Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Ферменты деполимеризации нуклеиновых кислот, классификация. 9
1. 1. 1. Локализация нуклеаз в клетке 13
1.1.2. Структура ферментов 17
1.1. 3. Механизм действия и специфичность нуклеаз 23
1.2. Особенности нуклеаз водных организмов 29
1. 3. Биологическая роль кислых нуклеаз 34
1.4. Участие ферментов лизосом в адаптивных реакциях гидробионтов к некоторым факторам среды
Глава 2. Материал и методы исследований 48
2. 1. Характеристика материала 48
2. 1. 1. Объекты исследования 48
2.1.2. Определение возраста, пола и стадии зрелости гонад 49
2. 1. 3. Отбор и хранение биологических проб 50
2.2. Методы исследований 50
2.2.1. Приготовление гомогенатов тканей 50
2. 2. 2. Определение активности кислых нуклеаз 51
2.2. 3. Количественное определение содержания белка в тканях 52
2.2.4. Выявление множественных форм кислой дезоксирибонуклеазы методом электрофореза в полиакриламидпом геле
2.2.5. Статистическая обработка данных 54
Результаты и их обсуждение 55
Глава 3. Распределение нуклеазной активности лизосом в органах и тканях различных видов рыб
Глава 4. Влияние различных типов антропогенного загрязнения на активность кислых нуклеаз водных организмов
4. 1. Влияние накопления ртути в тканях рыб в сочетании с закислением и гумификацией водоема на активность кислых нуклеаз окуня Perca fluviatilis
4. 2. Изменение активности лизосомальных нуклеаз пресноводных рыб при загрязнении водоема отходами предприятий горно-обогатительной и металлургической промышленности Кольского полуострова 76
4. 3. Влияние антропогенного загрязнения морских побережий на активность кислых нуклеаз беспозвоночных гидробионтов
4.4. Изменение нуклеазной активности лизосом двустворчатых моллюсков Mytilus edulis L. под действием нефтепродуктов и буровых растворов в аквариальных экспериментах
Глава 5. Влияние естественных (абиотических и биотических) факторов на нуклеазную активность лизосом морских гидробионтов
5. 1. Изменение активности кислых нуклеаз беломорских мидий Mytilus edulis L. в условиях экспериментальной аноксии
5. 2. Лизосомальные нуклеазы в приспособительных реакциях морских моллюсков к различной солености воды
5. 3. Влияние биотических взаимодействий на биохимические показатели мидий Mytilus edulis
Глава 6. Альтерации спектра множественных молекулярных форм кислой дезоксирибонуклеазы под действием различных факторов среды
Заключение ш
Выводы
Используемые сокращения 135
Список литературы 136
Приложение 167
- Механизм действия и специфичность нуклеаз
- Количественное определение содержания белка в тканях
- Изменение активности лизосомальных нуклеаз пресноводных рыб при загрязнении водоема отходами предприятий горно-обогатительной и металлургической промышленности Кольского полуострова
- Изменение активности кислых нуклеаз беломорских мидий Mytilus edulis L. в условиях экспериментальной аноксии
Введение к работе
Актуальность темы. Проблема адаптации является центральной проблемой в биологии. По определению Дж. Харборна (1985), адаптация «представляет собой способность живых организмов приспосабливаться к изменяющимся условиям окружающей среды с одновременным повышением вероятности выживания и самовоспроизводства». На клеточном и тканевом уровне приспособительные реакции осуществляются за счет биохимических процессов, изменяющих тип, количество и функциональную активность таких биополимеров, как многочисленные ферменты и функционально специализированные неферментные белки (Хочачка, Сомеро, 1988). Включение механизмов биохимической адаптации невозможно без участия другой важнейшей группы биополимеров - нуклеиновых кислот.
ДНК является носителем наследственной информации. В основе реализации генетической информации, закодированной в геноме клетки, лежат три фундаментальных процесса - репликация (синтез ДНК), транскрипция (синтез РНК) и трансляция (синтез белка). Чрезвычайная важность ДНК и РНК в развитии и жизнедеятельности живых организмов обусловливает интерес к ферментам, участвующим в обмене нуклеиновых кислот.
Многочисленная группа ферментов, осуществляющих расщепление нуклеиновых кислот с образованием фрагментов различной длины, объединяется под названием нуклеазы (Шапот, 1968). К настоящему моменту детально изучены нуклеазы микроорганизмов (Desai, Shankar, 2003; Condon, 2003; Persson et al., 2000), млекопитающих и человека (Барановский и др., 2004; Ikeda et al., 1997; Brambila et al., 2001; Krieser et al., 2002; Evans, Aguilera, 2003), некоторых насекомых (Бочкова, 1980; Коничев и др., 1982; Kawane et al., 2003; Evans et al., 2002). Работы no изучению нуклеаз рыб и других водных организмов единичны (Бердышев, Бабенюк, 1985; Parnsnitskaia et al., 1972; Wagner et al., 1981; Thebault, Raffin, 1984).
