Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 10
1.1. Физиолого-биохимические характеристики бактерий рода Sphaerotilus 10
1.1.1. Эколого-морфологические характеристики бактерий 10
1.1.2. Характеристика Sphaerotilus па tans 12
1.2. Физико-химические и кинетические свойства малатдегидрогеназы 15
1.2.1. Способы получение высокоочищенных препаратов 15
1.2.2. Общая характеристика каталитического действия 17
1.2.3. Кинетические параметры 18
1.2.4. Влияние концентрации ионов водорода 19
1.2.5. Влияние интермедиатов и ионов 21
1.2.6. Влияние температуры на активность МДГ 24
1.2.6.1. Температурный оптимум 24
1.2.6.2. Термостабильность МДГ 25
1.3. Атомно-силовая микроскопия 31
1.3.1. Исследование биообъектов и макромолекул 31
1.3.2. Основной принцип работы атомно-силового микроскопа и режимы сканирования 35
1.4. Молекулярная абсорбционная спектроскопия электронных переходов 38
1.4.1. Спектральные характеристики ароматических аминокислот в УФ- области 39
1.4.2. Аминокислотный состав малатдегидрогеназы 42
ГЛАВА 2. CLASS Экспериментальная част CLASS ь 50
2.1. Объект и методы исследования 50
2.1.1. Объект исследования 50
2.1.2. Методы исследования 5 0
2.1.2.1. Состав питательной среды для культивирования 50
2.1.2.2. Определение активности фермента 51
2.1.2.3. Определение общего количества белка 52
2.1.2.4. Выделение и очистка малатдегидрогеназы 53
2.1.2.5. Электрофоретические исследования 54
2.1.2.5.1. Аналитический электрофорез 54
2.1.2.5.2.Определение гомогенности ферментативных препаратов 55
2.1.2.5.3.Специфическое проявление МДГ 55
2.1.2.5.4.Определение молекулярной массы субъединиц 55
2.1.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента 56
2.1.2.7. Ингибиторный анализ 57
2.1.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляция активности малатдегидрогеназы 57
2.1.2.9. Определение структурных особенностей МДГ методом атомно-силовой микроскопии 58
2.1.2.10. Регистрация спектров поглощения ароматических аминокислот малатдегидрогеназы 59
2.1.3. Статистическая обработка экспериментальных данных 59
2.2. Полученные результаты и их обсуждение 61
2.2.1. Исследование изоферментного состава малатдегидрогеназы у бактерий Sphaerotilus natans 61
2.2.2. Очистка малатдегидрогеназы из исследуемых бактерий 63
2.2.3. Определение гомогенности ферментных препаратов 69
2.2.4. Четвертичная структура МДГ из изучаемых бактерий 72
2.2.4.1. Определение молекулярной массы нативного фермента 73
2.2.4.2. Определение субъединичного строения МДГ 73
2.2.5. Кинетические и регуляторные характеристики малатдегидрогеназы 77
2.2.5.1. Влияние концентрации ионов водорода 77
2.2.5.2. Определение константы Михаэлиса 79
2.2.5.3. Определение константы субстратного ингибирования 85
2.2.5.4. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность МДГ 85
2.2.5.5. Влияние температуры 90
2.2.5.5.1.Температурный оптимум 90
2.2.5.5.2.Термостабильность МДГ 93
2.2.6. Влияние ротенона и итаконата на соотношение димерной и тетрамерной форм МДГ 95
2.2.7. Топография поверхности молекулы фермента 98
2.2.8. Сравнительный анализ спектров поглощения МДГ 103
Заключение 111
Выводы 115
Список литературы 118
- Эколого-морфологические характеристики бактерий
- Исследование биообъектов и макромолекул
- Аналитический электрофорез
- Определение субъединичного строения МДГ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Важнейшей особенностью бактериального метаболизма является адаптивность в факторам внешней среды. Трансформация биохимических процессов осуществляется на ферментативном уровне. У эукариот важную роль в адаптивной реакции играет полиморфизм фермента, реализуемый и помощью изоферментов [167]. У прокариот определяющее значение принадлежит структурным изменениям белковой молекулы. Особое внимание уделяется малатдегидрогензаной системе, участвующей как в катаболических (цикл трикарбоновых кислот, ЦТК), так и анаболических (глиоксилатный цикл) процессах клетки. Для некоторых бактерий показано, что участие малатдегидрогеназы (МДГ, К.Ф. 1.1.1.37) в протекании различных метаболических путей осуществляется с помощью изоформ, образующихся за счет трансформации четвертичной структуры. Причем возникающие димерные и тетрамерные формы МДГ содержат одинаковые субъединицы, кодирующиеся одним геном [42]. Известно, что структурная перестройка МДГ обеспечивает переключение метаболических потоков у бактерий Beggiatoa leptomitiformis в зависимости от условий их культивирования [49].
