Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 12-63
- Общие сведения о пептидах инсулинового суперсемейства 12-15
- Регуляторные эффекты инсулина и пептидов инсулинового суперсемейства 15-18
- Участие аденилатциклазы и цАМФ-фосфодиэстеразы в реализации эффектов пептидов инсулинового суперсемейства 19-23
- Характеристика компонентов, участвующих в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства 23-24
- пептиды инсулинового суперсемейства 24-25
- рецептор 25-31
- G белки 31-33
- фосфатидилинозитол-3 киназа 33-34
- протеинкиназа С 34-35
- аденилатциклаза 35-37
- Участие АЦ сигнального механизма в регуляции функционально значимых клеточных процессов 37-43
- Роль АЦ сигнальной системы и цАМФ в митогенном действии пептидов инсулинового суперсемейства 43-51
- Регуляторное влияние цАМФ в реализации метаболических эффектов инсулиноподобных пептидов 51-55
- Ферменты углеводного обмена в в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных 55-61
-Эволюционный подход в изучении сигнальных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства 61 -62
- Участие АЦ сигнальной системы в реализации действия пептидов инсулиновой природы при сахарном диабете 62
- Задачи исследования 62-63
Материалы и методы исследования 64-92
- Объекты исследования 64-66
- Использованные в работе клеточные культуры 66
-культура клеток куриных миобластов 66-67
- получение культуры клеток куриных миобластов 67-68
- культура фибробластоподобных клеток линии Swiss ЗТЗ 69
-получение культуры фибробластоподобных клеток линии Swiss ЗТЗ 69-71
- культура клеток, трансформированная из нормальных фибробластов 71-72
- получение культуры клеток, трансформированных из нормальных фибробластов 72
- Выделение мембранных фракций 72
- получение мембранной фракции из тканей позвоночных и беспозвоночных 73-74
- получение грубой мембранной фракции (Р2) из клеточных культур 74
- выделение фракции, содержащей прымембранную форму ФДЭ 75
- Методы определения активности ферментов 76-84
- определение активности АЦ 76-77
- определение активности цАМФ-ФДЭ 77-79
- определение активности креатинкиназы 79-80
- определение активности ПКА 80-82
- определение активности ГС и Г-6ФДГ 82-84
- АДФ-рибозилирование мембранных препаратов 84
- Электрофорез в полиакриламидном геле 84-85
- Метод иммуноблотинга 85-86
- Метод поверхностного иммуноблотинга 86-87
- Условия действия гормонов, активаторов,
ингибиторов и бактериальных токсинов 87-90
- Метод определения белка 90
- Статистическая обработка результатов 91
- Использованные реактивы 91-92
Результаты исследования и их обсуждение... 93-207
- Влияние in vitro инсулина, ИФР-1 и ИПП на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных и в культурах клеток в разные временные сроки 93-98
- Влияние in vivo разных доз инсулина на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных в разные временные сроки 99-104
- АЦ активирующий эффект инсулина, ИФР-1
и ИПП при разных концентрациях в условиях in vitro 104-109
- Участие цАМФ-зависимой ФДЭ в механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства 109-112
- Использование антиинсулиновой сыворотки для доказательства специфичности АЦ стимулирующего эффекта инсулина 113-115
- Участие рецептора тирозинкиназного типа в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов
инсулинового суперсемейства 115-121
- Участие G-белков в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина 122-127
- Участие фосфатидилинозитол-3 киназы в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1 127-132
- Участие протеинкиназы С в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства 132-159
- Участие АЦ сигнальной системы в реализации ростстимулирующего действия инсулина в культуре клеток куриных миобластов 159-169
- Участие АЦ сигнального механизма в митогенном действии пептидов инсулиновой природы 169-179
- Участие АЦ сигнального механизма в антиапоптотическом действии инсулина и ИФР-1 179-18 9
- Влияние инсулина на активность Г6Ф-ДГ и ГС в мышечных тканях крыс, цыплят и моллюсков 189-194
- Влияние инсулина на активность ПКА 194-201
- Аденилатциклазных сигнальный механизм действия инсулина в скелетных мышцах крыс
при стрептозотоциновом диабете 201-207
Заключение 208-214
Выводы 214-216
Список литературы
- Участие аденилатциклазы и цАМФ-фосфодиэстеразы в реализации эффектов пептидов инсулинового суперсемейства
- Регуляторное влияние цАМФ в реализации метаболических эффектов инсулиноподобных пептидов
- получение культуры клеток куриных миобластов
- Использование антиинсулиновой сыворотки для доказательства специфичности АЦ стимулирующего эффекта инсулина
Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение гормональных сигнальных систем, участвующих в регуляции жизненно важных для организма клеточных процессов, является одной из актуальных проблем современной молекулярной эндокринологии и биохимии. К числу систем, осуществляющих реализацию регуляторного действия веществ гормональной и негормональной природы, относится аденилатциклазная сигнальная система (АЦС), которая представлена в клетке сложным трансмембранным комплексом, состоящим, по крайней мере, из трех молекулярных блоков. Необходимыми компонентами АЦС являются: рецепторы, способные воспринимать внеклеточные сигналы, гетеротримерные ГТФ-связывающие белки (G-белки) стимулирующего (Gs) или ингибирующего (Gi) типа, состоящие из трех субъединиц – , b, и обеспечивающие сопряжение между рецептором и третьим компонентом системы - ферментом аденилатциклазой (АЦ), катализирующей образование универсального внутриклеточного посредника – циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). При его участии осуществляется реализация целого ряда регуляторных эффектов в клетке (пролиферация, дифференцировка, апоптоз, синтез белка и др.).