Нуклеазы с максимальной активностью при кислых значениях рН локализованы, преимущественно, в лизосомах, где наряду с другими кислыми гидролазами осуществляют катаболические реакции, лежащие в основе важнейших физиологических и биохимических процессов (Покровский, Тутельян, 1976; Высоцкая, Руокалайнен, 1993). В частности, лизосомальным ферментам принадлежит большая роль в процессах внутриклеточного переваривания биополимеров, аутолизе структур и клеток, утративших своё значение, а также, в процессах оплодотворения, спермато- и оогенеза, метаморфоза, дифференцировки, деления и старения клеток, апоптозе, в защите организма от чужеродных агентов, начальных стадиях иммуногенеза, лизисе тканей при повреждении, детоксикации ксенобиотиков (Покровский, Тутельян, 1976; Немова, Высоцкая, 2004; Кулинский, 1999; Барановский и др., 2004; Kohler et al., 2002; Reddy et al., 2001; Evans, Aguilera, 2003; Terman et al., 2006).
Однако, не смотря на столь пристальное внимание, уделяемое роли лизосомальных нуклеолитических ферментов в различных физиологических и патологических процессах, значимость кислых нуклеаз в адаптации практически не исследована. Между тем, изучение модуляции нуклеазной активности лизосом под действием тех или иных факторов именно у водных обитателей, характерной особенностью которых является более тесная связь со средой, могло бы внести существенный вклад в понимание биохимических адаптивных механизмов живых существ.
Цели и задачи исследования. Цель работы - изучение активности кислых РНКаз и ДНКаз морских и пресноводных организмов, принадлежащих к разным таксонам, выяснение роли нуклеаз в приспособительных реакциях гидробионтов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи: определить активность кислых нуклеаз в органах и тканях рыб и беспозвоночных гидробионтов;
исследовать значимость нуклеаз в ответных реакциях пойкилотермных животных при воздействии на них естественных и антропогенных факторов среды;
изучить фракционный состав кислых нуклеаз у разных видов гидробионтов;
выяснить возможность применения исследуемых показателей в эколого-биохимическом мониторинге водоемов.
Научная новизна работы. Получены новые данные по изменению активности и молекулярной гетерогенности состава кислых нуклеаз морских и пресноводных гидробионтов под действием естественных факторов среды (соленость, гипоксия) и различных типов антропогенного загрязнения водоемов (тяжелые металлы, нефтепродукты, компоненты буровых растворов). Впервые показана возможность применения теста активности лизосомальных нуклеаз для оценки химических взаимовлияний животных в сообществах обрастания. Впервые исследована нуклеазная активность лизосом морских беспозвоночных. Охарактеризован спектр изоформ кислой дезоксирибонуклеазы у ранее не изученных в этом отношении объектов.
Практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о роли лизосомальных нуклеаз в биохимических адаптациях водных организмов к естественным, антропогенным и биотическим факторам окружающей среды. Результаты исследований по влиянию различных типов загрязнения воды на исследуемые биохимические показатели указывает на возможность их применения в эколого-биохимическом мониторинге для оценки физиологического состояния гидробионтов при техногенной трансформации водных экосистем.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Карельский НЦ РАН, Петрозаводск, 2004), международной конференции «Проблемы изучения,
рационального использования и охраны ресурсов Белого моря»
(Карельский НЦ РАН, Петрозаводск, 2004), научной школе-конференции
«Современные проблемы биологии развития и биотехнологии» (ИБР,
Звенигород, 2005), международной конференции молодых исследователей
«Физиология и медицина» (ИЭФиБ и СПбГУ, Санкт-Петербург, 2005), XII
молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и
экологии» (Коми НЦ Уральское отделение РАН, Сыктывкар, 2005),
конференции «Структурно-функциональные особенности биосистем
Севера (особи, популяции, сообщества)» (ПетрГУ, Петрозаводск, 2005),
международной конференции «Современные проблемы водной
токсикологии» (ИБВВ РАН, Борок, 2005), IV международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов европейского севера» (Вологда, 2005), международной школе молодых ученых «Адаптации гидробионтов» (Ростов-на-Дону, 2005), X Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущинский НЦ РАН, Пущино, 2006), международной конференции Московского общества испытателей природы «Биотехнология - охране окружающей среды» (МГУ, Москва, 2006), международной конференции, посвященной 60-летию Карельского НЦ, «Северная Европа в XXI веке: природа, культура, экономика». Секция «Биологические науки» (Карельский НЦ РАН, Петрозаводск, 2006), X научной конференции Беломорской биологической станции МГУ (пос. Пояконда, 2006), выездном заседании Бюро Отделения биологических наук РАН (Петрозаводск, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ, из которых 11 статей и 14 тезисов докладов, в том числе, в центральной реферируемой печати статья и краткое сообщение.
