Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Часть I. Современные представления о причинах и механизмах развития
интоксикации организма 12
Экзогенная и эндогенная интоксикации: общность и различие 12
Детоксицирующие системы организма- один из определяющих факторов тяжести интоксикации 19
Состояние белков плазмы крови как универсальный индикатор
интоксикации 25
Часть П. Клиновидная дегидратация- метод, позволяющий комплексно
оценивать состояние организма 35
Механизмы структурирования биологической жидкости в процессе дегидратации 36
Маркеры интоксикации макроструктурного портрета биологических
жидкостей '. 46
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. Материалы и методы исследования 48
2.1. Характеристика материалов исследований и обследованных лиц 48
Характеристика экспериментального материала 48
Характеристика клинического материала 57
2.2. Методы исследования 60
2.2.1. Метод клиновидной дегидратации г 60
2.2.2. Определение уровня веществ низкой и средней молекулярной массы 61
Оценка уровня олигопептидов в биологических жидкостях 62
Определение окислительной модификации белков 62
Определение количества продуктов перекисного окисления липидов 64
Исследование белкового спектра сыворотки крови 65
Определение активности ферментов плазмы крови 66
Определение содержания билирубина и его фракций колориметрическим методом 67
Исследование динамики фазовых переходов биожидкостей -.. .68
Исследование биологических жидкостей методом ультразвуковой вискозиметрии 69
Определение токсичности водных сред 71
Исследование химического состава компонентов высохшей капли плазмы крови методом инфракрасной Фурье спектроскопии 72
Биологические и физико-химические свойства озона, методы изучения ...73
.2.2.14. Математическая и статистическая обработка результатов 85
Глава 3. Обоснование некоторых параметров структурного макропортрета
плазмы крови 86
Определение локализации различных групп белков в структурном макропортрете сыворотки крови '. 90
Зависимость параметров дегидратированной капли раствора белка от структурной конформации молекул протеинов 96
Исследование показателей структурного макропортрета и вязкости растворов альбумина в зависимости от факторов, вызывающих изменение структурной конформации белковых молекул 97
Зависимость параметров структурного макропортрета плазмы крови человека от биохимических показателей 104
3.2.3. Видовые различия структурного макропортета сыворотки крови
позвоночных животных 113
Глава 4. Параметры структурного макропортрета содержащих белки
растворов при воздействии токсичных веществ '. 120
4.1. Определение токсичности водных сред методом клиновидной
дегидратации 120
Изучение параметров структурного макропортета раствора альбумина при воздействии различных по токсичности химических веществ 120
Влияние водных отходов различного класса опасности на особенности структурного макропортрета раствора альбумина 126
4.2. Особенности морфологической картины плазмы крови при- интоксикации
организма 129
Изучение биохимических и структурных особенностей плазмы крови при эндогенной интоксикации 129
Влияние наркотических и сильнодействующих веществ на некоторые
параметры сыворотки крови 147
4. 2. 3. Исследование плазмы крови при хроническом алкогольном отравлении. 153
Глава 5. Сравнительный анализ воздействия озона на белки плазмы
крови 160
5.1. Изучение веществ, образующихся при озонировании водных растворов 160
УФ-спектроскопия физиологического раствора при озонировании 160
Химический анализ побочных продуктов, образующихся при озонировании физиологического раствора 165
5.2. Влияние озона на состояние сывороточного человеческого альбумина in
vitro 172
5.2.1. Зависимость параметров структурного макропортрета 10% раствора
альбумина от времени инкубации с озонированным физиологическим
" раствором 172
Зависимость параметров макроструктурного портрета 10% раствора альбумина от содержания хлорида натрия 175
Зависимость параметров структурного макропотртрета 10% раствора альбумина от концентрации озона 181
Биохимические аспекты воздействия озона на состояние сывороточного альбумина и их соотношение с параметрами структурного макропортрета . 186
5.3. Воздействие озона на белки плазмы крови in vivo 191
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 200
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 226
ВЫВОДЫ 230
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 233
Введение к работе
Интоксикация- нарушение жизнедеятельности, вызванное
токсическими веществами, проникшими в организм извне (экзогенная интоксикация) или образовавшимися в нем (эндогенная-интоксикация). Проявления интоксикации зависят от характера токсического вещества, его физико-химических свойств, сродства к определенным органам, физиологическим системам, тканям, субклеточным структурам, рецепторам, ферментам и т.д. Эндогенная интоксикация сопровождает развитие различных патологических состояний, существенно отягчая их течение [68]. Нарушение гомеостаза при данном синдроме обуславливает такие феномены, как блокада ферментных систем биоэнергетики с гистотоксическими последствиями, разбалансировка работы иммунных систем, апоптоз и цитолиз [250]. В связи с этим, исследование процессов интоксикации как неспецифического синдрома, возникающего под влиянием различных токсических веществ, имеет важное значение. Одним из факторов, определяющих развитие интоксикации независимо от причины последней, является активация свободнорадикальньгх процессов [264]. Белки, благодаря особенности своего строения, являются ловушкой активных форм кислорода [312; 284]. В силу этого изменение структурной организации белковых молекул можно считать одним из ранних индикаторов повреждения ткани при интоксикации любого генеза. Однако до сих пор отсутствуют методические подходы для скрининга этиологии интоксикации, отличающиеся достоверностью, интегральной оценкой и простотой исполнения.