Малатдегидрогеназа является полифункциональным ферментным комплексом и обеспечивает протекание конструктивного и энергетического метаболизма [103]. Известно, что в клетках бактерий встречаются как димерные [85], так и тетрамерные формы этого фермента [123, 129]. У фототрофных анаэробов {Rhodobacter capsulatus, Rhodospirilhim rubrimi) МДГ, функционирующая преимущественно в конструктивном обмене, имеет тетрамерное строение. У аэробных микроорганизмов с органотрофным типом питания {Paracoccus denitrificans, Pseudomonas stutzeri) фермент является димером и участвует в протекании конструктивного и энергетического метаболизма.
В связи с этим исследование структуры малатдегидрогеназы является принципиально важной задачей, так как изменение пространственной организации конфигурации белковой молекулы в конечном итоге определяет ее функциональные свойства, которые реализуются на уровне организма. Слабо изученным остается вопрос о расположение субъединиц в составе белка и связей между ассоциатами.
Изучение особенностей структуры и свойств МДГ у микроорганизмов представляет особый интерес. Бактерии Sphaerotilus natans Д-507 являются умеренными термофилами, выделенными из природных термальных сероводородных источников. Микроорганизмы, в зависимости от наличия в среде тиосульфата, могут изменять тип метаболизма и расти как хемоорганогетеротрофно, так и хемомиксогетеротрофно. Бактерии штамма Д-380 относятся к мезофилам и являются типичными обитателями антропогенных экосистем (выделен из очистных сооружений), предпочитающих исключительно органотрофный тип питания. Определенный интерес представляет детальное исследование четвертичной структуры изоформ фермента. Как известно, замена димера на тетрамер происходит в процессе посттрансляционной модификации. В некоторых работах показано, что дисульфидные связи между субъединицами образуются в процессе трансляции или же сразу после нее [8].
В связи с этим интересно исследование роли структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы и механизмов образования четвертичной структуры изоформ фермента внутри одного вида при адаптации микроорганизмов к смене типов питания и температурных режимов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы у микроорганизмов Sphaerotilus natans, различающихся типом питания и отношением к температуре.
Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:
выделить и получить в электрофоретически гомогенном состоянии препараты МДГ из исследуемых бактерий;
изучить на высокоочищенных ферментных препаратах физико-химические, каталитические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы;
исследовать четвертичную структуру МДГ из бактерий Sphaerotilus natans Д-507 в условиях органо- и миксотрофного культивирования;
изучить субъединичное строение малатдегидрогеназы из бактерий Sphaerotilus natans Д-380;
методом ингибиторного анализа выявить функциональную роль димерной и тетрамерной изоформ МДГ у Sphaerotilus natans Д-507 в условиях разного типа питания;
изучить влияние температуры на скорость ферментативной реакции и термостабильность МДГ;
исследовать изменения четвертичной структуры малатдегидрогеназы с помощью методов атомно-силовой микроскопии и молекулярной абсорбционной спектроскопии электронных переходов;
Научная новизна. Получение гомогенных препаратов малатдегидрогеназы из микроорганизмов позволило показать функциональную роль тетрамерной и димерной изоформ МДГ в метаболизме бактерий Sphaerotilus natans Д-507. В условиях органотрофного роста у бактерий функционирует димерная форма МДГ, участвующая в работе цикла Кребса. При миксотрофном культивирование малатдегидрогеназа представляет собой смесь изологических изоформ — димера и тетрамера. Димерная форма принимает участие в цикле трикарбоновых кислот, а тетрамерная обеспечивает протекание глиоксилатного цикла. У Sphaerotilus
natans Д-380 обнаружена димерная форма, функционирующая в цикле трикарбоновьтх кислот. Впервые показаны размеры нативных молекул МДГ и их субъединиц при помощи атомно-силовой микроскопии. На основе полученных данных можно предположить возможную укладку мономеров при формировании четвертичной структуры изоформ фермента. Спектры поглощения молекул малатдегидрогеназы, снятые с помощью абсорбционной молекулярной спектрометрии, позволяют показать роль некоторых типов связей в образовании тетрамерной формы фермента.