Считаю своим долгом выразить огромную благодарность всем сотрудникам лаборатории экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАН за участие и поддержку, ценные рекомендации и помощь в работе.
Особая благодарность моему научному руководителю д.б.н Римме Ульяновне Высоцкой.
Благодарю кб.н. И. Н. Бахмета, к.б.н. Н. К. Шустову, Н. Н. Фокину за организацию аквариальных экспериментов и к.б.н. В. В. Халамана, за новое интересное направление исследований.
Хочу поблагодарить моих первых учителей в области биохимии -преподавателей кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ, а также моих родных и близких за понимание и моральную поддержку.
Механизм действия и специфичность нуклеаз
В основе субстратной специфичности того или иного нуклеолитического фермента лежат особенности организации активного центра, обеспечивающие узнавание и специфическое взаимодействие аминокислотных остатков с молекулой нуклеиновой кислоты, формируя, тем самым, оптимальную конформацию фосфодиэфирной связи, которая подвергается расщеплению (Штадлер и др., 2006). В связи с этим, представляется более логичным характеризовать строение активного центра энзимов совместно с механизмом катализа, нежели в разделе, касающемся структурной организации нуклеаз.
Одним из самых изученных ферментов, для которого известны структура активного центра и механизм гидролиза ДНК, является ДНКаза I млекопитающих. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, топография активного центра ДНКазы I практически аналогична у ферментов из тканей человека и панкреатической бычьей ДНКазы. Высокая степень консервативности отмечена для аминокислот, участвующих в связывании и гидролизе ДНК (Pan, Lazarus, 1997).
ДНКаза I взаимодействует только с малой бороздкой В-формы ДНК, которая полностью заполняется боковой цепью Arg41 и экспонированной петлей с Туг76, в то время как положительно заряженные и гидрофильные АК образуют контакты с несколькими фосфатами обеих цепей на протяжении шести пар оснований. Необычный гидрофобный контакт Туг76 с дезоксирибозой приводит к инверсии конфигурации у атакуемого атома фосфора и в значительной степени отвечает за конформационные изменения в молекуле ДНК: малая бороздка расширяется на 3 А, а двойная спираль изгибается на 20 в сторону большой бороздки. Туг76 и Arg41 нужны как для связывания фермента с ДНК, так и для правильной ориентации атакуемой фосфодиэфирной связи (Doherty et al., 1995). Практически единственной АК, взаимодействующей с основаниями ДНК, является Arg41. Этот остаток аргинина взаимодействует с 02- либо КЗ-атомами пиримидинов и пуринов соответственно в комплементарной к разрезаемой цепи ДНК (в 3 и 4 положениях к 3 -концу от сайта расщепления). Большую часть контактов фермента с дезоксирибозофосфатным остовом ДНК составляют водородные связи, тогда как, связь ионного характера образуется только между Arglll и фосфатом, примыкающим к разрезаемой группе.
Расщепление ДНК происходит по механизму кислотно-основного катализа с участием двух гистидинов: His 134 действует как основание, акцептируя протон у молекулы воды, a His252 — как кислота, отдающая протон уходящей ОЗ -группе (Jones et al., 1996). Активированная молекула воды осуществляет нуклеофильную атаку (SN2 механизм) по атому фосфора, электрофильность которого увеличивается благодаря взаи-модействию иона Mg с атомом кислорода фосфатной группы, и расщепляет Р-ОЗ -связь (рис. 2).
Нейтральная дезоксирибонуклеаза І в 100—500 раз лучше гидролизует ds-участки ДНК по сравнению с ss-фрагментами, что объясняется взаимодействием фермента с обеими цепями молекулы субстрата (Drew, 1984). ДНКаза I не проявляет специфичности к определенным основаниям и последовательностям ДНК, но чувствительна к конформации двойной спирали (Jones et al., 1996). Скорость гидролиза сильно зависит от таких параметров двойной спирали, как ширина и глубина малой бороздки, а также от жесткости структуры. Наилучшим субстратом для дезоксирибонуклеазы I является В-форма ДНК со смешанным составом, тогда как протяженные А-Т или G-C участки относительно устойчивы к гидролизу.