К настоящему времени в литературе накоплен значительный объем данных, свидетельствующих об участии АЦС и цАМФ в трансдукции сигналов группы гормонов не пептидной природы (серотонин, адреналин, норадреналин и др.), осуществляющих свой эффект на клетку через рецепторы серпантинного типа, семь раз пронизывающие мембрану. В рамках настоящего исследования мы предприняли попытку выяснить возможность участия АЦС в реализации действия пептидов инсулинового суперсемейства, обладающих рецепторами тирозинкиназного типа, один раз пронизывающими мембрану клетки. До исследований, проведенных нами, участие системы АЦС-цАМФ в реализации действия гормонов инсулиновой природы практически отрицалось. В литературе имелись лишь отдельные сведения о влиянии инсулина, бомбиксина, релаксина на активность АЦ (Pertseva et al., 2003; Patel, 2004). Несмотря на успехи, достигнутые за последние десятилетия в изучении молекулярных механизмов действия инсулина и инсулиноподобных пептидов, многие аспекты плейотропного действия этого гормона и родственных ему пептидов до сих пор остаются невыясненными (Pertseva et al., 2003; Телкова, 2005). В связи с этим изучение ранее неизвестных молекулярных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства, насчитывающего в настоящее время около 50 представителей, относится к числу актуальных проблем современной эндокринологии. Согласно современным представлениям, инсулин и родственные ему пептиды играют ключевую роль в регуляции ряда клеточных процессов – клеточный рост, апоптоз, метаболизм. Эти пептиды имеют общее эволюционное происхождение, так как возникли в ходе эволюции из общего анцестрального гена в результате дупликации и последующей дивергенции образовавшихся генетических линий, сохранив при этом структурное и функциональное сходство (Murray-Rust et al., 1992; Chan et al., 1992).
К изучению участия АЦС в реализации действия гормонов и ростовых факторов инсулиновой природы лаборатория приступила в начале 90-х годов. Отправной точкой послужили данные, впервые полученные нами, о способности инсулина и родственных пептидов активировать ГТФ-зависимым образом АЦ в мышечных тканях млекопитающих и моллюсков (Plesneva et al., 1994). Мы использовали эволюционный подход, предложенный Л.А. Орбели (1958) применительно к эволюционной биохимии, который включал исследования в филогенезе, онтогенезе и при патологии. Было изучено: 1) влияние на АЦС инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) позвоночных и инсулиноподобного пептида (ИПП) беспозвоночных (моллюск Anodonta cygnea; 2) влияние на АЦС пептидов в тканях-мишенях животных разного филогенетического уровня (позвоночные – крысы, птицы и беспозвоночные – моллюски); 3) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС в онтогенезе (в тканях куриных эмбрионов разного возраста и у цыплят); 4) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС при экспериментальном диабете у позвоночных и беспозвоночных.
Цель работы. Доказать участие аденилатциклазной сигнальной системы в реализации регуляторных эффектов инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска в клетке и расшифровать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма их действия в тканях позвоночных и беспозвоночных, а также установить роль АЦ сигнального механизма в регуляции фундаментальных клеточных процессов – клеточный рост, апоптоз.
