Содержание к диссертации
Введение
1 Введение 9
1.1 Актуальность проблемы, цель и задачи работы 9
1.2 Научная новизна и практическая значимость работы 13
1.3 Структура изложения материала 15
2 Обзор литературы 17
2.1 Общая характеристика проблемы 17
2.2 Методы масс-спектрометрического профилирования плазмы крови 19
2.2.1 Получение и обработка биологических образцов 19
2.2.2 Метод SELDIOF для профилирования плазмы крови 21
2.2.3 MALDIOF-профилирование сыворотки/плазмы посредством хроматографического разделения на микрогранулах 23
2.2.4 Методы, используемые для удаления из сыворотки или плазмы высококопийных белков 25
2.2.5 Белки и пептиды, ассоциированные с белками-носителями 27
2.2.6 Анализ активности экзопротеаз 29
2.2.7 Масс-спектрометрический анализ, совмещенный с иммунным подходом: исследование профилей модификации белков 31
2.2.8 Масс-спектрометрический анализ сывороток, расщепленных трипсином
2.3 Полноразмерные белки, идентифицированные при помощи maldiof-macc-спектрометрии как потенциальные биомаркеры злокачественных опухолей 39
2.3.1 Аполипопротеины 40
2.3.2 Фрагменты комплемента 41
2.3.3 Гаптоглобин 42
2.3.4 Сывороточный амилоид А острой фазы 43
2.3.5 Альфа-1-антитрипсин 44
2.3.6 Транстиретин 45
2.3.7 Трансферрин 47
2.3.8ЦистатинС 53
2.4 Пептидные фрагменты и их происхождение 54
2.5 Перспективы подходов протеомного штрих-кода 55
3 Материалы и методы 5 8
3.1 Методы исследования термостабильной фракции сывороток посредством двумерного электрофореза 5 8
3.1.1 Пациенты 58
3.1.2 Получение термостабильной фракции сыворотки 5 8
3.1.3 Подготовка проб и двумерный электрофорез 59
3.1.4 Анализ изображения гелей 60
3.1.5 Идентификация белков с помощью MALDIOF(OF) MS
3.2 Методы идентификации сывороточного амилоида а как компонента протеомного штрих-кода рака яичника 63
3.2.1 Пациенты 63
3.2.2 Термостабильная фракция плазмы крови 63
3.2.3 Масс-спектрометрия SELDIOF MS 63
3.2.4 Модификация остатков цистеина белков 4-винилпиридином 64
3.2.5 MALDIOF MS 65
3.2.6 2Б-Электрофорез для исследования форм сывороточного амилоида А 66
3.2.7 Разделение белков термостабильной фракции плазмы путем ВЭЖХ 68
3.3 Методы анализа протеомного штрих-кода для диагностики рака яичника 69
3.3.1 Пациенты 69
3.3.2 Иммуноферментный анализ 69
3.3.3 Профилирование сывороток с применением SELDIOF 71
3.3.4 Анализ масс-спектров 73
3.3.5 Статистическая обработка результатов 74
3.4 Методы анализа протеомного штрих-кода для диагностики рака предстательной железы 78
3.4.1 Пациенты 78
3.4.2 Получение плазмы крови 78
3.4.3 Выбор метода проведения протеомного исследования образцов плазмы крови
3.4.4 Статистическая обработка результатов протеомного штрих-кода и разработка диагностического метода 81
3.5 Методы анализа масс-спектрометрических и цитокиновых профилей сыворотки крови для диагностики т-клеточной лимфомы кожи 83
3.5.1 Пациенты 83
3.5.2 Сбор крови и получение сыворотки 84
3.5.3 MALDIOF-масс-спектрометрия 85
3.5.4 Иммунофлуоресцентный анализ цитокинов хМАР 86
3.5.5 Статистический анализ результатов 86
4 Результаты и их обсуждение 89
4.1 Пилотное исследование термостабильной фракции сывороток пациентов с различными злокачественными опухолями, характерными для женщин, методом двумерного электрофореза 89
4.1.1 Термостабильная фракция сыворотки 90
4.1.2. Дифференциально экспрессирующиеся белки, выявленные методом
двумерного электрофореза в сыворотках пациентов с различными
злокачественными опухолями, характерными для женщин 92
4.2 Сывороточный амилоид а в составе масс спектрометрического протеомного штрих-кода при раке яичника 100
4.2.1 Исследование термостабильной фракции плазмы крови посредством масс спектрометрии SELDIOF 100