Практическая значимость. Полученные гомогенные препараты малатдегидрогеназы могут быть использованы в научно-исследовательских работах, связанных с изучением ферментативной кинетики, четвертичной структуры фермента, термодинамических параметров реакций, катализируемых МДГ, а также как ферментные препараты в качестве модельного образца для других методов исследования (атомно-силовая микроскопия, молекулярная абсорбционная спектроскопия). Прикладные аспекты изучения бесцветных серобактерий и железобактерий определяются их использованием для удаления токсичных соединений серы из промышленных и бытовых сточных вод, воздушной среды производственных помещений и других объектов.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, в спецкурсах по энзимологии, биохимическим механизмам адаптации прокариот, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2007, 2008); 11 и 12-ой
Пущинских конференциях молодых учёных "Биология — наука 21-ого века" (Пущино, 2007, 2008); на второй международной конференции "Проблемы биоэкологии и пути их решения" (Саранск, 2008); ежегодной научной сессии отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2008).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 9 публикациях — 6 статьях и 3 тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (207 источников). Иллюстрационный материал включает 32 рисунка и 11 таблиц.
Эколого-морфологические характеристики бактерий
Бактерии рода Sphaerotilus — это одноклеточные грамотрицательные организмы размером 1,2-2,5 х 2-10 мкм. Представляют собой длинные нити, которые состоят из клеток, удерживаемых тонким чехлом. Бактерии размножаются внутри чехла поперечным делением и могут покинуть его в виде подвижных клеток. Нити способны прикрепляться к стенкам сосуда, погруженным растениям, камням и другим поверхностям [140]. Ветвление филаментов отсутствует. Другие источники показывают наличие ветвлений, особенно в конце лог-фазы роста [177].
Одиночные или сдвоенные клетки (гонидии) отделяются от чехла и передвигаются при помощи пучка монополярных жгутиков. Чехлы обычно тонкие без включений оксидов железа и марганца. Они не всегда могут быть идентифицированы, когда полностью заполнены клетками, однако если часть чехла свободна от клеток, идентификация организма значительно упрощается (рис. 1).
Поверхность чехлов S. natans имеет гладкую структуру. Снаружи чехол покрыт слоем слизи различной толщины. Размер и форма колоний у данных бактерий зависит от способности того или иного штамма к формированию чехла. Обычно колонии неправильной формы. Часто колонии характеризуются гладкой, плотной центральной частью и «взъерошенной» периферийной [75].
На поверхности жидкой среды организмы часто образуют пленку, которая формируется из длинных неветвящихся филаментов, заключённых в оболочку. V Рис. 1. Длинные неветвящиеся и покрытые оболочкой нити S. natans [140]. При помощи экстрагирования и калориметрирования в чехлах бактерий рода Sphaerotilus были обнаружены углеводы (54,1 %), белки (12,2 %), липиды (1-3 %) [75, 166]. С использованием газо-жидкостной хроматографии было показано присутствие глюкозы и галактозы в молярном соотношении 1:4. Основные аминокислоты, присутствующие в чехле - глицин (49,2 мол. %) и цистеин (24,6 мол. %). Чехлы устойчивы к агентам, восстанавливающим дисульфидные связи (дитиотрейтол и 2-меркаптоэтанол) и к обработке протеазами. Чехлы также содержат гетерополисахариды, формирующиеся из глюкозы и галактозамина.
Для Sphaerotilus характерен строго дыхательный тип метаболизма с кислородом в качестве терминального акцептора электронов. Эти микроорганизмы способны расти при очень низких концентрациях растворенного кислорода (меньше 0,1 мг/л) в диапазоне температур от 10 до 40 С (температурный оптимум 20-30 С) при рН 6,5-7,5. Среди них встречаются хемоорганогетеротрофы и литотрофы, источниками углерода и энергии для которых служат спирты, органические кислоты и сахара, а для некоторых обитателей целлюлозно-бумажных фабрик — также целлюлоза и крахмал. Соли аммония и нитраты могут использоваться в качестве источников азота в присутствии витамина Bi2 или метионина. Пептон, гидролизат казеина, смесь аспарагиновои и глутаминовои кислот и витамина В12 или метионина дают лучший рост.