Метод клиновидной дегидратации биологических жидкостей [230] дает возможность получать объективные данные, позволяющие выявлять патологические отклонения на ранних этапах и контролировать даже
5 незначительные изменения в динамике заболевания. Принцип метода заключается в анализе системной организации биожидкости после перевода ее в твердую фазу при испарении воды. Такая трансформация предоставляет качественно новые сведения о состоянии системы в целом или ее составляющих. На данный момент выявлены некоторые особенности структурного макропортрета сыворотки крови при терминальных стадиях интоксикации [236]. В то же время при меньших степенях ее выраженности описание параметров структурного макропортрета сыворотки (плазмы) крови отсутствует.
Несмотря на то, что формирование структур в дегидратированных каплях многокомпонентных жидкостей привлекает пристальное внимание специалистов [285; 294; 399], вопрос о роли конформации протеинов в образовании структурного макропортрета (дегидратированной структурированной пленки капли биологической жидкости, полученной с помощью метода клиновидной дегидратации) плазмы крови в целом и при интоксикации, в частности, остается открытым. Уточнение этих сторон патогенеза может быть основой совершенствования контроля за течением заболевания и повышения эффективности, терапии.
Одним из биологически активных агентов, способных снижать степень эндотоксемии, является озон [25] . Биологический эффект озона реализуется посредством влияния на клеточные мембраны и заключается в нормализации уровня редокс-потенциала организма [11.4]. Детоксикационный эффект озона связан с оптимизацией микросомальной системы гепатоцитов и усилением почечной фильтрации [172]. В то же время влияние озона на состояние, белков плазмы крови при эндогенной интоксикации практически, не исследовано. В связи с этим проблема изучения параметров протеинов плазмы крови при интоксикации и. ее. коррекции остается актуальной.
Целью настоящего исследования является изучение роли белков в формировании структурного макропортрета плазмы крови при
интоксикации, разработка на этой основе критериев оценки тяжести, этиологии, прогноза заболевания и обоснования коррекции данного состояния низкими терапевтическими дозами озона.
Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:
Определить локализацию белковых фракций сыворотки крови в ее структурном макропортрете. . ^"
Установить взаимосвязь характеристик макромолекул протеина и важнейших биохимических показателей плазмы крови с формированием микротрещин в структурном макропортрете.
Провести сравнительное» исследование структурного макропортрета сыворотки крови позвоночных животных различных таксономических групп.
Исследовать воздействие модельных соединений разной степени токсичности на параметры структурного макропортрета раствора сывороточного альбумина.
5. Изучить взаимосвязь содержания веществ низкой и средней
молекулярной массы, олигопептидов, окисленно модифицированных
белков, интенсивности свободнорадикальных процессов и процессов
перекисного окисления липидов с формированием аномальных
особенностей структурного макропортрета плазмы крови при эндогенной
интоксикации различной степени тяжести и этиологии; обосновать объем
признаков структурного макропортрета плазмы крови, значимых при
интоксикации.
6. Проанализировать особенности влияния экзогенных токсикантов
(наркотических веществ и этанола) на состояние протеинов плазмы крови.
7. Оценить дозозависимый эффект озона на белки плазмы крови in
vitro и in vivo при коррекции эндогенной интоксикации.
Научная новизна Впервые выявлены новые закономерности становления биохимических механизмов формирования фации, обусловленные
7 параметрами протеинов плазмы крови: установлены зоны локализации белков различных фракций; доказана взаимосвязь структуры молекул протеинов с характером формирования трещин в макропортрете. Впервые показано, что характер микротрещин фации сыворотки крови позвоночных животных тем более различен, чем более далеки организмы в филогенетическом отношении.
Впервые сформулирована концепция, согласно которой развитие процессов интоксикации обусловлено стереотипными реакциями организма на воздействие токсиканта, приводящими к активации процессов свободнорадикального окисления при детоксикации и окислительной модификации белков плазмы крови. Впервые показано, что при терминальной стадии эндогенной интоксикации определяющими являются процессы фрагментации протеинов, сопровождаемые увеличением содержания олигопептидов в плазме крови и появлением в фации патологических структур типа «морщин» и языковых полей; при менее тяжелых стадиях ЭИ преобладающими в деструктивных процессах белкового обмена является образование карбонильных производных в результате окислительной модификации белков, при этом характер нарушений в молекулах протеинов определяется особенностями субстратов интоксикации.
Впервые установлено, что развитие интоксикации при наркотическом отравлении происходит при вкладе в пул веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) продуктов окислительной деградации иммуноглобулинов при появлении в морфологической картине сыворотки крови штриховых трещин в центральной зоне, и развитии ацидоза.