4.2.2 Дифференциальный пик протеомного штрих-кода рака яичника с m/z 11,7 кДа
102
4.2.3 Идентификация пиков с m/z 11,5/11,7 кДа 102
4.2.4 Сравнение данных SELDIOF-масс-спектрометрии и карт 20-электрофореза в контексте молекул сывороточного амилоида А 108
4.2.5 Выделение продукта с молекулярной массой 11,7 кДа посредством жидкостной хроматографии и его прямая идентификация 112
4.3 Протеомныи штрих-код сыворотки крови для диагностики рака яичника 116
4.3.1. Определение концентрации белка A-SAA в сыворотках методом иммуноферментного анализа 116
4.3.2 Масс-спектрометрическая детекция белка A-SAA в сыворотке крови 119
4.3.3 Обработка масс-спектров спектров SELDIOF, полученных с использованием чипов с нормальнофазовой поверхностью, с использованием жестких критериев для идентификации пиков 128
4.3.4 Классификация масс-спектров SELDIOF с использованием метода пар с наибольшим счетом (TSP) 129
4.3.5 Разработка диагностического алгоритма на основе комбинированных протеомных данных с использованием метода опорных векторов и логистической регрессии 132
4.3.6 Анализ результатов перекрестной проверки достоверности 133
4.3.7 Кластерный анализ данных масс-спектров SELDIOF 136
4.3.8 Дискриминаторные пики SELDIOF, характерные для рака яичника и отобранные различными классификаторами 148
4.3.9 Почему раковые клетки продуцируют белок острой фазы сывороточный амилоид А 152
4.4 Протеомный штрих-код плазмы крови для диагностики рака предстательной железы 160
4.4.1 Оптимизация условий получения масс-спектрометрических штрих-кодов плазмы крови методами хроматографических белковых чипов SELDI, магнитных гранул ClinProt WCX и хроматографических наконечников ZipTip С18 161
4.4.2 Разработка диагностического алгоритма на основе масс-спектров MALDIOF после фракционирования на ZipTip С18 168
4.5 Масс-спектрометрические и цитокиновые профили сыворотки крови для диагностики т-клеточной лимфомы кожи 173
4.5.1 Масс-спектрометрический штрих-код сыворотки при Т-клеточной лимфоме кожи, полученный путем MALDIOF-масс-спектрометрии 176
4.5.2 Профилирование цитокинов сыворотки при Т-клеточной лимфоме кожи с использованием технологии хМАР 182
4.5.3 Итоги протеомного профилирования для диагностики Т-клеточной лимфомы кожи 185
4.6 Мультиплексный протеомныи анализ для диагностики злокачественных опухолей: настоящее и перспективы 187
4.6.1 Технические перспективы протеомного штрих-кода 187
4.6.2 Проблемы введения мультиплексных тестов в клиническую практику 191
4.6.3 Протеомныи штрих-код в контексте проекта «Протеом человека» 194
5 ВЫВОДЫ 197
Список сокращений 199
Список работ, опубликованных по теме диссертации 201
Список цитируемой литературы
- Получение и обработка биологических образцов
- Полноразмерные белки, идентифицированные при помощи maldiof-macc-спектрометрии как потенциальные биомаркеры злокачественных опухолей
- Идентификация белков с помощью MALDIOF(OF) MS
- Протеомныи штрих-код сыворотки крови для диагностики рака яичника
Введение к работе
Актуальность проблемы
П о о
Злокачественные опухоли являются распространенной причинои смерти человека и многих других позвоночных животных. По последним оценкам, они вызывают более десяти процентов летальных случаев в человеческой популяции (). Согласно современным представлениям, фатальные поломки в организме млекопитающего вызваны патологическим усилением одного из физиологических процессов - пролиферации, с одной стороны, что вызывает злокачественные опухоли, и старения, с другой стороны, что стимулирует дистрофии и нейродегенеративные заболевания. Более того, установлены общие биологические основы рака и старения, а указанные различные исходы связаны со сдвигом равновесия в ту или иную сторону (Finkel, Serrano, and Blasco 2007).