Массовое развитие представителей рода Sphaerotilus, как известно, характерно для антропогенных экосистем — активного ила очистных сооружений, а таюке, как было показано недавно, и для природных мест обитания - слабо минерализованных термальных сульфидных источников [61, 80].
Довольно хороший рост в условиях с низким содержанием кислорода и способность утилизировать большое количество органических источников углерода способствуют доминированию данных микроорганизмов в соответствующих экосистемах [66, 75].
Sphaerotilus natans — это один из типов нитчатых бактерий, которые представляют до некоторой степени аномалию. С одной стороны известно, что они образуют скелет, вокруг которого формируются флоккулы, с другой — являются источником двух проблем — плохого осаждения и образования устойчивой пены. Нити S. natans скапливаются в водопроводных трубах, в местах отложений железа, где образуют цепкие слизевые массы, препятствующие продвижению воды и засоряющие фильтры, и способствуют аэробной коррозии металлов. Уникальные условия обитания, представленные на целлюлозно-бумажных фабриках (доступные углеводороды, высокая влажность, умеренные температуры и постоянная рециркуляция воды), благоприятны для развития этих микроорганизмов. Развитие S. natans влечет за собой технические неполадки и нарушает гигиену и техническое качество выпускаемой бумаги [109, 143].
Для профилактики отложений слизи используются химические биоциды, такие как хлорин, хлорамфеникол, полимиксин В, стрептомицин. Но почти все они не видоспецифичны, а некоторые оказывают токсичное действие на животных. Биологическое сдерживание роста S. natans бактериофагом Bdellovibrio bacteriovorus не применяется на практике, т.к., несмотря на его противомикробное действие, он не способен пронизывать общую оболочку клеток S. natans.
Несколько различных факторов могут вызывать доминантное развитие нитчатых микроорганизмов в активированных илах, среди них: (а) низкая или высокая концентрация доступных питательных веществ в системах, постоянно пополняемых стоками; (б) низкое содержание кислорода, что свойственно таким системам.
Хотя S. natans предпочитает расти при среднем содержании легко ассимилируемых органических субстратов, данный организм встречается и в незагрязненных водах ручьев, каналов и прудов, в которых состав субстратов неизвестен. В таких местообитаниях чехлы бактерий тонкие и бесцветные, но иногда, в частности, в присутствии растворенных соединений железа, они могут становиться желто-коричневыми и инкрустированными оксидами железа. Данные характеристики могут успешно наблюдаться в лабораторных условиях, когда 5". natans растет в медленно текущем почвенном экстракте, обогащенном Fe (II). В данных условиях чехлы S. natans сходны с таковыми Leptothrix ochraceae. Однако изучение 16S рРНК последовательностей показало отдельное положение организмов, относящихся к данным родам, хотя положение соответствующих ветвей обоих родов на филогенетическом древе на основании доступных данных неоднозначно, в основном из-за 16S рРНК последовательности L. ochraceae, который не выделен в чистую культуру. natans способны использовать широкий спектр веществ в качестве источника углерода. К ним относятся органические кислоты, сахара, спирты, некоторые аминокислоты, а также гидролизат казеина, пептон и дрожжевой экстракт. Было показано использование фруктозы, глюкозы, мальтозы, сахарозы, лактата, пирувата и сукцината как единственных источников углерода [75].
Исследование биообъектов и макромолекул
В последнее время метод сканирующей зондовой микроскопии, в частности атомно-силовой (АСМ), вследствие высокой разрешающей способности достаточно широко применяется в биологии с целью изучения структурного состояния мембран клеток и отдельных биомолекул, дополняя традиционные методы исследования [68]. Метод позволяет за относительно небольшое время — минуты — получить изображение поверхности образца с разрешением порядка нескольких нанометров [31, 74]. Основными преимуществами метода атомно-силовой микроскопии являются возможность изучения реальной поверхности без применения специальных методов подготовки образцов, высокое пространственное разрешение, исследование локальных свойств клеточной стенки, в том числе жесткости, пластичности, адгезивности, наглядность представляемой информации. Вместе с тем, целый ряд методических проблем все еще затрудняет использование АСМ в качестве рутинного метода визуализации биологических структур [68].