Большие различия (до двух порядков) в эффективности расщепления фосфодиэфирных связей между соседними основаниями, по-видимому, объясняются влиянием локальных параметров двойной спирали, таких как угол поворота спирали и ориентация атакуемой фосфатной группы. Заметный вклад в специфичность гидролиза вносит взаимодействие Arg41 с двумя основаниями комплементарной цепи (Doherty et al., 1995). Вследствие особенности строения малой бороздки, четыре фосфодиэфирные связи с 5 -конца оказываются полностью устойчивыми к гидролизу, что объясняет неспособность фермента к гидролизу полинуклеотидов по экзонуклеолитическому типу (Drew, 1984).
Также влияние на специфичность гидролиза оказывают ионы двухвалентных металлов, что обусловлено влиянием как на конформацию ДНК, так и на механизм действия дезоксирибонуклеазы. Например, катионы Си и Hg обладают высоким сродством к гуанину и тимину соответственно, защищая эти положения от атаки ферментом (Junowicz, Spencer, 1973а, 1973b; Clark, Eichhorn, 1974).
Как известно, ДНКаза I относится к классу Mg2+-Ca2+ - зависимых нуклеаз. Ион Mg участвует в электрофильном катализе расщепления фосфодиэфирной связи, тогда как ионы Са необходимы для поддержания оптимальной конформации фермента (Suck, 1994). В связывании одного или двух ионов Mg в активном центре принимают участие Glu39 и/или Asp 168 (Suck, 1994; Jones et al., 1996). Этот центр характеризуется низким сродством и может с различной Наличие иона Са в этом центре приводит к стабилизации петли Asp201hr207, что имеет важное значение для защиты дисульфидного мостика С173-209 от восстановления, а также значительно повышает устойчивость к атаке сериновыми протеазами в области Serl74-Serl79. Второй Са -связывающий центр образован тремя АК: Asp99, Asp 107, Glul 12 и стабилизирует петлю Asp99Aspl07, что влияет на конформацию примыкающей петли 73-76, которая связывается с малой бороздкой субстрата (Pan, Lazarus, 1999). Увеличение скорости реакции гидролиза ДНК в присутствии СаСІ2 обусловлено в основном повышением сродства ДНКазы к субстрату, в то время как Vmax фермента остается неизменной. Более прочное взаимодействие фермента с ДНК приводит к увеличению процессивности гидролиза и повышению доли ds-разрывов в молекуле субстрата. Интересно, что добавление положительно заряженных АК на поверхности ДНКазы I человека, образующих дополнительные контакты с субстратом, привело к значительному снижению Кт и увеличению процессивности гидролиза, при этом потребность фермента в ионах Са2+ существенно снизилась (Pan, Lazarus, 1997).
Количественное определение содержания белка в тканях
Для количественного определения концентрации белка использовали метод Лоури (Lowry et al., 1951). Объем исследуемого образца (0,02 мл) доводили до 1 мл бидистилированной водой. Затем к пробе приливали 4 мл свежеприготовленного биуретового реактива и оставляли на 10 минут при комнатной температуре. После чего в реакционную смесь добавляли 0,4 мл реактива Фолина, пробы тщательно перемешивали и оставляли на 1 ч для развития окраски. Затем измеряли оптическую плотность растворов на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной рабочей грани 10 мм против контроля. Контролем служила холостая проба, содержащая вместо ферментной вытяжки 1 мл бидистилированной воды. Концентрацию белка в исследуемом растворе определяли по калибровочной кривой построенной по БСА (бычий сывороточный альбумин).
Эти данные использовали при расчете удельной активности нуклеаз (ДЕ260/ мг белка).
Фракционирование кислой ДНКазы осуществляли по несколько модифицированной методике энзим-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) (Коничев и др., 1980; Попов и др., 2003). В работе использовали прибор фирмы «Biorad» для ЭФ в вертикальных пластинах геля толщиной 0,75 мм. Учитывая, что недостатком полиакриламидных гелей является невысокая воспроизводимость их свойств, сравнительный анализ осуществляли в пределах одного электрофоретического разделения (Груздев, 1993).