Несмотря на очень большое разнообразие генетических предпосылок развития злокачественных опухолей, разнообразие их морфологических и, что более важно, клинических проявлений не столь велико. Иными словами, в основе двух разных, сходных по клинической картине и морфологии опухолей могут лежать мутации в различных биохимических каскадах. Примером этого явления может служить недавняя работа (Kobel et al. 2008), в которой описаны большие различия в экспрессии белков в разных морфологических типа аденокарциномы яичника, притом что в клинической практике есть потребность в диагностике этой опухоли независимо от ее клеточных и биохимических типов. Поэтому идея о единственном биохимическом биомаркере, будь то последовательность нуклеиновой кислоты, белок или метаболит, для первичной или дифференциальной диагностики большинства типов рака в настоящее время отвергнута большинством специалистов. В качестве альтернативного направления развивается понятие о молекулярной сигнатуре (Subramanian and Simon 2010) или штрих-коде (Zimmer et al. 2006). Сигнатура включает в себя набор качественно или количественно оцениваемых молекулярных параметров, например, генетических полиморфизмов, уровня экспрессии транскриптов, белков, уровня липидов или других метаболитов, измерение которых обеспечивает высокую точность диагностики заболевания (Yurkovetsky et al. 2010). Для получения мультиплексного (многопараметрического) штрих-кода клинического образца могут использоваться различные методы. Если речь идет о протеомном, белковом штрих- коде, то это в первую очередь иммунный анализ (Edgell et al. 2010) и масс-спектрометрия (Zimmer et al. 2006; Rodriguez et al. 2010). Важным аспектом при разработке штрих-кода является статистическая обработка мультиплексных данных. Для корректного вычисления диагностической точности метода, расчета рисков и применения на практике требуется использование специальных алгоритмов распознавания данных (Hamacher et al. 2009).
В настоящей работе в качестве экспериментальной подхода к диагностике рака яичника, предстательной железы и Т-клеточной лимфомы кожи нами использованы основанные на MALDI-TOF-масс-спектрометрии плазмы крови штрих-коды, изучена природа компонентов, обеспечивающих диагностику, а также сформулированы проблемы и перспективы новой области знания, связанной с протеомными профилями плазмы крови для диагностики.
Целью работы является выявление протеомного штрих-кода плазмы крови, измеряемого посредством масс-спектрометрии, подходящего для диагностики злокачественных опухолей на примере рака яичника и предстательной железы, а также Т- клеточной лимфомы кожи.
Основные задачи исследования
Получение посредством MALDI-TOF-масс-спектрометрии мультиплексного сигнала от образцов плазмы крови пациентов с раком яичников, пациентов с раком
U гр U 1 U
предстательной железы, а также пациентов с Т-клеточной лимфомой кожи и соответствующих всем указанным патологиям контрольных субъектов.
Обработка полученных MALDI-TOF-масс-спектров методами многомерной статистики для выявления маркерных компонентов протеомного штрих-кода и оценки точности, специфичности и чувствительности протеомной диагностики.
Экспериментальная идентификация и идентификация с использованием литературных источников компонентов протеомного штрих-кода, вносящих вклад в построение оптимальной модели для диагностики рака яичника, рака предстательной железы и Т-клеточной лимфомы кожи.
Сопоставление данных протеомной диагностики рака яичника, рака предстательной железы с результатами анализа принятых в клинической практике молекулярных маркеров этих опухолей.
Применение в случае Т-клеточной лимфомы кожи в дополнение к MALDI-TOF- масс-спектрометрии направленного протеомного анализа цитокинов сыворотки крови.
Научная новизна. В представленной работе были впервые получены экспериментальные масс-спектрометрические штрих-коды для диагностики рака яичника, объединенные с данными иммуноферментного анализа. При анализе белковых штрих- кодов были однозначно идентифицированы некоторые его компоненты, самым значимым из которых для диагностики является сывороточный амилоид А. Для получения штрих- кодов разрабатывали и применяли оригинальные модификации методов обработки образца.
При обработке диагностических масс-спектров впервые применяли особый алгоритм для построения диагностической модели, основанный на учете некоррелирующих между собой компонентов штрих-кода с последующим применением классификатора - метода опорных векторов.
Важным результатом работы является подтверждение того, что масс- спектрометрические штрих-коды плазмы и сыворотки крови способны достоверно распознавать образцы, полученные от пациентов со злокачественными опухолями, по меньшей мере, яичника и предстательной железы. Представленная работа, кроме того, раскрывает биологический смысл наблюдаемых отличий посредством идентификации значимых компонентов профиля. В работе подчеркивается значение белка сывороточного амилоида А не только как маркера воспаления, но и его очевидная связь с патогенезом ряда злокачественных опухолей.
Цитокиновые профили плазмы крови при Т-клеточной лимфоме кожи позволили выявить новый, не описанный ранее биомаркер данного заболевания - хемокин с мотивом C-X-C 10 (CXC10).
Основные положения, выносимые на защиту
В качестве биомаркера рака яичника, предстательной железы и Т-клеточной лимфомы кожи используют мультиплексный сигнал масс-спектрометрии плазмы крови, одновременно характеризующий множественные белки плазмы крови - протеомный штрих-код. Принятие диагностического решения осуществляют методами многомерной статистики.
Протеомный штрих-код плазмы крови, регистрируемый посредством МАЬВ1(8ЕЬБ1)-ТОР-масс-спектрометрии, на тестируемых выборках обеспечивает диагностику пациентов с раком яичника и раком предстательной железы с точностью свыше 90%.