С помощью атомно-силовой микроскопии зарегистрировано изменение структуры липополисахаридов клеточной стенки Escherichia coli, изучены бактерии Klebsiella, Helicobacter pylori, а также Lactobacillus, Bifidobacterium, получены трехмерные изображения хлоропластов, митохондрий и везикул плазматических мембран высших растений [68, 69, 151, 158]. Метод атомно-силовой микроскопии нашел широкое применение при детекции иммунных комплексов и антител. В ряде работ детально изучена субъединичная структура иммуноглобулинов и получено трехмерное изображение белковой молекулы IgG, IgM. АСМ изображение молекул иммуноглобулина IgM с молекулярной массой 950 кДа представляет структуру, состоящую из 5 субъединиц. Каждая субъединица имеет диаметр 10 нм и высоту 2,5 нм. Данные АСМ соответствуют представлениям о пространственной организации IgM, согласно которым IgM — молекула, состоящая из пяти Y-образных молекул. Увеличенное изображение молекулы IgGl (150 кДа) позволяет различить три глобулы (рис. 3). Две глобулы имеют одинаковые размеры: диаметр составляет 10 нм, а высота 1,5 нм; третья глобула несколько больше: диаметр также 10 нм, а высота превышает 2 нм [71, 26]. Рис. 3. Изображение молекулы IgGl. Изображение получено с помощью СЗМ Solver Р47Н полуконтактным методом на воздухе [31]. Размер рисунка 60x60x2 нм, частота 160 кГц. Были определены размеры и структура антител ТА5, нанесенных на слюду методом ковалентной пришивки. Длина составила 19 нм, высота около 2 нм (Рис. 4). Изображение молекул рицина с молекулярной массой 60 кДа получено зондом серии «Nanowhisker». С помощью такого зонда удается детально рассмотреть структуру молекул рицина. Молекулы на подложке находятся в различных конформациях и определена доменная организация: можно различить домен А-субъединицы и два домена В-субъединицы [15]. О 20 40 60 80 100 120 140 160 nm Рис. 4. Изображение молекул рицина. Жирная стрелка - домен А-субъединицы, тонкие стрелки - два домена В-субъединицы. Размер 170х 170 нм, частота 230 кГц [15]. Атомно-силовая микроскопии в настоящее время становится одним из перспективных методов изучения структурных особенностей макромолекул, выявления иммунных комплексов, поскольку позволяет получать изображения объектов с высоким разрешением, сопоставимым с уровнем рентгеноструктурного анализа, в условиях, при которых макромолекулы не подвергаются жесткой обработке и проявляют свою природную активность [15,74, 153]. Кроме того, АСМ дает возможность не только визуализировать объекты на молекулярном уровне, но и изучать свойства индивидуальных макромолекул: распределение поверхностных зарядов, подвижность отдельных участков, конформационные изменения в зависимости от условий, силу специфического взаимодействия между молекулами [26, 111, 203]. С помощью АСМ можно наблюдать в реальном времени за сборкой макромолекулярных комплексов, распределением белков на поверхности клетки, особенностями внутриклеточного транспорта макромолекул [146]. Метод атомно-силовой микроскопии состоит в получении топографических изображений поверхности при ее сканировании тонкой иглой. Принцип работы атомно-силового микроскопа основан на взаимодействии микрозонда (кантилевера) с поверхностью образца. Кантилевер представляет собой гибкую кремневую пластинку с выступающей из торца балкой, на конце балки находиться зонд, конец которого исследует поверхность (рис. 5). Перемещаясь в плоскости образца над поверхностью, кантилевер изгибается, отслеживая ее рельеф [137]. При подведении зонда к образцу на несколько ангстрем между атомами, образующими острие, и атомами, расположенными на поверхности образца, начнет действовать Ван-дер-Ваальсова сила притяжения. Под действием этой силы зонд будет приближаться к образцу до тех пор, пока не начнется электростатическое отталкивание одноименно (отрицательно) заряженных оболочек атомов зонда и поверхности [189]. Для детекции отклонения используется полупроводниковый лазер. Лазерный луч направляется на поверхность кантилевера, откуда отраженный луч попадает на специальный четырехсекционный фотодиоид. Т.о., отклонения кантилевера приводят к смещению луча лазера относительно секций фотодиода. Изменение разностного сигнала с фотодиода и будет показывать амплитуду смещения кантилевера в ту или иную сторону. Результаты сканирования выводятся на экран компьютера. Информация, полученная с помощью атомно-силового микроскопа, представлена в виде двумерной матрицы целых чисел, каждое число является значением отклонения кантилевера. Этому диапазону целых чисел ставиться в соответствие цветовая палитра, т.е. каждое значение отображается в точку определенного цвета. В результате высота поверхности передается цветом как на географических картах [52].
