Содержание к диссертации
Введение 6
Обзор литературы
1. Системы транспорта калия в MX. 11
Транспорт калия в MX. 11
Молекулярные структуры, ответственные за транспорт калия в MX. 12
Физиологическое значение транспорта калия в MX. 14
2. АТФ-ингибируемые калий-транснортирующие каналы. 15
2.1. АТФ-зависимый калиевый канал цитоплазматической мембраны. 17
2.1.1. Структурная организация цитоилазматического
АТФ-зависимого калиевого канала. 17
Биофизические свойства цитоплазматического калиевого канала. 19
Модуляторы цитоплазматического калиевого канала. 20
Внутриклеточные нуклеотиды - регуляторы цитоКдтф канала. 20
Фармакологические регуляторы цитоКатф канала. 24
2.1.4. Функциональная роль цитоКдтф канала в клетке. 28
2.2. АТФ-чувствительный калиевый канал внутренней мембраны MX. 30
Структурная организация митоКдтф канала. 31
Биофизические свойства митоКдтф канала. 34
Модуляторы митоКдтф канала. 38
Метаболические модуляторы митоКдтф канала. 38
Фармакологические модуляторы митоКдтф канала. 40
2.4. Функциональная роль митоКдтф. 42
Активация митоКлтф в развитии устойчивости организма к гипоксии. 43
Механизмы защиты сердца при гипоксии,
опосредованные активацией митоКлтф. 46
2.4.3. Феномен прерывистой гипобаричсской тренировки. 48
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Выделение MX. 52
Выделение MX печени крысы. 52
Выделение MX сердца крысы 52
2. Выделение и очистка митоКдтф канала. 53
Изучение энергозависимого входа К+ в MX методом спектрофотомстрии. 54
Изучение ДНФ-индуцированного выхода ионов калия из MX. 54
Полярографическое определение параметров дыхания MX. 55
Иммунохимическое исследование митоКлтф канала. 55
Получение и очистка антител к белку с молекулярной массой 55 кДа. 56 6.1.1. Подготовка белка с м.м. 55 кДа: выделение и очистка. 56
Иммунизация и анализ препарата антител. 56 6.2.1. Детекция специфических антител и определение титра. 57
Непрямой Дот-анализ. 57
Вестерн-Блот анализ. 58
Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа. 59
Ингибиторный анализ с использованием антител к белку с м.м. 55 кДа. 60
MS-MALDI-TOF/TOF анализ. 61
Модель экспериментального острого инфаркта миокарда. 62
8.1. Хирургические процедуры и модели животных. 62
Схема эксперимента 62
Анализ электрокардиограмм. 63
Анализ ишемических нарушений. 63
Анализ нарушений ритма. 64
Критерии отбора. 64
Статистический анализ. 65 9. Определение параметров функционирования митоКдтф канала
крыс высоко- и низкоустойчивых к гипоксии. 65
Метод отбора высоко- и низкоустойчивых животных. 65
Адаптирование низкоустойчивых животных к недостатку кислорода
методом прерывистой нормобаричсской гипоксии. 66
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Изучение физиологической роли митоКдтф канала при гипоксии. 67
1.1. Изучение влияния активации митоКдтф канала уридиновыми
нуклеотидами на повреждения миокарда при
ишемии на модели экспериментального острого инфаркта миокарда. 67
1.1.1. Влияние уридина и уридин-5'-монофосфата на ишемические
изменения сердечной активности, при введении препаратов
до и после создания экспериментального инфаркта. 68
Антиишемическое действие уридина и уридин-5'-монофосфата. 69
Антиаритмический эффект уридина и уридин-5'-монофосфата. 72
1.2. Параметры функционирования митоКдтф канала у крыс с различной
резистентностью, а также у животных, адаптированных к гипоксии. 78
1.2.1. Изучение параметров дыхания и окислительного фосфорилированин
в MX печени и сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии. 78
1.2.2. Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта К+ в MX печени
сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии. 83
2. Изучение структурной организации митохондриального
АТФ-зависимого калиевого канала. 89
Определение гомологии белка с м.м. 55 кДа методом MS-MALDI-TOF/TOF. 89
Ипгибиторный анализ активности митоКдтф канала с использованием антител, полученных на белок с м.м. 55 кДа. 93
Определение степени чистоты белка, используемого для иммунизации. 94
Иммунизация и определение титра полученных антител. 96
Определение специфичности полученных антител. 97
Выделение иммуноглобулинов G (IgG) из антисыворотки и
проведение ингибиторного анализа. 99
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 104
ВЫВОДЫ 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
Введение к работе
Митохондриальный АТФ-ингибируемый калиевый канал (митоКдтф), осуществляющий вход калия в MX, был обнаружен методом пэтч-кламп во внутренней мембране MX в 1991 г. [Inoue et al., 1991]. Однако, еще в 1981 г. в лаборатории проф. Мироновой белка с м.м. 55 кДа, обладающий свойствами данного канала, был изолирован из MX мембраны в виде [Миронова и др., 1981]. Позднее было показано, что выделенный белок-канал ингибируется физиологическими концентрациями АТФ [Paucek et al., 1992; Миронова и др., 1996 (I)].