Отличия протеомных масс-спектрометрических профилей плазмы крови при раке яичника и раке простаты реализуются преимущественно за счет различных изоформ сывороточного амилоида А острой фазы (SAA) и транстиретина (TTR).
В случае Т-клеточной лимфомы кожи мультиплексный анализ цитокинов в плазме крови обеспечивает точность дифференциальной диагностики лимфомы от псориаза свыше 80%, в основном, в связи с концентрацией нового биомаркера данной опухоли - хемокина с мотивом C-X-C 10 (CXC10).
Научно-практическая значимость работы. Высокие результаты точности диагностического метода, сочетающего данные MALDI-TOF-масс-спектрометрии и иммуноферментного анализа, иллюстрируют перспективы методов протеомики для последующего внедрения в практику, после преодоления проблемы технической вариабельности метода.
Биомаркеры-компоненты масс-спектрометрического штрих-кода, в том числе идентифицированный в настоящей работе сывороточный амилоид А, предложены в качестве компонентов диагностических панелей для диагностики и мониторинга лечения злокачественных опухолей. Так, сывороточный амилоид А рассматривается как один из маркеров ответа пациентов с раком яичника на направленное действие лекарственного антитела цетуксимаб, со ссылкой на материалы настоящей работы (Schilder et al. 2009). Кроме того, данный белок входит в диагностическую панель, которая проходит клинические испытания для диагностики рака яичников (Edgell et al. 2010), также со ссылкой на представленную работу.
Таким образом, результаты, полученные в представленной работе, получили развитие и используются в нескольких прикладных клинических испытаниях, что
указывает на потенциально высокую практическую значимость работы.
Апробация работы. Материалы настоящей работы представлялись на 2-й международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика в медицине» в Москве (Россия) в 2004 г., на HUPO 3th Annual World Congress в Пекине (КНР) в 2004 г., на школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» в Москве (Россия) в 2005 г., на HUPO 4th Annual World Congress в Мюнхене (Германия) в 2005 г., на 3-й международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Новосибирске (Россия) в 2006 г., на HUPO 5th Annual World Congress в Лонг-Биче (США) в 2006 г., на 3-й международной школе-конференции молодых ученых «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» в Звенигороде (Россия) в 2007 г., на 4th International Symposium on Computational Methods In Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources в Москве в 2007 г., на HUPO 6th Annual World Congress в Сеуле (Южная Корея) в 2007 г., на HUPO 7th Annual World Congress в Амстердаме (Нидерланды) в 2008 г., на 4-й международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Москве и Нижнем Новгороде (Россия) в 2008 г., на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов в Новосибирске (Россия) в 2008 г., на HUPO 8th Annual World Congress в Торонто (Канада) в 2009 г., на HUPO 9th Annual World Congress в Сиднее (Австралия) в 2010 г., на 1-й международной научно-практической конференции молодых ученых «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» в Москве (Россия) в 2010 г., на Taiwan-Russia Research Cooperation Symposium "New mass spectrometry methods in proteomics" в Гаосюне (Тайвань) в 2011 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 49 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе, 21 статья в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, и 28 публикаций в трудах конференций. Индекс Хирша автора составляет 7 по данным системы Scopus.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 239 страницах, содержит 32 рисунка, 17 таблиц. Список литературы включает 235 источников.
Получение и обработка биологических образцов
Злокачественные опухоли представляют собой основную проблему здравоохранения во многих странах. Их раннее выявление является наиболее перспективным подходом для снижения частоты этих заболеваний. Такие способы диагностики обеспечивают идентификацию опухолей на стадии, когда они еще подлежат лечению. Примером успешного снижения связанной с заболеванием смертности является рак шейки матки, успех лечения которого обеспечили программы широкого скрининга. Однако, разработка тестов для скрининга других злокачественных опухолей до сих пор является неотложной необходимостью (Etzioni et al. 2003).
Таким образом, большие усилия в настоящее время направлены на разработку эффективных методов диагностики злокачественных опухолей. Для широкомасштабных исследований с использованием клинического материала одним из наиболее доступных биологических образцов является венозная кровь. Данный материал забирают малоинвазивным методом, который подходит для мониторинга течения заболевания в течение длительного периода наблюдения пациента. Очевидно, что плазма и (или) сыворотка крови содержит большое количество белков и пептидов, высвобождаемых из различных органов как в норме, так и при патологии (Omenn 2006).
