Введение к работе
Актуальность проблемы. Направленное уничтожение клеток определенного типа является одной из важных задач этнотрошюй терапии различных заболеваний. Идея о возможности направленного уничтожения чужеродных клеток в организме "магическими пулями", представляющими собой токсические вещества, связанные с носителями, была высказана еще в начале века П. Эрли-хом (Ehrlich Р., 1956) и получила развитие в 70-е годы благодаря изучению механизмов действия растительных и бактериальных токсинов, лекарственных препаратов, разработке методов ковалентного копъгогирования белков и получению высокоенсцифичных конъюгатоп антител.
Цитотоксипы направленного действия - это особый тип фармакологических препаратов, позволяющий избирательно убивать клетки-мишепи. Они представляют собой гибридные молекулы, или копъюгаты, состоящие из ковалентно связанных токсического и адресного фрагментов, причем последний обеспечивает направленную доставку токсина к кдеткс-мишепи (LoBuglio & Salch, 1992). В качестве адресного фрагмента пнтотоксинов обычно используют лекгипы, гормоны, антитела и их Fab-фрагмшта. В качестве токсических фрагментов используют токсины растительного и бактериального происхождения (абрин, рицин, модецип). Кроме того, широко исследуется направленная доставка к клеткам-мишеням фермента тивно-активпых веществ (например, глгакозоок-сидазы, генерирующей перекись водорода), лекарственных препаратов, таких как антимстаболиты (мстотрсксат), алкилирующис агенты (хлорамбуцил), некоторые антибиотики.
Однако разрабатываемые до последнего времени цитотоксипы направленного действия обладают высокой молекулярной массой. В литературе имеются примеры использования пизкомолскулярных веществ в качестве токсических частей конъюгатоп с адресными фрагментами белковой природы, но практически отсутствуют исследования, посвященные питотоксинам с иизкомолску-
ляриыми адресными фрагментами. Тем не менее, именно высокий молекулярный вес обуславливает существенные недостатки имеющихся на сегодняшний день цитотоксинов направленного действия. Они вызывают значительный иммунный ответ, в большой степени подвержены протсолизу и самоинактивации, что уменьшает их врсми циркуляции в организме. Требуются их значительные дозы для достижения терапевтического эффекта. В связи с этим, несмотря на активные исследования в области создания высокомолекулярных цитотоксинов, в клинической практике они не применяются. Поэтому,главной задачей данного исследования являлось создание цитотоксинов, обе части которых имеют маліли молекулярный вес, и исследование их і! экспериментах па культуре клеток.
В качестве пизкомолскуляркого токсического фрагмента коныогатов был выбран антибиотик блсомиции, относящийся к классу гликопептидов. Блсоми-ции, хслатируи ионы металлов переменной валентности, генерирует активные формы кислорода в окислительно-восстановительном цикле, подобном моноок-сигепазпому циклу цитохрома Р-450 (Murugcsan ct al, 1983; Burger ct al., 1994), которые способны повреждать различные клеточные структуры в каталитическом режиме.
В качестве пизкомолскулярпых адресных фрагментов цитотоксинов решено было использовать низкомолскулярпые пептиды. Первым шагом па пути создания пизкомолскулярпых селективных цитотоксинов является синтез К01ГЫО-гата блсомиципа с инсулином - нолипецтидным гормоном, рецепторы для которого экспрсссируют'ся, в частности, клетками лимфоцитарного ряда. Цитоток-сическая активность этого копъюгата при действии на гимоциты мышей оказалась в 3 раза выше активности псконыогированиого блсомиципа.