Задачи исследования
1. Исследовать действие инсулина, ИФР-1 и ИПП, выделенного из висцеральных органов моллюска Anodonta cygnea (Русаков и др., 1991), на АЦС в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных. Охарактеризовать зависимость эффекта от времени и концентрации исследуемых пептидов, а также от присутствия гуаниновых нуклеотидов для подтверждения вовлеченности в АЦ сигнальный механизм гетеротримерных G-белков.
2. Исследовать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма, опосредующего эффекты пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных и выяснить последовательность этапов передачи регуляторных сигналов этих пептидов на АЦС. С этой целью: а) установить тип рецепторов и G-белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия пептидов, используя ингибиторы рецепторных тирозинкиназ и метод АДФ-рибозилирования бактериальными токсинами; б) выявить участие фосфатидилинозитол-3 киназы (ФИ-3-К), используя специфичный ингибитор вортманнин; в) идентифицировать изоформу протеинкиназы «С» (ПКС); используя ингибиторы ПКС и моноклональные антитела к изоформам ПКС.
3. Исследовать участие АЦ сигнального механизма действия инсулина и ИФР-1 в регуляции процессов клеточного роста и апоптоза, исходя из гипотезы о важной роли цАМФ в регуляции фундаментальных процессов в клетке (Перцева, 2000).
4. Исследовать функциональные нарушения в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства при эндокринной патологии – сахарный диабет 1-го и 2-го типов.
Научная новизна.
Впервые обнаружено стимулирующее действие инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска A.cygnea на активность АЦ. Показано участие рецепторной тирозинкиназы и установлена вовлеченность G-белков (Gi) и (Gs) типа в реализацию активирующего действия этих пептидов на АЦ. Впервые показано, что в проявлении АЦ стимулирующих эффектов инсулина и ИФР-1 участвуют ФИ-3-К и изоформы ПКС - ПКСz и возможно ПКС.
В мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных обнаружен ранее неизвестный АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 и установлена его структурно-функциональная организация, представленная в клетке следующей сигнальной цепью: рецептор тирозинкиназного типа Gi-белок (b-димер) ФИ-3-К ПКСz (позвоночные) или ПКС (беспозвоночные) Gs-белок АЦ цАМФ протеинкиназа «А» (ПКА) эффекторные системы. Этот механизм отличается по числу сигнальных блоков от известного АЦ сигнального механизма действия гормонов, обладающих рецепторами серпантинного типа, представленного в клетке следующей цепью: рецептор серпантинного типа G-белок (Gi или Gs) АЦ цАМФ ПКА эффекторные системы.
Следует отметить, что действие пептидов инсулиновой природы на АЦ в мышечной ткани моллюска осуществляется через АЦ сигнальный механизм, сходный с таковым позвоночных, но имеющий на пострецепторных этапах трансдукции гормонального сигнала отличие на уровне ПКС. Исходя из результатов нашего исследования, в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных принимает участие ПКС, а у беспозвоночных (моллюски), как предполагается, – ПКС.
Экспериментально подтверждена, выдвинутая нами гипотеза, о важной роли АЦ-цАМФ в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на фундаментальные процессы в клетке. Показано участие АЦ-цАМФ системы в способности ИФР-1 и инсулина стимулировать клеточный рост и ингибировать апоптоз в культурах фибробластоподобных клеток.
Обнаружены нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина при патологии (сахарный диабет 1-го и 2-го типов).
Теоретическое и практическое значение работы.
Теоретическое и практическое значение работы определяется важной ролью инсулина и других пептидов инсулинового суперсемейства в организме высших и низших животных. Обнаружение новых сигнальных механизмов действия пептидов этой группы, в частности инсулина и ИФР-1, расширяет современные представления о спектре сигнальных систем, участвующих в регуляторном действии пептидов инсулинового суперсемейства.
Применение эволюционного подхода (изучение ряда эволюционно-родственных пептидов и использование представителей позвоночных и беспозвоночных) позволило выявить консервативность обнаруженного АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулиновой природы.
Данные, полученные на беспозвоночных, могут быть полезны для понимания сигнальных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и для разработки моделей эндокринной патологии у человека (сахарный диабет) в рамках нового направления - «эволюционная биомедицина» (Перцева, 2006).
Полученные данные о молекулярных механизмах действия инсулина и ИФР-1 имеют фундаментальное значение и могут применяться при чтении курса лекций в университетах и медицинских ВУЗах как в России, так и за рубежом.