Несмотря на множество попыток поиска биомаркеров с использованием различных методов, до сих пор не было найдено ни одного маркера злокачественной опухоли, который бы предоставлял 100% точность диагностики. Более того, само существование такого маркера сомнительно вследствие гетерогенной природы рака. Поэтому в настоящее время основные усилия сконцентрированы на поиске панелей дифференциально экспрессирующихся белков и пептидов вместо поиска отдельных биомаркеров, и диагностические правила конструируются на основе многопараметрических, «мультиплексных» данных (Skates et al. 2004). Быстрое развитие протеомики дало возможность анализировать многие белки одновременно и способствовало новым подходам в поиске биомаркеров злокачественных опухолей. MALDIOF-масс-спектрометрия стала одним из наиболее широко применяемых методов протеомики для исследований в области молекулярной онкологии (Simpson et al. 2008; Whelan et al. 2008; Whiteley et al. 2009). Экспериментальная процедура в случае применения данного вида масс-спектрометрии обычно включает в себя получение масс-спектров обработанных образцов плазмы крови больных и здоровых людей, поиск статистически значимых различий и разработку диагностического алгоритма. Протеомный анализ сыворотки или плазмы крови затруднен вследствие исключительно высокого разброса концентраций белков в данной биологической жидкости, причем 98% массы белка в плазме представлено всего лишь 20 высококопийными белками (Hortin 2006). Профилирование путем MALDIOF-масс-спектрометрии уступает по чувствительности детекции другим принятым в протеомике методам (Archakov et al. 2007). Например, тандемная масс-спектрометрия с электроспрейной ионизацией (ESI-MS/MS) расщепленных протеазами белков после их разделения путем двумерной хроматографии способна перекрывать несколько порядков концентрации белковых молекул. Однако, сложный характер эксперимента, информационная перенасыщенность спектральных данных вкупе с низкой воспроизводимостью анализа делает этот подход неприемлемым для исследования больших групп пациентов с высоким уровнем надежности результата. Прямое профилирование посредством MALDIOF-масс-спектрометрии представляет собой высокопроизводительный метод, обеспечивающий быстрый анализ сотен образцов сыворотки. Несмотря на низкую чувствительность, особенности данного метода делают его потенциально пригодным для экспресс-анализа в условиях клиники (Villanueva et al. 2007).
Далее в обзоре мы остановимся на существующих методических подходах прямого профилирования плазмы крови путем MALDIOF-масс-спектрометрии, методах анализа таких результатов и их применении для обнаружения биомаркеров злокачественных опухолей. Также будут обсуждаться проблемы пробоподготовки и воспроизводимости результатов.
Полноразмерные белки, идентифицированные при помощи maldiof-macc-спектрометрии как потенциальные биомаркеры злокачественных опухолей
Одним из часто используемых методов поиска биомаркеров в плазме крови до недавнего времени была масс-спектрометрическая технология на основе чипов для хроматографии белков SELDIOF (Surface-enhanced laser desorption / ionization time-of-flight - усиленная поверхностью лазерная десорбция/ионизация). Технология SELDI представляет собой модификацию MALDI-масс-спектрометрии, разработанную специально для масс-спектрометрического профилирования клинического образца для биомедицинских целей. Она предусматривает экспресс-фракционирование биологических образцов на чипах с различными типами хроматографических поверхностей перед масс-спектрометрическим анализом. Алюминиевые чипы содержат ковалентно присоединенную к их поверхности обращенную фазу, нормальную фазу, металлоаффинную, катионо- и анионообменные смолы. По замыслу разработчиков, на различных поверхностях чипов фракционируются разные субпротеомы образца. Помимо фракционирования белков как такового, данные чипы обессоливают образцы, подготавливая их к MALDIOF-MS. Метод SELDI-MS прост в применении и подлежит автоматизации (Petricoin and Liotta 2004).