ПААГ готовили из стандартных растворов реактивов для электрофореза в щелочной среде по методике Дэвиса (Davis, 1964; Маурер, 1971). Концентрация разделяющего геля составляла 7,5 %. Концентрирующего - 2,5 %. Для выявления дезоксирибонуклеазной активности белковых фракций в состав разделяющего геля включали промышленный препарат высокополимерной ДНК из эритроцитов цыплят (0,4 мг / мл геля). В каждую лунку вносили по 0,15 мл ферментного образца. Электрофорез проводили в 0,032 М трис-глициновом буферном растворе (рН 8,9). Для маркировки движущегося пограничного слоя использовался краситель - бромфеноловый синий. Температуру электрофорезной камеры поддерживали на уровне 5 - 7 С. До момента вхождения белков в гель напряжение составляло 150 V, после формирования отчетливой стартовой зоны напряжение в камере увеличивали до 200 V. В таком режиме электрофорез продолжался около 1,5 часов. Активность кислой ДНКазы в ПААГ выявляли по методу Бойда (Boyd, 1970). По окончании электрофореза пластины геля аккуратно снимали со стекол, промывали дистиллированной водой и погружали в холодный 0,05 М ацетатный буфер (рН 5,0). Через 30 мин буферный раствор заменяли на свежий и проводили инкубацию гелей при 37 С в течение 45 минут для осуществления ферментативного гидролиза заполимеризованной в ПААГ ДНК. Затем реакцию останавливали сменой инкубационного буфера на 1 М уксусную кислоту. Через 10 мин гели промывали дистиллированной водой и помещали на 30 мин в 0,2 %-ный раствор метиленового синего на инкубационном буфере. Использовали только свежеприготовленный, профильтрованный раствор красителя. Избыток красителя отмывали 5%-ной уксусной кислотой в течение 1,5 - 2,5 часов, меняя раствор каждые полчаса, а затем дистиллированной водой до появления четких бесцветных зон активности ДНКазы на синем фоне геля. Проявленные энзимограммы хранили в 5%-ной хлорной кислоте.
Результаты исследований обработаны общепринятыми статистическими методами (Кокунин, 1975). Достоверность различий между сравниваемыми группами оценивали с помощью критерия Стьюдента для малых выборок (п 30). Различия между выборками считали достоверными при р 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Распределение нуклеазной активности лизосом в органах и тканях различных видов рыб
Принцип изучения адаптивных реакций на биохимическом уровне, как известно, базируется на сопоставлении тех или иных биохимических показателей организмов под действием интересующего исследователя фактора и без экзогенного влияния. Совершенно очевидно, что для адекватной интерпретации результатов подобного рода экспериментов совершенно необходимо иметь как можно более полное представление о протекании изучаемых метаболических процессов у данного вида в нормальных условиях. Определение тестируемых показателей у представителей разных видов рыб в естественной среде обитания позволит с большей уверенностью судить о том, являются ли обнаруженные в натурном или экспериментальном исследовании особенности биохимического ответа организмов следствием различной устойчивости видов или полов к влиянию изучаемого фактора или же выявленные закономерности обусловлены иными причинами.
Лизосомы присутствуют во всех клетках животных, за исключением, быть может, зрелых эритроцитов. Однако количественные и качественные характеристики лизосомальных ферментов в разных органах могут варьировать, в связи с дифференциацией клеток высокоразвитых организмов и приобретением лизосомами, помимо внутриклеточного пищеварения, дополнительных функций, таких как, макрофагия, кринофагия, участие в апоптозе и иммуногенезе и др. (Покровский, Тутельян, 1976; Покровский, Крыстев, 1977;HaIton, 1997).
Исходя из сказанного выше, было предпринято исследование тканевого распределение активности кислых нуклеаз в различных органах и тканях рыб. Объектами исследования являлись рыбы, выловленные в 2000 - 2005 гг. из ряда относительно чистых водоемов Карелии и Мурманской области, традиционно используемых нами в качестве контрольных (см. приложение). Всего было исследовано 6 видов пресноводных (щука Esox lucius, окунь Perca jluviatilis, судак Lucioperca lucioperca, сиг Coregonus lavaretus, ряпушка Coregonus albula, лещ Abramis brama) и 2 вида морских рыб (навага Eleginus navaga, треска Gadus morhua). Активность ферментов определяли в печени, жабрах, гонадах, почках и мышцах рыб.
Анализ полученных данных позволяет отметить несколько тенденций в тканевом распределении активности лизосомальных нуклеаз. В целом, соотношение уровня дезоксирибонуклеазной и рибонуклеазной активности в кислой области рН в различных органах совпадает (табл. 2 и 3). Максимальная активность лизосомальных нуклеаз присуща активно метаболизирующим органам, таким как, печень и почки. Несколько ниже, но также достаточно высокая нуклеазная активность лизосом отмечена в жабрах рыб. Наименьшей активностью характеризуется мышечная ткань. Особенно высокий уровень активности лизосомальных ДНКазы и РНКазы отмечается в гонадах половозрелых самцов.