Однако, поскольку инсулин является достаточно крупным природным полипептидом, решено было исследовать цитотоксическую активность коныога-тов блсомиципа с синтетическими низкомолскулярными пептидами, содержащими последовательность RGD. Рецепторы, лигапды которых содержат последовательность RGD, экспрсссируются клетками, способными к адгезии (фиб-
робластами, зпитслиоцитами, тромбоцитами и др.) (D'Souza сі al., 1991). В качс-стлс адресных компонентов копъюгатов были синтезированы следующие RGD-содержащие пептиды: RGD, RGDS, Е-аминокапройл-RGD, е-аминокаироил-RGDS и цикло-RGDdFK (где dF обозначает О-ірспилалаїїиіі).
При синтезе высокомолекулярных цитотоксипов исследователи, как правило, ис определяют конкретного места связыпания копыогирусмых белков и их точного соотношения. При синтезе пизкомолскулярных копъюгатов неконтролируемая модификация реакционно-способных групи пептидов и блсомипипа можег принести к потере активности обоих компонентов конъгогата. В связи с этим была поставлена задача выбрать участки связывания блсомипипа с адресными пептидами, оптимальные для сохранения биологической активности как блсомипипа, так и пептидов, и разработать метод синтеза выбранной структуры. Необходимо было определить состав получаемого коныогата и выяснить, какие реакционно-способные группы участвуют в реакции конъюгации. Таким образом, одной из важнейших задач при синтезе копъюгата блсомипипа с пептидами являлась возможно более точная характеристика получаемого продукта реакции.
Цель настоящего исследования: Получить коныогаты блсомипипа с инсулином, пептидами RGD, RGDS, є-аминокапроил-RGD, е-аминокапроил-RGDS и цикло-RGDdFK, обладающие повышенной, но сравнению с блсомици-ном, цитотоксической активностью.
Конкретные задачи исследовании:
-
Синтезировать пептиды RGD, RGDS, є-аминокапроил-RGD, є-амино-капроил-RGDS и цикло-RGDdFK.
-
Получить цитотоксически активные коныогаты блеомицина с инсулином, пептидами RGD, RGDS, Е-аминокапроил-RGD, Е-аминокапроил-RGDS и цикло-RGDdFK.
-
Исследовать цитотоксическую активность копъюгатов блеомицина с инсулином, пептидами RGD, RGDS, є-аминокапроил-RGD, е-амшкжанроил-
RGDS и цикло-RGDdFK. на культурах клеток и сравнить се с активностью нсконъюгированного блсомиципа.
Научная новизна и практическая значимость предлагаемой работы состоит в том, что впервые были получены цитотоксины направленного действия, обе части которых представляют собой низкомолскулярные сосдипиепия.
Была выбрана определенная структура коныогатов блсомиципа с пептидами, при образовании которой сохраняются цитотоксичсскис свойства блсомиципа и адгезивная активность пептидов. Разработан метод ковалентного связывания блсомиципа с пептидами, при использовании которого в реакции конъюгации участвует аминогруппа концевого амина молекулы блсомиципа и аминогруппы пептидов.
Получены коиыогаты блсомиципа с инсулином, пептидами RGD, RGDS, є-аминокацроил-RGD, Е-амипокапроил-RGDS и цикло-RGDdFK. Копъгогат блсомиципа с инсулином оказался в 3 раза более активным но сравнению с нсконъюгировапным блсомицином. При использовании линейных RGD-содср-жащих пептидов в качестве адресных фрагментов коныогатов не было получено увеличения цитотоксической активности по сравнению с пскоішогироваїшмм. блсомицином, в то время как использование циклического пептапипида цикло-RGDdFK и качестве адресного фрагмента позволило добиться увеличения цитотоксической активности в 8.3 раза.
Таким образом, показана возможность создания копыогатов-циготокси-пов направленного действия, обе части которых, и токсическая, и адресная, представляют собой низкомолскулярные вешестпа.
Апробации диссертации состоялась 9.10.1996 па совместной конференции НИИ биомедицинской химии РАМН и и кафедры биохимии медико-биологиче-ского факультета РГМУ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.
Сгруктура и объем работы. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, включая 27 рисунков и 4 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описание материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.