Обычная последовательность экспериментов включает получение масс-спектров образцов от контрольной группы и группы пациентов, детекцию и выравнивание пиков масс-спектрометрического сигнала и последующий поиск пиков, которые значимо отличаются в образцах, относящихся к злокачественной опухоли, от контроля. Диагностический алгоритм обычно разрабатывается методом автоматической классификации с использованием данных MS в качестве входных значений. Данный подход подразумевает рассмотрение масс-спектров в качестве "черных ящиков» без идентификации дискриминаторных пиков. Во многих статьях сообщается о точности диагностики, полученной такими методами, превышающей 90% (Е. F. Petricoin et al. 2002; Kozak et al. 2003; W. Zhu et al. 2003). Однако, воспроизводимость пиков масс-спектров, выбранных как диагностические, в различных исследовательских группах, является довольно низкой, и это недавно вызвало оживленную дискуссию в научном обществе (Vlahou et al. 2003; Kozak et al. 2005). Тем не менее, разработка специфичных для рака «штрих-кодов» считается перспективной до сих пор, и попытки «слепого» профилирования крови еще продолжаются (McLerran et al. 2008; Wei et al. 2008; Zinkin et al. 2008). Особое внимание здесь уделяется контролю качества экспериментов, применению адекватных методов биоинформатики и правильному планированию эксперимента. К настоящему времени идентифицировано некоторое количество дискриминаторных пиков. Наиболее распространенные методы очистки белков в данных случаях представляют собой ID- и 20-электрофорез в полиакриламидном геле (Tolson et al. 2004; Lee et al. 2006) и ВЭЖХ (Z. Zhang et al. 2004; Miguet et al. 2006; Ward et al. 2006). Идентификацию обычно проводят путем трипсинолиза с последующей тандемной масс-спектрометрией. В некоторых работах потенциальные биомаркеры далее валидируют альтернативными методами, например, посредством сорбционного иммуноферментного анализа (Zhang et al. 2004; Kozak et al. 2005), вестерн-блоттинга (Kozak et al. 2005; Malik et al. 2005) и удаления целевого белка с использованием антител (Ward et al. 2006; Escher et al. 2007). Хотя в масс-спектрометрических профилях, полученных в разных научных группах, наблюдали значимые различия, идентифицированные дифференциально экспрессированные белки часто общие для различных лабораторий. Список идентифицированных потенциальных биомаркеров злокачественных опухолей приведен в таблице 1. Подробное обсуждение их свойств предоставлено в следующих разделах.
MALDIOF-профилирование сыворотки/плазмы посредством хроматографического разделения на микрогранулах
Помимо чипов с различными типами хроматографических поверхностей, сходная стратегия очистки реализована на микроскопических гранулах, которые содержат магнитную сердцевину и хроматографическую поверхность. Гранулы, как предполагается, более эффективны в очистке белков из сложных образцов по причине большей поверхности и более значительной способности для связывания.
Хорошо известный пример магнитных гранул включает в себя гранулы ClinProt производства Bruker Daltonics. Как и в случае белковых чипов, предложены различные типы магнитных гранул: катионообменные, анионообменные, обращеннофазовые и металлоаффинные. Однако, магнитные гранулы ClinProt не стали столь популярными, как SELDI-MS, и лишь малое количество статей сообщают об их успешном применении для диагностики злокачественных опухолей (Cheng et al. 2005; Chang et al. 2006; Freed et al. 2008).
Идентификация белков с помощью MALDIOF(OF) MS
Все реагенты для электрофореза были производства Bio-Rad (США) за исключением специально обозначенных иначе случаев.
Пробоподготовку осуществляли следующим образом. Буфер для солюбилизации образца содержал 7 М мочевину, 2 М тиомочевину, 65 мМ DTT, 5% Ampholine 3-Ю (Amersham, США), 4% CHAPS (Amersham, США), 1,5% детергента NP-40.
Для получения мини-гелей (размером 85x70x1,0 мм) 22 мкл термостабильной фракции плазмы (90 мкг общего белка) добавляли к 66 мкл буфера для солюбилизации, и перемешивали. Одновременно 3 мкл плазмы крови (180 мкг общего белка) добавляли к 27 мкл буфера для солюбилизации, и перемешивали.
Для получения больших гелей (размером 160x180x1,5 мм) 30 мкл термостабильной фракции плазмы (120 мкг общего белка) добавляли к 90 мкл буфера для солюбилизации, и перемешивали. Композиция геля для изоэлектрофокусирования содержала 7 М мочевину, 4% смесь акриламид/бис-акриламид (32:1), 2% Ampholine 3-Ю, 3% Ampholine 5-8 (оба - Amersham). В качестве инициаторов полимеризации добавляли 0,02% APS и 0,1%TEMED.
Изоэлектрофокусировку проводили в трубках диаметром 1,0 мм и длиной 66 мм в ячейке Mini-PROTEAN 3 IEF Cell (Bio-Rad) со следующим профилем вольтажа: 100 В - 1 ч, 200 В - 1 ч, 300 В - 1 ч, 400 В - 1 ч, 500 В - 12 ч, 600 В - 1 ч (комнатная температура).
Для больших гелей готовили трубки диаметром 1,5 мм и длиной 140 мм, и осуществляли фокусировку в ячейке PROTEAN II xi 2D Cell (Bio-Rad) со следующим профилем вольтажа: 100 В - 1 ч, 200 В - 1 ч, 300 В - 1 ч, 400 В - 1 ч, 500 В - 12 ч, 600 В - 1 ч, 700 В - 10 ч, 900 В - 0,5 ч (комнатная температура).