Активность кислой ДНКазы (табл. 2), как правило, несколько ниже, чем рибонуклеазы (табл. 3) в том же органе отдельного вида рыб. В печени и жабрах рыб уровень активности лизосомальной ДНКазы у самцов был достоверно ниже по сравнению с самками у всех видов, за исключением трески G. morhua. Для рибонуклеазной активности такой однозначности при анализе различий показателей самцов и самок не выявлено.
Установленные закономерности распределения активности кислых РНКазы и ДНКазы в тканях рыб обнаруживают значительное сходство с количественным соотношением лизосом в исследованных тканях, описанным в литературе для разных объектов (Покровский, Тутельян, 1976; Покровский, Крыстев, 1977). Различие в содержании лизосом в тканях и органах, обнаруженное как путем непосредственного наблюдения в гистологических препаратах, так и по активности маркерного фермента этих органелл - кислой фостфатазы, связано со специализацией функций клеток в сложноорганизованных многоклеточных организмах (Покровский, Тутельян, 1976; Покровский, Крыстев, 1977; Высоцкая, 1999). Варьирует не только количество самих лизосом, но и их ферментный состав. Однако обе кислые нуклеазы всегда присутствуют в первичных лизосомах (протолизосомах) - вновь образованные органеллы, еще не вовлеченные в процесс переваривания каких-либо веществ (Покровский, Тутельян, 1976). Поэтому в отсутствии специфических влияний, способных в значительной мере модулировать лизосомальную нуклеолитическую активность, есть все основания полагать, что наблюдаемый уровень активности ферментов при нормальном метаболизме обусловлен, главным образом, количеством лизосом в исследуемых тканях.
Изменение активности лизосомальных нуклеаз пресноводных рыб при загрязнении водоема отходами предприятий горно-обогатительной и металлургической промышленности Кольского полуострова
Интенсивное развитие горно-обогатительной и металлургической промышленности в Мурманской области в XX веке, а также особенности переноса воздушных масс в Северном полушарии, на сегодняшний день обуславливает львиную долю экологических проблем Северо-Западного региона России. Сильную тревогу вызывает трансформация водных экосистем под действием стоков предприятий горно-перерабатывающего комплекса. При этом среди множества органических и неорганических компонентов техногенных вод наибольшую опасность представляют тяжелые металлы, так как, помимо высокой токсичности, они не разлагаются со временем, способны включаться в трофические цепи и обладают потенциальной способностью аккумулироваться в тканях гидробионтов (Комаровский, Полищук, 1981; Кашулин и др., 1999; Sorensen, 1992; Moiseenko, Kudryavtseva, 2002). Однако при всей очевидности угрозы данного типа загрязнения и его широком распространении в России действие соединений тяжелых металлов на отдельные стороны метаболизма рыб исследовано недостаточно.
Влияние горно-обогатительного производства на водные экосистемы изучали на двух представителях сиговых рыб: ряпушка Coregonus albula L. и сиг Coregonus lavaretus L., выловленных в летний период 2003 г. из озера Ковдор. Данный водоем испытывает сильную антропогенную нагрузку, и в наших исследованиях рыбы из этого озера приняты за опытную группу. Условным контролем служили экземпляры сиговых рыб из водоемов, не испытывающих значительного загрязнения: водохранилище Нижняя Пиренга (сиг) и оз. Сямозеро (ряпушка).
Озеро Ковдор испытывает мощное загрязнение сточными водами Ковдорского ГОКа, занимающегося добычей и обогащением комплексных железных и апатит-баделитовых руд, а также коммунально-бытовыми стоками г. Ковдор. Гидрохимический состав воды характеризуется высоким содержанием стронция, железа, алюминия, марганца и кадмия (в порядке убывания), так же отмечается повышенная концентрация анионов: сульфатов, фосфатов и, в особенности, нитратов.
Качество поверхностных вод водохранилища Нижняя Пиренга признано удовлетворительным. Содержание в воде озер потенциально опасных (при повышенных концентрациях) микроэлементов не превышает ПДК для воды рыбохозяйственных водоемов. Реакция воды исследуемых водоемов близка к нейтральной (рН водохранилища колеблется в интервале 6,66-7,23, в озере Ковдор среднее значение рН смещено в щелочную область и составляет - 7,98). (Подробная гидрохимическая характеристика водоемов приведена в таблице 12 в приложении.)
Сравнительный анализ полученных данных выявил значительные различия в органах ряпушки Coregonus albula из разных мест обитания. В целом, для активности кислой ДНКазы характерно повышение во всех тканях рыб из загрязненного водоема, за исключением гонад (рис. 6). Максимальные отличия значений ДНКазной активности зафиксированы в печени самок - активность фермента ковдорской ряпушки выше «контрольного» уровня рыб из оз. Сямозеро в 3 раза.