Аналитический электрофорез
Для изучения электрофоретической подвижности и выявления множественных молекулярных форм МДГ в различных бактериальных объектах проводили разделение с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. При проведении электрофореза использовали метод Дэвиса [94].
Для концентрирования белкового раствора использовали крупнопористый концентрирующий полиакриламидный гель (4 %). Разделение осуществляли на мелкопористом разделяющем геле, содержащем 9 % полиакриламида. Растворы мелко- и крупнопористого гелей готовили, как описано у Мауэра [36]. После окончания процесса полимеризации наносили исследуемые пробы. На один карман пластинки геля наносили не больше 25-30 мкг (0,04 мл) исследуемого образца вместе с 40 % раствором сахарозы, который является антиконвекционной средой. Для контроля за движением фронта в пробу вносили 0,1 % раствор бромфенолового синего. Разделение исследуемых белков проводили в основной буферной системе с рН 8,3. Электрофоретическое разделение белков проводили при температуре 2 — 4 С. Подавали постоянный электрический ток 1—2 мА на один карман пластинки геля. Электрофорез продолжался, как правило, 2 - 2,5 часа. Окончание электрофореза определяли по достижению индикаторной краской (бромфеноловый синий) конца нижнего геля.
Определение гомогенности ферментных препаратов Для определения гомогенности очищенных препаратов МДГ вносили 5-7 мкг белка исследуемого раствора. При проявлении на белок использовали методику с нитратом серебра [138, 148]. Для хранения гели помещали в 7 % -ный раствор уксусной кислот. Специфическое проявление малатдегидрогеназы Специфическое проявление малатдегидрогеназы осуществляли тетразолиевым методом [10, 98]. Четко локализующийся в месте образования диформазан указывал на положение МДГ в пластинке геля. Для повышения специфичности метода и сведения до минимума возможности проявления декарбоксилирующих малик-энзимов, гели проявляли при более высоких значениях рН (8,3). При этом гели инкубировали в темноте, при 37 С в среде, содержащей 50 мМ трис-НС1-буфер, рН 8,3; 20 мМ малат; 3 мМ НАД+; нитро-синий тетразолий (предварительно растворенный в 0,5 мл этиленгликоля) и феназинметасульфат (ФМС) в рассчете 1 мг на 10 мл раствоОпределение молекулярной массы субъединиц МДГ Для определения молекулярной массы МДГ методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия пользовались детергенной системой, описанной Лэммли [125]. Детергенная система состояла из следующих компонентов: Разделительный гель: 12,5 % акриламид, 1,5 М трис-НС1-буфер, рН 8,8; 10 % додецилсульфат натрия (SDS); 0,025 % N N N -тетраметилэтилен диамин (ТЕМЕД); 10 % персульфат аммония. Концентрирующий гель: 6 % акриламид; 0,5 М трис-НС1-буфер, рН 6,8; 10 % SDS; 0,025 % ТЕМЕД и 10 % персульфат аммония. Электродный буфер содержал 0,01 М трис-НС1; 0,192 М глицин; 1 % SDS, рН 8,3. Образец готовили на 0,0625 М трис-HCl буфере, рН 6,8, содержащем 2 % SDS, 10 % глицерина, 5 % меркаптоэтанола и 0,001 % бромфенолового синего. После 10-минутного прогрева на водяной бане при температуре 80 С образец наносили на гель. Для построения калибровочной кривой и определения молекулярной массы субъединиц использовали стандартные маркерные белки (кДа): фосфорилазу В - 97; БСА - 66,2; яичный альбумин -45; карбоангидразу -31; трипсин - 21,5; лизоцим - 14,4 [22]. После проведения электрофореза гели окрашивали по методике с нитратом серебра. Гели хранили в 7 % уксусной кислоте. Для расчета молекулярной массы субъединиц фермента с помощью Ds-Na-ПААГ электрофореза строили калибровочную кривую по белкам с известной молекулярной массой. 