Электрофорез с ДСН в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) в качестве разделения во втором направлении проводили в полиакриламидных гелях с градиентом 9-16%: в мини-гелях размером 85х70х 1,0 мм в ячейке Mini-PROTEAN 3 DodecaCell при 16 мА на гель в течение 2 ч или в больших гелях размером 160x180x1,5 мм PROTEAN II xi Multi-Cell при 40 мА на гель в течение 4,5 ч.
После разделения гели промывали, и белки окрашивали серебром с использованием тиосульфата (Blum, Beier, and Gross 1987). Анализ изображения 20-гелей и идентификацию белов в пятнах, вырезанных из них, осуществляли, как описано в разделе 3.1.5. 3.2.7 Разделение белков термостабильной фракции плазмы путем ВЭЖХ
Для удаления солей и высокомолекулярных белков из 50 мкл термостабильной фракции плазмы использовали сделанный в лаборатории из пластикового наконечника для пипетки картридж объемом 0,1 мл, содержащий частицы хроматографической фазы Lichrosorb СІ8 диаметром 10 мкл с размером пор 300 A (Merck). Элюирование интересующих фракций проводили постадийно: 1 мл 0,1% ТФУ в воде, 0,2 мл 30% ацетонитрила с 0,1% ТФУ в воде, 0,2 мл 70% ацетонитрила с 0,1% ТФУ в воде. Фракции упаривали и перерастворяли в 50 мкл 10% ацетонитрила с 0,1 % ТФУ в воде для последующей ВЭЖХ.
Анализ ВЭЖХ проводили с использованием хроматографа MilliChrom А-02 (ЗАО Институт хроматографии «ЭкоНова», Россия). Использовали колонку 75x2 мм с частицами Nucleasil СІ8 диаметром 5 мкм с размером пор 300 A (Macherey-Nagel, Германия). Разделение проводили при 35С; использовали детектор с двумя длинами волны (220 нм и 280 нм). Условия элюции были следующим: растворители А (0,1 % ТФУ в воде, рН 2,2), В (ацетонитрил с 0,1% ТФУ; линейный градиент: 0-100 % В в течение 20 минут; скорость потока 100 мкл/мин. Фракции объемом 20-40 мкл собирали вручную. Состав фракций оценивали посредством SELDIOF-MS, как описано выше. По 2 мкл каждой фракции наносили на хроматографический чип с нормальной фазой NP20 (Ciphergen) и обрабатывали с использованием матрицы а-цианогидроксикоричной кислоты по указаниям производителя
Образцы венозной крови пациентов получали на клинической базе кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета РНИМУ им. Н.И.Пирогова в соответствии с этическими требованиями данной организации. Для исследования были использованы сыворотки 34 женщин, больных раком яичника, в том числе 7 сывороток пациенток с раком в ранней (1-ой и 2-ой) стадии; 13 сывороток женщин больных доброкачественными опухолями яичника и 16 - миомой матки; одна сыворотка больной миомой матки и фибромой яичника и 26 сывороток здоровых женщин. Данные о гистологии опухолей были получены с помощью биопсии. Забор крови производили до лечения и оперативного вмешательства. В качестве контроля были использованы 26 сывороток здоровых женщин, полученных при плановом гинекологическом обследовании. Подробные сведения об участниках
Протеомныи штрих-код сыворотки крови для диагностики рака яичника
Масс-спектрометрическое определение m/z методом SELDIOF-MS обладает невысокой точностью. Тем не менее, так как спектры были откалиброваны с использованием в качестве внешних стандартов белков, близких по массе к A-SAA (например, цитохрома С лошади массой 12361 Да), погрешность в определении массы A-SAA не превышала 7-10 Да, что позволяло различить различные формы A-SAA в сыворотках с содержанием A-SAA более 0,3 г/л. Возможность наблюдать различные формы одних и тех же белков является важным преимуществом масс-спектрометрических методов по сравнению с иммунологическими методами детекции белков.
Примеры различных форм сывороточного амилоида, детектированных на масс-спектрах, приведены на рисунке 17.