Следует отметить, что изменения активности кислой ДНКазы под действием техногенного загрязнения воды в тканях ряпушки обоих полов однонаправлены и отличаются лишь амплитудой - у самцов различия выше в среднем в 1,5 раза, по сравнению с самками. В то же время характер изменение рибонуклеазной активности рыб (рис. 7) имеет ярко выраженную половую специфику. Кроме того, активность кислой РНКазы резко различается у сямозерскои ряпушки разных полов. Особенно обращает на себя внимание дисбаланс активности данного фермента в печени и жабрах самцов из «контрольного» водоема. У самок ряпушки рибонуклеазная активность в указанных органах имеет сходный уровень.
Достоверное снижение активности обеих нуклеаз отмечено только в гонадах самок ряпушки.
В тканях сигов Coregonus lavaretus наблюдалась иная картина изменения исследуемых биохимических показателей. У рыб из загрязненного озера Ковдор нуклеолитическая активность лизосом, в целом, была снижена по сравнению с контролем. Причем, различия в содержании ДНКазы (рис. 8) были более значительны, чем для РНКазы (рис. 9), и составляли 32,5 % - 75,6 % и 5,5 %- 56,0 % соответственно. Наибольшее различие наблюдалось в содержании исследуемых ферментов в гонадах половозрелых самцов.
Сопоставление данных по изменению нуклеазной активности в тканях ряпушки С. albula и сига С. lavaretus показало, что биохимическая реакция изученных видов на загрязнение водоема промстоками ГОКа неодинакова. Повышение исследуемых показателей у ковдорской ряпушки по сравнению с контрольным уровнем ферментативной активности свидетельствует о значительных перестройках метаболизма, имеющих, по всей видимости, приспособительное значение. Чрезвычайно показательна в этом плане резкая активация лизосомальных нуклеаз в печени рыб из загрязненного водоема, указывающая на мобилизацию защитных функций данного органа. Детоксикационные системы печени С. albula при данном уровне антропогенной нагрузки, очевидно, оказываются достаточно эффективными для предотвращения значительного негативного воздействия ксенобиотиков в других органах и тканях рыб, о чем можно судить по отсутствию характерного ингибирования дезоксирибонуклеазной активности в условиях интоксикации организма тяжелыми металлами.
Как известно, уровень аккумуляции того или иного металла в живом организме определяется соотношением процессов поступления и выведения ксенобионтного вещества (Челомин и др., 1998; Кашулин и др., 2004; Немова, 2005; Grahl et al., 1985; Ribeyre, Boudon, 1998). Немаловажную роль в экскреции металлов играют лизосомальные ферменты (Sternlieb, Goldfisher, 1976; Klemm et al., 1998). Лизосомы способны соединяться с фагосомами, содержащими какие-либо комплексы (углеводные или белковые) с чужеродными веществами, и затем в ходе экзоцитоза поглощенных веществ частично осуществляют гидролитическую модификацию этих комплексов, направленную на уменьшение их молекулярного веса и повышение гидрофильности для облегчения дальнейшего выведения токсиканта из организма (Покровский, Крыстев, 1977; Высоцкая, Сидоров, 1981; Viarengo et al., 1989; Rousse et al., 1997).
Изменение активности кислых нуклеаз беломорских мидий Mytilus edulis L. в условиях экспериментальной аноксии
Как известно, водные обитатели удовлетворяют энергетические потребности организма, поглощая растворенный в воде кислород (Озернюк, 1992). Изъятие гидробионтов из водной среды, как правило, приводит к развитию гипоксии и быстрой гибели организма. Однако есть исключение -животные приливно-отливной зоны, обладающие способностью к длительному существованию в бескислородных условиях. В условиях недостатка кислорода организмы переключаются на эндогенные источники обеспечения энергией (Горомосова, Шапиро, 1984; Хочачка, Сомеро, 1988; Немова, Высоцкая, 2004). Мобилизация клеточных резервов при переходе к анаэробному метаболизму сопряжена с усилением катаболических процессов в тканях (Немова, Высоцкая, 2004). В связи с этим, исследование роли лизосомальных ферментов в приспособительных рекциях литоральных моллюсков к анаэробиозу представляется весьма важным.