2.1.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента , Для исследования четвертичной структуры и определения молекулярной массы нативной МДГ использовали гель-хроматографию через сефадекс G-200 [43]. Для определения молекулярной массы фермент пропускали через колонку (2x40 см), заполненную сефадексом G-200 (сверхтонкий), и измеряли объем его выхода (Ve). Свободный объем (Vo) колонки определяли с помощью голубого декстрана. Молекулярную массу изучаемого фермента определяли по формуле [16]. lg Mr = 6, 698 - 0,987(Ve/Vo), где Ve— объем выхода фермента, мл; V0 - свободный объем колонки, мл. Ингибиторный анализ В опытах использовали следующие ингибиторы: ротенон (ингибитор первого комплекса ЭТЦ) [178] в концентрации 2 ммоль/л и итаконат (ингибитор изоцитратлиазы — ключевого фермента глиоксилатного цикла) [55] в концентрациях 2,5 и 5 ммоль/л, которые добавляли в среду культивирования бактерий Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента Кинетические и регуляторные свойства ферментов изучали на электрофоретически гомогенных препаратах. Определение констант Михаэлиса, ингибирования, субстратного ингибирования, расчет термодинамических параметров осуществляли с использованием программ линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов. Определение констант Михаэлиса и максимальных скоростей реакций в случае субстратного ингибирования проводили по графикам зависимости 1/V от S, имеющим параболическую форму. Использовали программу параболической апроксимации точек по методу наименьших квадратов [17]. Влияние рН на скорость ферментативной реакции определяли путем, проведения серии измерений скорости ферментативной реакции при различных значениях рН. Влияние температуры на стабильность малатдегидрогеназы определяли следующим образом: . фермент инкубировали при различных значениях температуры в течение 15 мин, измеряя его активность.через 1; 5; 10 и 15 мин в среде калориметрирования 25С (т.е. в той температурной зоне, в которой, фермент остается стабильным). Температурный оптимум определяли, используя прибор Specord,. в интервале температур среды спектрофотометрирования от +4С до +90С. Энергию активации реакции определяли графическим-способом. Расчет энергии активации осуществляли по уравнению Аррениуса: tga = -EaKr/19,15 [17].
Определение субъединичного строения МДГ
Электрофоретическое исследование в присутствии додецилсульфата натрия позволило определить величину молекулярной массы субъединиц малатдегидрогеназы из изучаемых бактерий Sphaerotilus natans Д-507 и Sphaerotilus natans Д-380, которая составила 35±1,7 кДа (рис. 9,10, табл. 8).
Сравнение результатов гель-хроматографии и Ds-Na-электрофореза показывает, что МДГ из разных объектов представлена как димером, так и а б в Определение молекулярной массы субъединицы МДГ методом Ds-Na-электрофореза: 1-БСА, 2-овальбумин, 3-карбоангидраза, 4-ингибитор трипсина, 5-лизоцим, 6-исследуемая МДГ. тетрамером. Так, ферменты из S. natans Д-507 и S. natans Д-380, выращенных органотрофно, являются изологическими димерами, тогда как в условиях миксотрофного роста бактерий S. natans Д-507 МДГ представлена смесью двух изоформ — димерной и тетрамерной.