В 16 из 18 образцов, где вообще наблюдали пики A-SAA, в спектрах присутствует пик с m/z, которую можно ассоциировать с точной усредненной молекулярной массой 11683 Да5, соответствующий сывороточному амилоиду 1 альфа. ВІЗ случаев, наряду с пиком 11683 Да, присутствует также пик равной или несколько меньшей интенсивности с m/z около 11526 Да, соответствующий форме A-SAA с отщепленным аргинином на N-конце (рис. 17А). В одном случае присутствует также небольшой пик с m/z 11439, который, по-видимому, соответствует SAAla с отщепленными двумя N-концевыми аминокислотами аргинином и серином. В 11 образцах наблюдается пик более низкой, по сравнению Для удобства восприятия мы указываем точную усредненную молекулярную массу форм A-SAA. При этом реальные значения m/z, регистрируемые на SELDIOF, имеют погрешность измерения примерно 700-1000 частей на миллион, т.е. 7-12 Да для указанных m/z. с пиком SAAla, интенсивности с m/z примерно 11628 Да, который, по-видимому, соответствует SAA2a. В 8 из 11 образцов вместе с этим пиком наблюдается пик с m/z 11472, соответствующий форме SAA2a с отщепленным N-концевым аргинином (рис. 17А). На трех масс-спектрах присутствует пик 11649 Да, соответствующий, предположительно, SAA2p. На одном масс-спектре присутствуют одновременно пики 11645 Да (SAA2p), 11490 Да (SAA2(3 с отщепленным аргинином), 11404 Да (SAA20 с отщепленными аргинином и серином) (рис. 17В). На нескольких масс-спектрах присутствует также пик 11728-11740 Да, соответствующий, скорее всего, SAAip, однако на большинстве спектров он плохо разрешен из-за высокой интенсивности соседнего пика SАА lac m/z 11683 Да. В одном случае мажорный пик группы сывороточного амилоида имеет m/z 11656 Да и соответствует, по-видимому, SAAly. Вместе с ним на этом спектре присутствует пик 11495 Да, соответствующий форме SAAly с отщепленным аргинином (рис. 17Б). На одном спектре присутствует пик высокой интенсивности с m/z 11698, который отличается примерно на 16 Да от пика 11683 и может представлять собой форму последнего с окисленным метионином.
Судя по полученным данным, основными аллелями A-SAA в исследуемой популяции являются SAAla и SAA2a. Это примерно соответствует данным Nedelkov с соавторами (2005), проанализировавших иммуноаффинными методами с масс-спектрометрической детекцией 96 сывороток здоровых людей на предмет представленности различных модификаций преобладающих белков сыворотки, в том числе A-SAA. По данным этих авторов, SAAla и его фрагменты с детектированы в 90 случаях из 96, a SAA2a и его фрагменты - в 35 случаях из 96. В 18 сыворотках был детектирован SAAly и его модификации (Nedelkov et аі. 2005). Подчеркнем, что, в отличие от исследования Nedelkov с коллегами, в данной работе детектировали A-SAA в цельной сыворотке и только для сывороток с резко повышенным уровнем A-SAA.
Преобладание пика SAA1 в спектрах пациенток с раком яичника позволяет предположить, что при раке яичника в большей степени повышается экспрессия SAAl,aHeSAA2.
Следует отметить, что различия в массе между некоторыми аллельными вариантами (например, 11628 Да, 11645 Да и 11655 Да) не превышает 0,2%, поэтому при дальнейшей статистической обработке они будут рассматриваться как один пик.
В ранних работах по масс-спектрометрическому профилированию поиск биомаркеров осуществляли, как правило, во всем диапазоне масс на масс-спектре. В результате в качестве дискриминаторных предлагали пики, соответствующие очень низкой молекулярной массе, например, 168 Да (Zhu et al. 2003), 321 Да (Petricoin et al. 2002). Однако, исходя из общих представлений о масс-спектрометрии MALDIOF, низкомолекулярная часть спектра (менее 1000 Да) в основном представлена пиками, относящимися к матрице и поэтому вряд ли может нести информативные для диагностики пики (Sorace and Zhan 2003).
Использование алгоритмов классификации для необработанных масс-спектров приводит к обнаружению в качестве дискриминаторных пиков с низкой интенсивностью и/или с низкими значениями m/z. В то же время, большинство дифференциально экспрессирующихся в патологии белков и пептидов, найденных к настоящему моменту с помощью MALDI/SELDI, представлены на масс-спектре интенсивными пиками с m/z более 9 кДа (таблица 1). В связи с этим, мы применили более строгие условия для детектирования пиков (см. раздел 3.3.5) в масс-спектрах всех 90 проб. В результате было детектировано 48 пиков в интервале m/z 5500-17500 Да, каждый из которых имеет высокую интенсивность (соотношение сигнал/шум 5) по крайней мере в одной исследованной пробе. Таким образом, мы пытались убедиться, что каждый из рассматриваемых пиков на масс-спектре соответствует реальному белковому продукту, а не является артефактом или производным матрицы. Список интенсивностей полученных пиков для всех сывороток, разделенных на два класса (рак и отсутствие рака), использовали в качестве исходных данных для разработки диагностических алгоритмов с использованием различных статистических методов.