Результаты исследования имеют важное практическое значение в плане выявления молекулярных основ этиологии и патогенеза сахарного диабета, а также в создании новых подходов для диагностики этого заболевания. Обнаруженный нами АЦ сигнальный механизм действия инсулина, может служить основой для разработки биохимического теста, позволяющего проводить диагностику нарушения отдельных звеньев в молекулярном механизме действия инсулина.
Положения, выносимые на защиту
1. Впервые установлено, что пептиды инсулинового суперсемейства (инсулин, ИФР-1 и ИПП моллюска Anodonta cygnea) ГТФ-зависимым образом активируют АЦ в тканях позвоночных (млекопитающие, птицы) и беспозвоночных (моллюски) животных.
2. Реализация АЦ активирующего действия пептидов инсулиновой природы осуществляется через обнаруженный нами АЦ сигнальный механизм, включающий следующую сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок (-димер) ФИ-3-К ПКСz Gs-белок АЦ.
3. С участием АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, осуществляется регуляторное действие пептидов инсулиновой природы на фундаментальные клеточные процессы - стимулируется клеточный рост и ингибируется апоптоз.
4. При эндокринной патологии (сахарном диабете 1-го и 2-го типов) нарушается функционирование АЦ сигнального механизма действия гормонов инсулиновой природы в основном на уровне Gs-белка и его сопряжения с АЦ.
5. Сходство структурно-функциональной организации АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных животных свидетельствует об его эволюционной консервативности.
Апробация работы
Основные результаты и положения работы были представлены и доложены на следующих конференциях и съездах: 17-я, 19-я, 20-я, 21-я Конференции Европейского Общества Эндокринологов (Кордова, Испания, 1994; Нидерланды, 1998; Фаро, Португалия, 2000; Бонн, Германия, 2002); 4-й Симпозиум по нейробиологии моллюсков (Амстердам, Нидерланды, 1994); Симпозиум по инсулину, ИФР-1 и инсулиноподобным пептидам (Испания, Барселона, 1997); XXXIII Международный конгресс физиологов (Санкт-Петербург, 1997); 2-й съезд Биохимического Общества РАН (Москва, 1997); XVII съезд физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998); конференция “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (Пущино, 1998); Съезд Биохимического общества Университета Глазго (Глазго, Великобритания, 1999); 18-ый Международный конгресс биохимиков и молекулярных биологов (Бирмингем, Англия, 2000); 3-я и 4-я Международные конференция по релаксину и родственным пептидам (Брум, Австралия, 2000; Виоминг, США, 2004); XVIII Съезд Физиологического Общества имени И.П. Павлова, Казань, 2001); XI, XII и XIII Международные совещания по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996; 2001; 2006); Международная Европейская конференция (Люксембург, 2002); Вторая конференция “Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии”, посвященная 80-летию со дня рождения М.Г. Колпакова. (Новосибирск. Октябрь, 2002); 1-й съезд Общества Клеточных Биологов (Санкт-Петербург, 2003); Физиологический съезд (Екатеринбург, 2004); 1-й Съезд физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005);
Публикации. По теме диссертации опубликовано 75 работ, в том числе 36 статей в рецензируемых отечественных и международных изданиях.
Личный вклад автора – Экспериментальные данные получены лично автором или при его непосредственном участии.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 259 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 285 источников. Работа иллюстрирована 43 рисунками и 35 таблицами.
Участие аденилатциклазы и цАМФ-фосфодиэстеразы в реализации эффектов пептидов инсулинового суперсемейства
Первые исследования эффекта инсулина на уровень цАМФ в различных клетках касаются середины 60-х. Основным обнаруженным фактом было снижение цАМФ в тканях млекопитающих (Park et al., 1967; Robison, Park, 1970). Также были получены многочисленные данные о том, что инсулин является антагонистом гормонов, которые увеличивают уровень цАМФ. Этот инсулиновый эффект был обнаружен в результате изучения продукции цАМФ стимулированной гормонами -катехоламинами, глюкагоном и другими (Butcher, Sutherland, 1967; Butcher et al., 1968; Manganiello et al., 1971). Согласно работам авторов (Butcher et al., 1966; 1968) снижение внутриклеточного уровня цАМФ является одним из механизмов, обеспечивающих реализацию действия инсулина. Другим авторам не удалось обнаружить какого-либо влияния низких физиологических концентраций инсулина на базальный и гормон-стимулированный уровень цАМФ (Butcher et al., 1968; Sneyd et al., 1967; Kono, Barham, 1973; Fain, Rosenberg, 1972; Jarett et al., 1972).