В настоящее время достаточно хорошо исследованы биофизические свойства митохондриального калиевого канала и его физиологическая роль [Миронова и др., 1996 (I, И); Paucek et al., 1992; Inoue et al., 1991; Garlid et al., 1997; Mironova et al., 1999; 2004]. Интерес к исследованию этого канала в последнее время возрос, поскольку было показано, что он, а именно его активация, играет ключевую роль в защите миокарда при ишемии [Grover et al., 1992; Garlid et al., 1997; Vanden Hoek, 2000]. Найден целый ряд синтетических активаторов митоКдтф, являющихся потенциальными кардиопротекторами [Gross et al., 1992; Liu et al., 1998; Sato et al., 1998; Tsai et al., 2002]. Недавно в лаборатории проф. Мироновой был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоКдтф - уридин-5'-дифосфат (УДФ) [Mironova et al., 2004; Негода А.Е., 2004]. Метаболические активаторы канала имеют ряд преимуществ, по сравнению с их синтетическими аналогами, поскольку их концентрацию в клетке можно регулировать и они не обладают отрицательными побочными эффектами. Действие УДФ, как активатора К+-канала, и, следовательно, кардиопротектора, до настоящего времени не было изучено на животных.
Помимо важной роли митоКдтф в защите миокарда от ишемических повреждений, некоторые исследователи предполагают участие активации канала в
формировании устойчивости организма к кислородному голоданию [Zhu et al., 2003]. Однако прямые доказательства участия канала в адаптации к гипоксии до настоящего времени не получены, то есть, данный феномен также требует дополнительных исследований.
Настоящая работа посвящена поиску новых путей кардиопротекции, так как, несмотря на большие усилия, направленнные на лечение сердечнососудистых заболеваний, они все еще являются одной из первых причин смертности в мире. Таким образом, актуальность поиска новых подходов к предупреждению и лечению этих заболеваний не вызывает сомнений. В настоящее время большинство исследователей считает, что конечным эффектором кардиопротекции, вызванной прекондицией, является митоКдтф [Yellon et al., 1998; Петрищев и др., 2001]. Как уже упоминалось выше, физиологическая роль и параметры функционирования митоКдтф достаточно хорошо изучены, однако, его структурная организация до сих пор остается неизвестной. Изучение структуры митоКдтф позволит исследовать функцию и регуляцию канала на молекулярном уровне.
В связи с этим, целью данной работы было: изучить кардиопротекторное действие предшественников УДФ при ишемии миокарда, а также исследовать параметры функционирования митоКдтф У животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию , а также выяснить структурную организацию митоКдтф.
Таким образом, в работе были поставлены следующие задачи:
1) Изучить кардиопротекторное антиишемическое и антиаритмическое
действие специфического активатора митоКдтф уридиндифосфата на модели острого инфаркта миокарда у крыс.
Исследовать параметры функционирования митоКдтф У крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у животных, адаптированных к недостатку кислорода.
получить специфические поликлональные антитела на белок-канал с м.м. 55 кДа, формирующий при встраивании в искусственные мембраны АТФ-ингибируемые К+ каналы;
Определить гомологию структуры исследуемого белка с м.м. 55 кДа аминокислотным последовательностям известных белков.
Провести ингибиторный анализ АТФ-чувствительного транспорта калия в нативных MX с использованием полученных антител (AT) с целью доказательства принадлежности белка с м.м. 55 кДа к системе АТФ-зависимого транспорта К+ в MX.
Новизна исследования. В данной работе впервые изучено антиишемическое и антиаритмическое кардиопротекторное действие веществ уридинового ряда -природных активаторов митоКдтф, на модели инфаркта миокарда. Впервые также исследовались параметры функционирования митоКдтф у крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также изучалась роль канала в формировании адаптации к кислородному голоданию у животных. Проведено сравнение гомологии структуры митоКдтф с аминокислотной последовательностью известных белков.
Научно-практическое значение работы. Представленная работа имеет научно-практическое значение, поскольку в работе обнаружено, что метаболический активатор митоКдтф обладает выраженными анти-ишемическим и антиаритмическим свойством, то есть играет существенную роль в защите миокарда от ишемических повреждений. Результаты проведенных в работе исследований открывают перспективу разработки нового подхода к предотвращению и лечению инфаркта миокарда и различного рода аритмий с использованием предшественников природного активатора митоКдтф, УДФ-
Изучение роли активации митоКдтф при тренировке животных к кислородной недостаточности позволит в дальнейшем разработать пути повышения жизнеспособности организма в условиях гипоксии.
Обзор литературы