Полученные результаты по молекулярной массе и субъединичному строению совпадают с данными других авторов, которые описывают малатдегидрогеназу как димер или тетрамер, которые различаются по структуре, функциям, локализации [96, 197]. Таблица 8 Сравнительная характеристика молекулярной массы и субъединичного строения МДГ у исследуемых микроорганизмов Объект Молекулярная масса, кДа Количество субъединиц Молекулярнаямассасубъединиц, кДа Sphaerotilus natans Д-507 (органотрофный рост) 71 2 35 Sphaerotilus natans Д-507 (миксотрофный рост) 71 2 141 4 35 Sphaerotilus natans Д-380 (органотрофный рост) 73 2 35 Димерная форма фермента у эукариот расположена в митохондриях и участвует в энергетических реакциях ЦТК, тогда как тетрамер — в пероксисомах или цитоплазме и участвует в конструктивном метаболизме [46,130, 192]. В клетках бактерий также встречаются различные формы МДГ. Известно, что у гетеротрофных бактерий димерная форма МДГ участвует в конструктивном и энергетическом метаболизме [72, 117, 123, 188]. МДГ из психрофилов Flavobacterium frigidimaris имеет тетрамерное строение и является необходимым ферментом цикла трикарбоновых кислот [93]. У анаэробных фототрофов [190] малатдегидрогеназа имеет тетрамерное строение и обеспечивает протекание конструктивного обмена. Димерная форма МДГ из бесцветных серобактерий Beggiatoa leptomitiformis функционирует в ЦТК, а тетрамерная - в глиоксилатном цикле [49]. МДГ из Bacillus являются тетрамерами, за исключением фермента из экстремальных термофильных бактерий Bacillus caldolyticus, имеющего димерное строение [193]. 2.2.5. Кинетические и регуляторные характеристики МДГ 2.2.5.1. Влияние концентрации ионов водорода Для каждого фермента имеется определенное значение рН, при котором скорость катализируемой реакции максимальна. Нами было изучено влияние различных концентраций ионов водорода на активность малатдегидрогеназы из исследуемых бактерий. Показано, что для МДГ из Sphaerotilus natans Д-507 оптимальные значения рН, при которых обнаруживается максимальная скорость восстановления оксалоацетата и окисления малата, находятся в кислой области (рис. 11). Для фермента из Vulcanithermus medioatlanticus установлено, что оптимальные значения рН при восстановлении оксалоацетата составляют 6,7, а при окислении малата — 8,5 [20], в то время как рН-оптимумы для МДГ из большинства источников находятся в более щелочной области [44, 197]. Отличия в значениях рН-оптимумов прямой и обратной реакции связаны с тем, что МДГ катализирует окисление и восстановление субстратов в разных конформационных состояниях, которые отличаются по своим параметрам, а также по аминокислотным остаткам, принимающим участие в каталитическом акте [4]. 0,06 . Зависимость скорости реакции от рН среды для МДГ из исследуемых бактерий: а — Sphaerotilus natans Д-507 (миксотрофный рост); б — Sphaerotilus natans Д-507 (органотрофный рост); в - Sphaerotilus natans Д-380 (органотрофный рост); 1 — восстановление оксалоацетата; 2 — окисление малата. 2.2.5.2. Определение константы Михаэлиса В ходе экспериментов методом Лайнуивера-Берка были определены кинетические константы (Км) прямой и обратной реакций для МДГ из исследуемых бактерий (табл.9). Значения Км по оксалоацетату составили 39±0,87 мкМ для МДГ из Sphaerotilus natans Д-507, культивируемых органотрофно, и 31 ±0,54 мкМ при миксотрофном росте этих бактерий, что свидетельствует о высоком сродстве изучаемого фермента к оксалоацетату. Величина Км по оксалоацетату для фермента Sphaerotilus natans Д-380 составила 47,6±1,46 мкМ (рис. 12). Установленные величины Км по малату, которые указывают на более низкое сродство фермента к этому субстрату, составили 264±7,92 мкМ и 204±6,12 мкМ для МДГ из S. natans Д-507 при органотрофном и миксотрофном росте, соответственно, и 847,4+25,42 мкМ для малатдегидрогеназы из S. natans Д-380 (рис. 13). Полученные результаты свидетельствуют о высоком сродстве МДГ к оксалоацетату и более низком - к малату, что согласуется с данными других авторов, указывающих на более низкое сродство фермента к этому субстрату, обусловленное конформационными изменениями МДГ при превращении маната [169, 193, 56]. Так, Км по оксалоацетату для МДГ из Bacillus species — 22 мкМ, тогда как Км по малату для МДГ из этих бактерий составляет 260 мкМ [193]. Также были установлены значения Км по НАДН, которые для МДГ из S. natans Д-507 составили 22±0,66 мкМ и 18+0,54 мкМ при органотрофном и миксотрофном культивировании, соответственно, и 23,3+0,70 мкМ для МДГ из S. natans Д-380. Величина Км по НАД для малатдегидрогеназы из S. natans Д-507 составила 83±2,49 мкМ при органотрофном культивировании и 75±2,25 мкМ в миксотрофных условиях, значение Км (НАД ) для МДГ из S. natans Д-380 - 588,2+17,65 мкМ(рис. 14,15).
Похожие диссертации на Структурная организация изоформ малатдегидрогеназы и их функциональная роль в адаптивной реакции бактерий Sphaerotilus Natans