Обнаружение участия аденилатциклазы (АЦ) - фермента, катализирующего образование цАМФ, послужило толчком для серии исследований, посвященных изучению эффекта инсулина на этот фермент. В большинстве случаев инсулин оказывал ингибирующий эффект или не оказывал никакого эффекта на активность АЦ (Нерр, 1971, 1972; Illiano, Cautrecasas, 1972; Kono, Barham, 1973). При концентрации ЮцМ и выше инсулин снижал активность АЦ в мембранах печени крысы (Ray et al., 1970), и тканях семменников (Giudicelli et al., 1972). В печени мышей инсулин подавлял как базальную, так и глюкагон-стимулированную АЦ активность и не оказывал влияние на активность цАМФ-фосфодиэстеразы (Нерр, 1971, 1972).
Иллиано и Кутрикайзаз (Illiano, Cuatrcasas, 1972) были первыми, кто предположил участие АЦ системы в механизме действия инсулина. Они обнаружили, что инсулин ингибирует активность АЦ предварительно стимулированную эпинефрином (адреналином) и глюкагоном в мембранах клеток печени, а также кортикотропным гормоном в гомогенате жировых клеток. Полученные данные о том, что инсулин регулирует активность некоторых форм цАМФ-фосфодиэстераз (цАМФ-ФДЭ) позволили предположить, что снижение уровня цАМФ вероятно связано не с прямым действием гормона на АЦ, но с активацией цАМФ-ФДЭ, которая ответственна за гидролиз цАМФ (Loten, Sneyd, 1970; Exton et al., 1971; Houslay, 1986). Было выявлено, что инсулин активирует, по крайней мери, изоформы ФДЭ в клетках печени: периферическую, т.е. примембранную ФДЭ и ФДЭ "плотных везикул" (обе являются высоко-аффинными формами, связанными с плазматической мембраной) (Houslay, 1986, 1990, 1991 a,b; Houslay et al., 1984).
Полученные в этот период данные преимущественно касались обнаружения ингибирующего влияния инсулина на АЦ. Это дало возможность предположить, что гетеротримерные G-белки ингибирующего типа, непосредственно взаимодействующие с инсулиновым рецептором, могут быть потенциальными участниками передачи инсулинового сигнала. Сопоставление имеющихся данных (Tepperman, 1981; Makino et al., 1992) позволило заключить, что инсулин осуществляет негативное действие на уровень цАМФ, ингибирует АЦ и/или активирует цАМФ-ФДЭ активность. Таким образом, с этого времени сложилось мнение, что снижение уровня цАМФ является основным механизмом действия инсулина с участием системы АЦ-цАМФ-ФДЭ. Этот взгляд на проблему недолго оставался единственным.
Некоторые исследователи вообще не обнаружили никакого влияния инсулина на активность АЦ в различных тканях млекопитающих (Allen, Clark, 1971; Нерр, 1972; Golder, Boyns, 1973).
В 60-80 годы появились скудные данные о стимулирующем действии инсулина на АЦ активность или на уровень цАМФ. Впервые наблюдали увеличение цАМФ в ответ на действие инсулина Голдберг и соавторы (Goldberg et al., 1967). Введенный in vivo инсулин (2-4 Е/кг) приводил к быстрому увеличению уровня цАМФ (36-78%) в скелетных мышцах крысы. Помимо этого, инсулин оказывал стимулирующее влияние на базальную активность АЦ и ингибирующее действие на ФДЭ в мозгу крыс (Hetenyi, Singhal, 1973). При инкубации жировых клеток крысы с инсулином, он вызывал потенцирующее (усиливающее) действие на стимулирующий АЦ совместный эффект адреналина и теофиллина (Fain, 1975). Позже было показано (Kramer et al., 1990) увеличение уровня цАМФ в культуре клеток матки новорожденных макак {rhesus monkey) при инкубации их с инсулином (200нг/мл).