Повышенный интерес ученых к изменению тех или иных биохимических показателей морских двустворчатых моллюсков в условиях гипоксии или полной аноксии связан еще и с популярностью использования Bivalvia в качестве биотестов загрязнения морских акваторий. Присутствие в морской воде некоторых типов поллютантов способно вызвать у моллюсков асфиксию даже при нормальном содержании кислорода в воде вследствие нарушения фильтрационного аппарата или долговременной изоляции моллюсков от окружающей среды при смыкании сворок раковины (Горбунова, 1988; Venier et al., 2006; Altieri, Witman, 2006). Понимание механизмов адаптации мидий к кислородной недостаточности необходимо для адекватной интерпретации результатов эколого-токсикологических исследований (Горомосова, 1979; Горомосова, Таможняя, 1979; Шапиро, Бобкова, 1979; Veldhuizensoerkan 103 et al., 1991; Guerra-Rivas et al., 2002; Venier et al., 2006; Altieri, Witman, 2006). С целью изучения изменений активности кислых ДНКазы и РНКазы при краткосрочной аноксии в 2003 году на Беломорской биостанции «Картеш» ЗИН РАН был поставлен эксперимент, в ходе которого мидий Mytilus edulis L. помещали в аквариумы без воды в изотермической комнате (температура 10 С). Контрольные моллюски содержались в аэрируемой природной морской воде. В эксперименте сравнивали реакцию двух экологических групп моллюсков, различающихся в природе условиями существования - литоральных, подверженных периодическому обсыханию, и сублиторальных (плотовых мидий), постоянно находящихся в воде. Экспозиция опыта составляла 24 часа. Активность нуклеаз определяли в гомогенатах цельных моллюсков (n = 5). Полученные данные показали, что у моллюсков, находившихся без воды в течение суток, наблюдается повышение активности кислых нуклеаз (рис. 15). У литоральных мидий повышается активность обеих нуклеаз, у сублиторальных - только ДНКазная активность. Извлечение моллюсков из водной среды означает не только прекращение поступления кислорода, но и дефицит пищи, поэтому активация лизосомального аппарата, в данном случае, обусловлена не только с запуском альтернативных путей получения энергии, но и переключением метаболизма на эндогенные источники пластических веществ. Прирост нуклеолитической активности в тканях моллюсков свидетельствует об усилении катаболизма нуклеиновых кислот. В условиях аноксии продукты полного гидролиза нуклеиновых кислот, осуществляемого нуклеазами совместно с другими фофодиэстеразами лизосом, могут быть использованы в клетке для новых синтезов, адекватных потребностям организма. Компенсаторные перестройки метаболизма при гипоксии, главным образом, направлены на модуляцию качественного и количественного состав ферментов энергетического и углеводного обмена, регуляторных мононуклеотидов и поддержания физиологического уровня макроэргов (Горомосова, Шапиро, 1984; Ibarguren et al., 1989; Vazquez-Illanes et al., 1991; Fan et al., 1991; Fernandez et al., 1998; Diaz-Enrich et al., 2002).
При переходе к анаэробиозу на энергетические системы клетки падает повышенная нагрузка, что приводит к более быстрому «износу» митохондрий (Покровский, Тутельян, 1977; Панин, 1978; Mela, 1976; Bacchiocchi, Principato, 2000). В научной литературе имеются указания на то, что лизосомальные ферменты принимают участие не только в репаративном распаде этих органелл, но и стимулируют их репродукцию (Фролов, 1974; Decker, Wildenthal, 1980). Возможно, повышение дезоксирибонуклеазной активности связано с участием в указанных процессах.
При анализе результатов эксперимента обращает на себя внимание более высокий уровень активности исследуемых ферментов в тканях литоральных моллюсков как в опыте, так и в контрольной группе. Кроме того, степень активации ДНКазы в тканях мидий приливной зоны (88 %) в 1,5 раза выше, по сравнению с моллюсками, обитающими в стабильной среде (52 %). Столь высокая лабильность лизосомальных ферментов литоральных мидий может объясняться особенностями строения их мембран. Так, жирнокислотный состав мембранных фракций липидов в тканях этой экологической группы моллюсков характеризуется повышенным содержанием полиненасыщенных жирных кислот, как при аэробном обмене, так и в бескислородных условиях, что указывает на снижение вязкости клеточных мембран (Алексеева и др., 2005), что, в свою очередь, облегчает индукцию мембранносвязаных ферментов при различных внешних воздействиях.
Проведенные исследования позволяют заключить, что на биохимическом уровне реакция моллюсков Mytilus edulis, принадлежащих к разным экологическим группам, неодинакова. Согласованное по величине и направленности повышение рибо- и дезоксирибонуклеазной активности у литоральных моллюсков свидетельствует о более высокой эффективности адаптивных механизмов, по сравнению с обитателями сублиторали. Повышенная реактивность ферментативных систем лизосом мидий приливно-отливной зоны позволяет скорректировать метаболизм в более короткий срок, что немаловажно для успешного выживания организма при резких и частых изменениях условий существования.