Впервые установлено, что механизмы воздействия озона на белки обусловлены их окислительной модификацией при свободнорадикальном окислении, .что сопровождается изменениями в структурном
8 макропортрете плазмы крови; при этом эффект определяется как концентрацией 03, так и исходным состоянием протеина.
Теоретическая и практическая значимость работы Работа является фундаментальным теоретическим исследованием с перспективным практическим выходом. Проведенные исследования углубляют существующие представления о роли протеинов в. формировании морфологической структуры плазмы крови в норме и о молекулярно-биохимических механизмах нарушения их конформации при интоксикации.
По результатам исследования внедрены критерии для оценки пространственной структуры молекул протеинов, которые' могут быть использованы для определения класса опасности водных отходов (патент на изобретение № 2369867 от 10.10.09г.), диагностики эндогенной интоксикации (патентная заявка №2007139372 от 25.10.07г., положительное решение от 11.08.09 г.) и наркотического отравления (патент на изобретение N2332666 от 27.09.08г.). Последний способ исследования рекомендован к применению в работе судебно-медицинских экспертов (Информационно-методическое письмо от 15.09.08 г.) и награжден дипломом III степени на Ш-ем конкурсе объектов интеллектуальной собственности Нижегородской области им. И.П. Кулибина в номинации «Медицина» 2008 г.
Основополагающее значение в применении метода клиновидной дегидратации в клинической и исследовательской практике имеет выявленное месторасположение белков в фации сыворотки крови с помощью разработанной модификации с применением красителей (патентная заявка № 2008111262 от 24.03.08г., положительное решение от 01.06.09 г.).
- Установленный химический состав включений в краевой зоне фации плазмы крови, обусловленный фракциями билирубина, позволяет
9 применять метод клиновидной дегидратации для диагностики билирубинопатий.
Результаты исследования воздействия озона на пространственную структуру белковых молекул плазмы крови научно обосновывают применение метода клиновидной дегидратации для подбора дозы Оз при озонотерапии.
Полученные результаты диссертационной работы внедрены в практику Государственного учреждения здравоохранения Нижегородское областное бюро судебно-медицинской экспертизы, а также используются в лекциях и семинарах на кафедре клинической лабораторной диагностики ГУЗ Нижегородской государственной медицинской академии.
Положения, выносимые на защиту:
1.Локализация белковых фракций в структурном макропортрете сыворотки крови складывается следующим образом: альбумины- краевая зона; а и р-глобулины- промежуточная зона, у-глобулины- центральная зона.
Особенности строения молекул белка определяет характер трещин фации его раствора.
Отличие в форме трещин структурного макропортрета сыворотки крови у животных различных таксономических групп обусловлены разным составом и пространственной структурой ее белков, причем отличия тем более выражены, чем более далеки друг от друга организмы в филогенетическом отношении.
4.Воздействие солей металлов и соединений различных классов опасности на сывороточный альбумин приводит к формированию аномальных особенностей в структурном макропортрете его раствора.
5.Неспецифическим механизмом развития интоксикации является нарушение структуры белков, вызванное их окислительной модификацией при активации свободнорадикальных процессов, что обуславливает
10 появление в структурном макропортрете плазмы крови аномальных особенностей.
б.Воздействие озона на белки плазмы крови заключается в их окислительной модификации, направление и степень которой определяются как используемой концентрацией озона, так и структурными особенностями белковых молекул. Низкие дозы озона способны снижать уровень окислительной модификации белков плазмы крови больных.
Апробация работы
Основные положения работы были доложены ' и обсуждены на
научно-практическом симпозиуме «Принципы и способы лабораторного
обеспечения внебольничной помощи и актуальные проблемы
лабораторной медициньі>> (Москва, 2001), конференции ДиаМА
«Актуальные проблемы деятельности диагностических центров в
современных условиях», (Иркутск, 2001), Юбилейной научно-
практической конференции, посвященной 90-летию член-корр. АМН
СССР; профессора Н.Ю. Беленкова (Нижний Новгород, 2007), IV
Украинско-Русской научно-практической конференции с международным
участием «Озон е биологии и медицине» (Украина, Ялта, 2008), XVI
Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые
информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и
экологии» (Украина, Гурзуф, 2008), Всероссийском научно-прикладном
семинаре «Озон и другие экологически чистые окислители. Наука и
технологии» (Москва, 2008), V Международной научной конференции
«Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация для
нанотехнологий, техники и медицины» (Иваново, 2008), П
Международной конференции «Высокоинтенсивные физические факторы в медицине, биологии, экологии и сельском хозяйстве» (Саров, 2008), 19th World Congress & Exhibition International Ozone Association (Tokyo, Japan, 2009), VHI Всероссийской научно-практической конференции с
международным участием «Озон, активные формы кислорода и методы интенсивной терапии в медицине)) (Н.Новгород, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 36 работ, из них 12- в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК МО РФ; 1- учебно-методическое пособие; получены 2 патента РФ.
Объем и структура диссертации Работа изложена на 258 страницах машинописного текста; состоит из введения; обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов; выводов, списка литературы, включающего 404 источников, из которых 261-отечественных и 143 иностранных, приложения; содержит 50 таблиц и 73 рисунка.