Регуляторное влияние цАМФ в реализации метаболических эффектов инсулиноподобных пептидов
В настоящее время в литературе имеются данные, подтверждающие нашу идею. Было показано в некоторых исследованиях, что цАМФ осуществляет ингибирующее влияние на реализацию некоторых метаболических эффектов инсулина и ИФР-1. Увеличение уровня цАМФ в адипоцитах, индуцированное различными агентами приводило к снижению клеточной реактивности к метаболическому действию инсулина и его антилиполитическому эффекту (Wesslau et al., 1993). Накопление цАМФ также снижает клеточную реактивность к стимулирующему действию инсулина на транспорт глюкозы. Авторы (Wesslau et al., 1993) делают заключение о ключевой роли уровня цАМФ в модуляции чувствительности к инсулину клеток мишеней и в частности ингибированию трансдукции метаболических эффектов инсулина. Здесь цАМФ является антагонистом метаболического действия инсулина. Изучение двух серин/треонин-специфических протеин фосфатаз (РР-1 и РР-2А), ответственных за регуляцию активности ферментов метаболизма гликогена, способность цАМФ предотвращать инсулиновые эффекты на фосфатазы в культуре клеток скелетных мышц крысы была выявлена (Srinivasan and Begum, 1994; Begum and Ragolia, 1996; Brady, Saltiel, 2001). Было также сделано предположение, что уровень цАМФ является оценкой эффекта на инсулиновую регуляцию метаболизма гликогена и опосредуется через митоген-активируемый протеинкиназный каскад.
Наша гипотеза нашла подтверждение в исследованиях (Ito et al., 1997), показывающих что цАМФ способен как подавлять инсулин-активируемый эффект на транспорт амино кислот и синтез гликогена в гепатоцитах крысы, так и потенцировать влияние инсулина на синтез ДНК (митогенный эффект), который с нашей точки зрения реализуется через АЦ сигнальный механизм и цАМФ.
Теперь позволим себе сформулировать нашу гипотезу в целом (Перцева, 2000). Согласно текущему потоку информации (Saltiel, 1996), плейотропное действие инсулина на клеточные процессы и функции реализуется через сеть сигнальных путей, которые вероятно расходятся на рецепторной и ранних пострецепторных стадиях гормональной сигнальной трансдукции. Данные, свидетельствующие о существовании различий между сигнальными путями, ответственными за митогенное и метаболическое действие инсулина было обсуждено выше. Теперь вопрос состоит в том, что является ответственным за выбор инсулинового сигнального пути (сигнального пути реализации инсулинового сигнала в каждом отдельном случае, какие механизмы и факторы вовлекаются в эти процессы в клетке).
Хотя вопросы остаются открытыми, механизмы переключения трансдукции гормональных сигналов с одного пути на другой (исключая один и начиная другой) в настоящее время весьма актуальны. Мы постулировали, что один из таких механизмов может быть - АЦ сигнальным механизмом. Открытый нами аденилатциклазный сигнальный механизм действия инсулина и инсулиноподобных пептидов, позволил выдвинуть гипотезу о том, что через него осуществляется, прежде всего, митогенное, нежели метаболическое влияние гормонов инсулинового сперсемейства. Дальнейшая дешифровка АЦ сигнального механизма на основе накопленных данных, подтверждало нашу гипотезу: во-первых, АЦ сигнальный механизм и цАМФ вовлекаются не только в митогенное, но также в антиапоптотическое действие инсулина и инсулиноподобных пептидов, и, во-вторых, АЦ сигнальный механизм является ответственным за негативную регуляцию метаболического эффекта инсулина, но не за его реализацию. В действии пептидов инсулинового суперсемейства АЦ сигнальный механизм и цАМФ способны, со всей вероятностью, осуществлять координирующую функцию регуляции большинства важных клеточных процессов
получение культуры клеток куриных миобластов
ДАТ, является природным активатором, а ФМА синтетическим активатором изоформ ПКС, принадлежащим к классическим (сПКС) и новым (пПКС) изоформам ПКС. Эти соединения не оказывают никакого эффекта на атипичную, форбол-нечувствительную изоформу ПКС (аПКС), к которым принадлежит аПКС. Активирующий эффект ДАГ и ФМА вероятно реализуется через общий механизм, ответственный за высоко селективное увеличение сродства ПКС к мембранам, содержащим фосфатидилсерин.
Кальфостин С представляет собой периленквинон, изолированный из Cladosporium cladosporioides. Он является потенциальным селективным ингибитором ПКС, демонстрирующим в 1000-раз большую ингибирующую способность в отношении этого фермента, чем таковую способность выявленную для других протеинкиназ. Механизм ингибирования ПКС кальфостином С, как полагают, происходит при его фотоактивации, в результате чего образуется короткоживущее соединение, которое взаимодействует с цистеин-богатыми цинксодержащими структурами в регуляторном домене ПКС. Это приводит к необратимой инактивации ПКС.
