, участвующих в реализации иммунологических и эндокринных функций организма, способность этой аминокислоты влиять на конформацию белков может иметь большое значение при разработке подходов к терапии таких заболеваний как атеросклероз, диабет, сепсис и злокачественные опухоли
При исследовании синтетических аналогов пептидного антибиотика грамицидина с помощью турбидиметрии и ДЛС показано, что амфифильные пептиды, содержащие 27 и 21 аминокислотных остатков, а также пептиды Ala-Phe-Lys и Arg-Phe при определенных условиях проявляют способность ускорять термоагрегацию МДГ и АДГ Этим свойством обладает и низкомолекулярный (12 кДа) термостабильный белок, выделенный из мозга быка, - фактор ингибирования миграции макрофагов (Macrophage Migration Inhibitory Factor, MIF) Однако, несмотря на значительное увеличение размеров агрегатов, образовавшиеся белковые агрегаты оказывались способными к растворению Предполагается, что в начале развития процесса агрегации (при температурах, близких к физиологически допустимому уровню) эффекторы, обратимо связываясь с развернутым белком, стабилизируют его структуру После снятия денатурирующего воздействия повышается вероятность ренатурации белка В этом смысле исследуемые эффекторы могут играть шапероноподобную роль
Полученные данные, затрагивающие молекулярные механизмы ускорения/подавления агрегации белков с помощью амфифильных низкомолекулярных белков и пептидов, могут дать дополнительную информацию для разработки эффективных добавок с целью оптимизировать процесс фолдинга рекомбинантных белков, а также для создания лекарственных средств, способных предотвращать так называемые «конформационные» заболевания
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 9-ой Пущинской школе - конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005), на Международном симпозиуме "Молекулярные механизмы регуляции функции клетки" (Тюмень, 2005), на FEBS конгрессе (Будапешт, 2005), на научной конференции "Нейрохимия фундаментальные и прикладные аспекты" (Москва, 2005), на XVIII зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2006), на 21-й Объединенной конференции Международного и Американского Нейрохимических обществ (ISN/ASN) (Мексика, 2007)
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 печатных работ, в том числе 6 статей в ведущих российских и зарубежных журналах
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на страницах Список цитируемой литературы содержит наименований, в том числе на иностранных языках Иллюстративный материал содержит рисунков и таблиц
Сокращения, принятые в тексте. АДГ - алкогольдегидрогеназа, МДГ -малатдегидрогеназы, БСА - бычий сывороточный альбумин, ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография, ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние, ДС-Na - додецилсульфат натрия, ДТТ - дитиотреитол, ПААГ -полиакриламидный гель, A|lm - предельное кажущееся поглощение при t—»оо, DEAE - diethylaminoethyl, FKBP - FK506-binding protein, MIF - Macrophage migration inhibitory factor