Вортманнин (изолированный из Т. wortmannii) является метаболитом грибков и действует как потенциальный селективный и необратимый ингибитор ФИ-З-К. Механизм его действия заключается в блокировании активности ФИ-З-К в результате прямого взамодействия с каталитической субъединицей фермента. Вортманнин также ингибирует другие киназы, такие как киназа легких цепей миозина и ФИ-4-К, но при концентрации в 100 раз более высокой чем требуется для ингибирования ФИ-З-К.
Эффекты инсулина и ИФР-1 в присутствии перечисленных выше активаторов и блокаторов были исследованы in vitro. При этом агенты добавлялись в пробы для определения активности АЦ. Инсулин растворяли в 0.01 N НС1 и доводили до нужной концентрации буферным раствором, используемым в экспериментах. Серотонин и изопротеренол растворяли в Tris-HCl (рН 7.5). ДАГ, ФМА, кальфостин С растворяли в ДМСО, а затем разбавляли 50 мМ Tris-HCl (рН 7.5) непосредственно перед использованием. Активаторы и блокаторы были преинкубированы с пробами в течение 10 мин (ДАГ, ФМА, кальфостин) и в течение 5 мин (вортманнин), после чего следовало добавление инсулина или других гормонов (серотонин, изопротеренол) в концентрациях вызывающих максимальный АЦ стимулирующий эффект. Продолжительность действия инсулина была ограничена 2.5 мин, т.е. временем достаточным для проявления его максимального эффекта на АЦ. В случае серотонина или изопротеренола продолжительность их действия была ограничена 10 мин. Пробы, обработанные таким же образом, не содержащие гормонов, активаторов и блокаторов, но содержащие среду, в которой эти агенты растворялись служили как контроль.
Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури (Lowry et аі., 1951). В качестве стандарта использовали раствор сывороточного альбумина быка (1мг/1мл). Сущность метода заключается в том, что при взаимодействии белка с солями меди в щелочной среде образуются соединения, восстанавливающие реактив Фолина. Интенсивно развивающаяся окраска пропорциональна содержанию белка в пробе.
Статистическая обработка результатов Данные в таблицах и рисунках представлены как mean±SEM в виде среднеарифметического значения и ошибки среднего. В случае построения кривых каждая точка являлась результатом, как минимум, трех измерений, повторенных в трех, четырех экспериментах. Различия между контрольными пробами и пробами, подвергнутыми воздействию гормонов без или в присутствии активаторов и ингибиторов были обработаны статистически с использованием анализа данных по компьютерной программе (ANOVA). Достоверность различий средних значений оценивали по ^-критерию Стъюдента. На всех рисунках и таблицах различия между контрольными пробами и пробами, содержащими гормоны или другие агенты (стимуляторы, ингибиторы) являются достоверными при J9<0.05.
Использованные реактивы и радиоактивные препараты Все использованные в работе препараты получены из фирмы Sigma (StLouis, МО, USA). Креатинфосфат, фосфокреатинкиназа, ГТФ, ГИДФ, Tris-HCl, нейтральная окись алюминия по Брокманну для колоночной хроматографии, АТР, цАМР, НАД, НАДФ, тимидин, дитиотрейтол, ЭДТА, имидазол, ДАГ, ФМА, вортманнин, коклюшный токсин (КТ), холерный токсин (XT) получены из фирмы Sigma (St.Louis, МО, USA).
В работе использовался инсулин млекопитающих (24 Ш), полученный из фирмы Lilly Co. (Indianapolis, IN, USA) или из фирмы Sigma (St.Louis, МО, USA); ИФР-І человеческий, рекомбинантный, полученный из фирмы Amersham (Backinghamshire, England) или из фирмы Sigma (St.Louis, МО, USA).
Радиоактивные препараты - [8-3Н]цАМФ, [сс-32Р]АТР получены из фирмы "Изотоп" (Санкт-Петербург, Россия) или из фирмы "Amersham" (Англия).
В работе использовались антитела к Протеинкиназе «С» zeta (зета) из кролика, полученные на С-концевой вариабельный (V5) фрагмент (557-592 аминокислоты) из фирмы "Sigma" (St.Louis, МО, USA). Разведение для иммуноблоттинга, рекомендованные в литературе -1:20000. Мы использовали для проведения молекулярных исследований разведение препарата - 1:10000; и в опытах in vitro при исследовании активности АЦ в пробах - 1:1000.
Использование антиинсулиновой сыворотки для доказательства специфичности АЦ стимулирующего эффекта инсулина
На основании этого можно судить о существовании разного спектра изоформ ПКС в исследованных тканях позвоночных и беспозвоночных. У млекопитающих (крысы) четко выявляется ПКСС,, принимающая участие в реализации действия пептидов инсулинового суперсемейства.
Согласно данным литературы, мышцы моллюска обладают иным набором ПКС (Sossin et al., 1996) и в АЦ стимулирующем действии этих пептидов инсулинового суперсемейства, по-видимому, участвует другая изоформа ПКС, близкая по своим свойствам к ПКСє из мозга позвоночных или подобная ПКС .изоформа, которая встречается у амфибий Хепорш laevis (Dekker L.V. and Parker P.J., 1995)
В целях выяснения роли различных протеинкиназ "С" в передаче инсулинового сигнала исследовали процесс активации АЦ в присутствии диацилглицерина и его липидорастворимого аналога - форболового эфира (форбол-12-миристат-13-ацетата). Для выявления участия разных форм протеинкиназы «С» в инсулин-регулируемой аденилатциклазной системе изучали влияние активаторов протеинкиназы "С" на различных уровнях передачи сигнала: 1) на уровне каталитической активности фермента -собственно аденилатциклазы; 2) на уровне функционального сопряжения аденилатциклазы с Gs-белками, оцениваемого по стимулирующему эффекту на фермент негидролизуемого аналога ГТФ гуанилилимидодифосфата; и 3) на уровне рецептора-тирозинкиназы путем запуска инсулином всей аденилатциклазной сигнальной системы.
Для решения вопроса, является ли влияние активированной протеинкиназы "С" на аденилатциклазную систему гормон- и рецептор-специфичным, изучали действие активаторов протеинкиназы "С" на аденилатциклазную систему, регулируемую биогенными аминами (серотонином - в случае моллюска, изопротеренолом - в случае крысы) через рецептор серпантинного типа. Наряду с процессом трансдукции стимулирующего гормонального сигнала через аденилатциклазную систему, исследовали процесс передачи через нее и ингибирующего сигнала, вызываемого изопротеренолом в гладких мышцах моллюска (Pertseva et al., 1992), в условиях активации протеинкиназы "С".
В отличие от большинства работ, посвященных рассматриваемой проблеме (Lin, Roth, 1994; Liu, Heckman, 1998; Lin et al., 1999; 2000), наши исследования (Плеснева и др., 2001; Plesneva et al., 2001) проведены не на целых клетках, а на мембранных фракциях, выделенных из мышечных тканей крысы и моллюска. Выбор мембранных препаратов был продиктован следующими причинами: во-первых, тем, что именно с плазматической мембраной связаны основные компоненты аденилатциклазной сигнальной системы, чувствительной к инсулину, биогенным аминам и другим гормонам (гормональный рецептор, аденилатциклаза, G-белки), о чем свидетельствует отчетливая активация аденилатциклазной системы в ответ на добавление гормонов к мембранным фракциям тканей (Berra et al., 1993; Pertseva et al., 1996; Pertseva et al., 1995); во-вторых, согласно данным литературы (Avignon et al., 1995; Berti et al., 1994; Lai et al, 1997; McKenna et al., 1995; Yamada et al., 1995) в мембранных фракциях разных клеток и тканей (в том числе мышечной) присутствуют в базальном (нестимулированном) состоянии ряд изоформ протеинкиназы "С", регулируемых инсулином, в частности, протеинкиназа "С" а, р, 5, є, и 0, и атипичная протеинкиназа "С" . Таким образом, оба партнера, взаимодействие которых исследуется, присутствуют в одной и той же клеточной фракции. И, наконец, в-третьих, использование мембранного препарата, в отличие от целых клеток, имеет некоторые преимущества. Оно дает возможность изучать взаимодействие аденилатциклазной и протеинкиназа"С"-зависимых сигнальных систем на уровне мембраны без участия внутриклеточных процессов, в частности, транслокации протеинкиназы "С", т.е. в более упрощенном виде. Такой подход может облегчить анализ и интерпретацию получаемых фактов. В пользу правомочности использования препарата плазматических мембран для указанной цели свидетельствуют результаты исследований ряда авторов (Lai et al., 1997; McKenna et al., 1995), выявивших взаимодействие между гормонрегулируемой аденилатциклазной сигнальной системой и протеинкиназой "С" в мембранной фракции некоторых тканей и клеток.
